全 文 ：第 6 卷 第 3 期
1 9 9 3 年 6 月
林业 科 学研 究
FO R E ST R E S E A R CH
V o l
.
6
,
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。
3
Ju n
. , 1 9 9 3
杨树无 性 系抗 灰斑病
离体培养的早期选择 *
苏晓华 张绮纹 曾大鹏 张祝山 邢亚杰
摘要 用 田间感病 、 中度感病和抗病的10 个杨树无性系为材料进行离体培养 , 在培养皿中将
杨树灰斑病病菌接种在小叶上 。 结果表明 : 这些无性系对接种的病菌是敏感的, 无性系间在抗病
性上差异较大 , 并且感病程度与田间观测结果 基本一致。 田间抗病的 1 、 2 和 3 号组培苗经接种
后均未发病 , 病菌菌丝也未侵入组织内部 ; 中度感病的 5 、 6 号组培苗接种后出现少量黄褐色斑
点 , 而重度感病的 7 、 8 、 , 和 10 号组培苗接种点产生了褐色坏死斑 , 幼苗枯黄 。 但也有例外 ,
4 号虽然在大田中度感病 , 组培苗接种后却未发病 。
关位词 杨树 、 离体培养 、 杨树灰斑病 、 早期选择
杨树灰斑病 (C 01 9 。eu m p即ul in uo B res 。 )是发生在杨树 (小苗到大树 )上的一种主要叶部
病害 。 尤以幼苗 、 幼树被害严重 。 分布于我国河北 、 辽宁 、 吉林和黑龙江等省 。 该病能使叶
片提早脱落 , 嫩梢枯死 , 或造成多顶苗 。 据调查 , 该病在东北三省发病率较高 , 如哈尔滨市植
物园 8 年生小青杨 (Pop ul: 5 p se u d o 一 s im o n fi K ita g . ) 发病率为 1 0 0 % , 病情指数为6 1 。 3 年
生小叶杨 (P . : 流。瓜1 Car r . ) 发病率与病情指数分别为 1 0 %和 8 9[ ’〕。 当前 , 鉴定杨树对灰
斑病抗性的一般力法是在大田进行 , 至少要经 Z a 以上才能得到较为可靠的结果 。 为了缩短
抗病品种选择时间 , 节约投资和试验占地 , 有必要探索新的可行性为法 , 以便能通过较少的
幼苗进行早期抗性检验 。
目前世界上进行抗性早期选择较新的力法是借助于离体培养手段 。 利用此为法对细菌性
病原菌抗性选择报道较多[z, “〕, 但有关真菌性病原菌抗性报道非常少 , 尤其是真 菌性灰斑病
国内外尚未有过报道 。 为了探讨真菌性病原菌抗性早期选 择 , 在离体培养条件下对组培植株
进行接种 , 研究不同杨树无性系对灰斑病的抗性 , 以便为杨树抗病测定和抗病育种提供早期
鉴定依据 。
1 材料和方法
1
.
1 试验材料
辽宁省锦县是杨树灰斑病高发区, 1 9 9 1年 , 在该地区大凌河林场苗圃做了杨树不同无性系
19 9 2一1 1一2 3 收稿。
苏晓华助理研究员 , 张绮纹 , 曾大鹅 (中国林业科学研究院林业研究所 北京 1 0 0 0 9 1 ) , 张祝 山 邢亚杰(江宁省锦县
大凌河林 场)。
* 本项研究为国际粮农组织(FA O )援助中 国0 09 项目研究内容之一 。
承蒙意大利杨树研究所Pro f . A r u . G . M . (阿鲁先 生 )及中国林业科 学研究院林静芳先生指教 , 谨此致谢 。
喘一林 业 科 学 研 究
田 间灰斑病发病测试 。 根据测试结果选择了重感 、 中感和抗病三种类型的 l。个无性系作为试
验材料 (表 1 ) 。
衰 1 杨树灰斑脚田间润奋给果
编 号 无 性
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尸 . c “ r . ‘N 2 1 3 6 ’
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尸 . d el . d . ‘ Lu x ’ x (尸 .
锦县 小钻
鞍山小钻
白城小钻 74 0 2
法库 1 号
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发 病 率 (% ) 发 病 指 数
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3 0 1 0
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.
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.
0
5 0 1 2
.
5
4 5 1 1
.
0
8 0 3 2
.
0
10 0 3 9
.
