全 文 ：第 50 卷 第 4 期
2 0 1 4 年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 4
Apr．，2 0 1 4
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20140410
收稿日期: 2013 － 04 － 07; 修回日期: 2014 － 03 － 03。
基金项目: 国家林业公益性行业科研专项“2008 气候变化对林业生物灾害影响及适应对策”(200804023)。
* 曹支敏为通讯作者。
杨树水泡型溃疡病菌培养性状、无性型与
分子系统学分析*
梁超琼 曹支敏 陈 敏 周 雪
(西北农林科技大学林学院 杨凌 712100)
摘 要: 对采自陕西、甘肃等地的杨树水泡型溃疡病菌培养特征、无性型形态等进行观察鉴定，并利用真菌通用
引物 ITS1 / ITS4，EF1-728F /EF1-986Ｒ 和 Bt2a /Bt2b 对供试菌系的 rDNA 内部转录间隔区 ITS 序列、β － 微管蛋白序
列和转录延伸因子 EF-1α 基因序列分别进行 PCＲ 扩增与测序，比对分析后构建系统发育树。结果表明: 供试 62
个溃疡病菌菌系可按培养特征划分为 2 个菌落类群: 类群Ⅰ为典型喷泉状菌落，类群Ⅱ为平伏状菌落。依据该病
菌培养物所产生的分生孢子形态特征，该菌系被鉴定为七叶树壳梭孢，即葡萄座腔菌的无性型。同时，供试菌系在
rDNA-ITS 基因、β-tubulin 基因和 EF-1α 基因序列的 NJ 系统发育树中分别被分为 2、3 和 3 个类群。在构建的 3 个
NJ 系统发育树中，包含绝大多数参试菌系的类群Ⅰ均与 GenBank 上报道的 B． dothidea 聚在一起，证实形态学分类
鉴定结果正确; 来自宝鸡陇县的菌系 Fldh1 在 rDNA-ITS 系统树中独立成群; 来自陕西杨凌区的菌系 Fyxn，Fyrg 和
Fyxj在 β-tubulin 及 EF-1α 基因序列系统树中均聚为一类; 在 EF-1α 基因序列构建的系统树中，采自陕西咸阳的
Fxfh，Fxdh1 和 Fxdh2 3 菌系被聚为一支，并显示与 B． dothidea 种内其他地域菌系亲缘关系较远。总体来看，供试
菌系在培养性状、产孢情况等方面的差异与其分子系统发育不存在一一对应关系。
关键词: 杨树; 葡萄座腔菌科; 壳梭孢属; ITS; β-tubulin; EF-1α; 系统学
中图分类号: S763. 15 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)04 － 0066 － 10
Cultural Characteristics，Anamorph and DNA Phylogeny of Botryosphaeria dothidea
Causing Poplar Canker
Liang Chaoqiong Cao Zhimin Chen Min Zhou Xue
(College of Forestry，Northwest A＆F University Yangling 712100)
Abstract: The cultural characteristics and anamorph morphology of poplar canker fungus isolates collecting from
Shaanxi and Gansu were observed，the rDNA-ITS，β-tubulin and EF-1α gene sequences of these fungal isolates were
sequenced using universal primer ITS1 / ITS4， EF1-728F / EF1-986Ｒ and Bt2a / Bt2b respectively， and the
phylogenetic trees were constructed after sequence alignment． The results showed that the 62 isolates could be divided into
two colonial groups based on the cultural characteristics on PDA medium: groupⅠ showed typical fountain colony，group
Ⅱ showed flat colony． Acconding to characteristics of conidium and culture，these isolates are identified as Fusicoccum
aesculi，that is anamorph of Botryosphaeria dothidea． Meanwhile tested isolates were clustered into two，three and three
groups based on neighbor-joining (NJ) analysis of the rDNA-ITS，β-tubulin and EF-1α gene sequence data respectively．
The isolates of groupⅠ in three NJ trees，included most tested isolates，were clustered together with B． dothidea retrieved