0
1”2年春 , 将表 1 中10 个无性系在中国林科院苗圃进行扦插 , 把发病前抽出的新梢作为
离体培养的外植体材料 。
1. 2 试脸方法
1
.
2
.
1 无菌苗的培养 采 ;IJ组培为法培养无菌苗 。 将从中国林科院苗圃采来 的新梢用洗洁
精洗净 , 自来水冲洗后 , 用。. 1纬H g cl : 溶液快速冲洗两次 , 用重蒸馏水洗净 , 在 70 %乙醇溶
液中浸 2 一 3 m in , 后置于 0 . 1% H g cl Z 溶液中 10 ~ 13 m in , 用无菌水漂洗 3 次 。 将一部分
嫩梢消毒后 , 在叫l朵丁酸 (IB A )50 p p m 溶液中浸沾一下 , 用刀将茎段切成 1 . 5 c m 长带芽小段
置于 M S 培养基中培养 。 待小苗长出 2 片叶子 , 转移到生根培养基 中培 养 。 生根培养基 :
M S + N A A o
.
0 2 m g / L + 蔗糖2 5 9 / L + 琼脂 6 9 / L 。 光照培养每天 1 6 h , 培养温度 2 5 ~ 2 5 ℃ 。
1
.
2
.
2 病原菌的培养 杨树灰斑病由小钻杨 (p . 5 1二o n ii x p . p , , a 二fd a lis ) 上分离所得 。
经纯化 , 在马铃薯蔗糖琼脂培养基上培养1 0 d , 产生分生抱子备用。
1
.
2
.
3 病菌接种方法 选各无性系生长平展的叶片用微滴管在叶片主脉 两 侧各 滴一滴病菌
袍子悬浮液 (抱子浓度为 2 x 1 0’ 个/ m l) 。 密封培养皿 , 放入培养箱中培养 , 温度为 28 ℃ ,
湿度保持在 95 % 以上 。 3 6 d 后再移入人工气象器 (LH 一2 。。二R dc R D CT ) 中培养 。 每一无性
系人工接种10 株组培苗 , 另外 5 株苗滴加无菌水作为对照 。
2 试验结果
利用光学显微镜和扫描电镜观察 10 个无性系组培苗人工接种灰斑病病菌 , 其结果与田间
自然发病基本一玫 。 经观察 , 这些无性系可以被成功地接上 病菌 (见图版 I 一 1 ) 。 接种一周
后 , 将培养皿中接病菌的叶片取 出 , 采用徒手切片法在光学显微镜下观测叶表面和横切面病
菌侵染情况 , 发现 8 号鞍山小钻和 10 号法库 1 号均有菌丝从气孔处侵入 , 其它无性系没有出
现 。 3 周后取样用扫描 电镜继续观察 , 除 1 号、 2 号 、 3 号和 4 号外 , 其它无性系均有菌丝
进入组织内部 (见图版 I 一 2 ~ 4 ) 。 5 周后打开培养皿将接种叶片冲洗净 , 在光学 显微镜 下
观察接种点并进行评价 : 对照无病症 ; 1 号帝国杨 、 2 号 N 2 1 3 6杨 、 3 号N 3 0 1 6杨和 4 号74
3 期 苏晓华等 : 杨树无性系抗灰斑病离体培养的早期选择
杨没有症状 ; 5 号 1 09 杨和 6 号杂种杨均出现少量黄褐色斑点 ; 而 7 号锦县小钻 、 8 号鞍山小
钻 、 9 号白城小钻和 10 号法库 1 号均 出现锈褐色坏死大斑点 。
通过不 同接种时间 (l 。月 6 日、 10 月31 日 )、 不同接种浓度 ( 2 X 10 4 个 / m l、 2 x l护个/
m l) 及不同保湿度 (80 %左右 、 95 %左右 )的对比试验得出 : 前两者均无明显的差异 , 而后者
差异明显 。 湿度如低于 90 %根本不发病。 德国 K ec hel , H . G . 冈 等在培养皿中用细菌性黑
斑病菌 (X a 7: tho 优。, za : p o p 二If)在杨树 4 个标准无住系 , 即 P 。 b : aba n 云ic a 和 P 。 jo l n d o : j (黑杨
派 ) , p . 。ol u m bi a R 汁er 和 p . 2 5 / 6 3( 19 ) (青杨派 )上接种也曾得出 , 接种六周后不 同接种
时期之间根本没有可评价的差别 。 使用不同浓度的细菌悬浮液同样没有明显的差别 , 两者的
不同组合也根本没有导致可确切的反应偏离 。
针对外植体茎段在培养室内因光照时间不足导致其休眠 , 即茎段抽出新稍及生根后很快
封顶 , 叶片黄化并脱落等 , 采用呵噪丁酸 (IB A )处理外植体 , 其抽梢和生根都快于未处理的
茎段 , 加快了无菌苗的繁殖过程 。
3 讨 论
(l ) 试验结果说明 , 在供试的10 个无性系中 , 田间表现抗病的 1 、 2 、 3 号杨组培苗 ,
经接种均未发病 , 病菌菌丝也未侵入组织内部 。 表现中度感病的 5 、 6 号杨 , 其组培苗经接种
后出现少量黄褐色斑点 。 表现重度感病的 7 、 8 、 9 、 10 号杨组培苗的接种点产生了褐色坏
死斑 , 甚至幼苗枯黄 。 这表明 , 用组培苗人工接种的为法取得了与田 间病情调查基本一致的
结果 。 证明了利用离体培养方法对杨树灰斑病进行抗性早期测定是可行的 。 但也有例外 , 4
号7 4杨中度感病 , 但组培苗接种后却未发病 。
(2) 开展这项试验时间较短 , 仅测定了10 个无性系 , 所以这种早期检验的结论尚需进一
步的研究验证 。 假如这种早期检验适用性得到确认 , 那么人们只要在实验室控制条件下 , 用
较少的时间就可进行对杨树灰斑病抗性的早期选择 。 这将使杨树良种很快地得以推广 。
(3) 在杨树微繁中 , 以往用外植体叶片或茎段经愈伤分化再产生无菌苗 , 培养时 间长 。
而采用 IB A 处 理 外植体带芽茎段 , 可促进抽梢和 生 根 , 直接形 成 无 菌 苗 。 Ser r es , R.
等 [6 ]对美国栗 (c as t o ne a d en tat 。) 幼苗也曾用生长素 (IB A )处理 , 促进生长 , 也看到这种处
理能提高植物微繁效果 , 并有益于挑选出大量抗病植株 。
参 考 文 献
朝国柱 . 杨树灰斑病 . 见 : 中国林业科学研究院编著 . 中国森林病害 . 北京 : 中国林业出版 社 , 1 984 , 60 ~ 61 .
M e z e n t se v a 0 Y
.
U s e o f tis s u e a n d e e ll e u ltu r e s in b r e e d in g fo r r e s ista n e e to p h y to p a th o ge n s
.
Se le k t siy a i 1 S e m e n o v o d stv o
,
1 , , 0
,
5 9一6 2 .
Ja ns se n A
. 利用组培法早期测定各杨树无性系对细菌性花 叶病的抗性 . Me ti n g of th e IU FR O w or ki n g
Pa r ty
,
H a n n
.
M u n d e n
,
1 9 5 ,
,
1 7 6一2 5 4 . 国外林业文摘 , 2 09 0 , (4 ) : 5 6 .
K e e he l H G
,
B o d e n E
.
Fr u h d ia g n o se V o n R e s iste n z e ig e n s e h a fte n M it l
一
iilfe d e r G e w e b e k u ltu r
.
A 11
.
F o re s t名e its e h , 1 9 8 8 , (4。): 1 3 5 1一 13 5 4 .
So r r o s R
,
R e a d l
, ,
H a e k o tt W
.
R o o tin g o f A m e ri e a n e ll o s tli u t 五Ii e r u tin g s . Jo u r n a l o f E n v ir o -
n m e n t a l H o r tie u ltu re
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32 0 林 业 科 学 研 究 6 卷
E a r l夕 S e l。e tio n o f P o Pla r C lo n e s R e s is ta o t to
C o r夕n e u m P o Pu lin u m fn 犷irr o C u ltu r ‘
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Z h a n g Z h u sha n X in g Y ajie
A b 一tr ae t T o e x P lo r e the e a r ly s e le e t io n m e th o d fo r Po Pla r s to r e s is t th e
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c u lt u r e d Po p la r e lo n e s w e r e s e le c te d fo r in o e u la t io n
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S u X i a o h u a
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F o r e s t r y
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L i a o n i n g Pr o v i n e e )
.
苏晓华等 : 杨树无性系抗灰斑病离体培养早期选择的研究 图版 I
1
.
6 号杨最初接菌情况 ,
2
.
1 号杨接菌 3 周后横切面 , 无菌丝穿入 ,
3
.
4 、 9 号杨接菌 3 周后 横切面 , 有菌丝穿入。