from GenBank，which confirmed the morphological identification of these isolates; the isolate Fldh1 from Long county was
classified as one group in the rDNA-ITS gene phylogenetic trees; the isolates Fyxn，Fyrg and Fyxj from Yangling of
Shaanxi were all classified as one separate group in the β-tubulin and EF-1α gene phylogenetic trees; three isolates Fxfh，
Fxdh1 and Fxdh2 from Xianyang of Shaanxi were classified as group Ⅲ in the EF-1α gene phylogenetic trees，displaying
far away phylogenetic relationship from other isolates of B． dothidea． Overall there was no one-to-one relationship among
cultural characteristics，sporulation and molecular phylogeny of the tested isolates．
Key words: poplar; Botryosphaeriaceae; Fusicoccum; ITS; β-tubulin; EF-1α; systematic
第 4 期 梁超琼等: 杨树水泡型溃疡病菌培养性状、无性型与分子系统学分析
杨树(Populus)是一种适应性强、分布极广的树
种，为我国北方栽植面积最大的速生用材林树种，具
有重要的生态和经济价值。随着杨树人工林的大面
积的发展，杨树病虫害大量产生，其中，水泡型溃疡
病是杨树重要的枝干病害，常导致杨树幼树枯死并
限制成树的生长，严重影响杨树人工林的培育，一定
程度上制约着我国林业及生态环境建设的稳定发
展。杨树水泡型溃疡病由子囊菌门 (Ascomycota)、
葡萄座腔菌目 ( Botryosphaeriales) 的葡萄座腔菌
( Botryosphaeria dothidea ) 侵染所致 (张星耀等，
2003; Grasso et al．，2010)，该真菌寄主范围广泛，可
引起包括杨树在内的多种林木溃疡、枝枯、流胶和果
腐等病害(吴小芹等，2001)。
葡萄座腔菌在自然条件下多以无性型出现在杨
树等寄主上，但葡萄座腔菌属无性型复杂多样，如
Dothiorella，Diplodia 和 Fusicoccum 等(Denman et al．，
2000)。关于葡萄座腔菌的无性型类型仍存在争议
(张星耀等，1999; 2000; 王金利等，2007; 余仲东
等，2010; Slippers et al．，2004; Kirk et al．，2008)，
该病菌的无性型存在着生理与致病性变异(刘会香
等，1997; 张星耀等，2008)。因此，深入开展杨树
水泡型溃疡病病原菌系统学及其致病性分化研究，
具有重要的理论与实践意义。
目前，国内外学者对于 Botryosphaeriaceae 真菌
分类研究除仍主要依据此类真菌有性型、无性型形
态学特征外，更多是采用多种分子系统学研究方法。
这些技术包括 SSＲ，ISSＲ，ＲAPD，ＲFLP 和 AFLP 等
多种分子标记(王金利等，2003; 2007; 余仲东等，
2000; 2004; 张星耀等，1999; 2000)。多个研究都
采用 rDNA 的保守区域 (如 ITS，LSU，18S rDNA，
28S rDNA基因等)、β －微管蛋白和 EF-1a 基因序列
对树木溃疡病病原菌进行鉴定并分析其系统发育关
系(余仲东等，2010; Slippers et al．，2004; Phillips
et al．，2005; Crous et al．，2006)。
本研究首次对发生在陕西、甘肃等地的杨树水
泡型溃疡病菌进行调查分析，在形态学鉴定的基础
上，利用 rDNA-ITS 序列、β －微管蛋白基因和EF-1α
基因序列分析不同地域菌系间的系统发育关系，以
期为西北地区杨树溃疡病菌分子系统及其地理分化
提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
2011 年 5 月—2012 年 10 月分别在陕西省西安
市、宝鸡市、榆林市、汉中市和甘肃省天水市等地设
立调查、采集点，随机抽样法采集各杨树品种具有典
型水泡型溃疡病症状的树皮组织，按常规方法分离、
纯化并保存菌种，选取其中 56 个杨树水泡型溃疡病
菌菌系及西北农林科技大学森林病理实验室 2009
年保存 6 个杨树水泡型溃疡病菌菌系，共计 62 株作
为本研究试验菌系(表 1)。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 菌系培养与无性型鉴定 将 62 个菌系接种
到 PDA 培养基(马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉
16 g，水 1 000 mL)上，置于 27 ℃恒温培养箱中黑暗
培养，观察并比较菌落形态、颜色变化、气生菌丝表
面特 征 及 产 孢 情 况 等，在 Olympus 显 微 镜
(CX31ＲTSF，配 DP-25 数码相机)下不同视野中随
机挑选 50 个分生孢子测量其大小并进行显微照相。
依据各菌系在 PDA 培养基上的形态特征、分生孢子
个体发育类型和分生孢子形态与大小鉴定各菌系培
养物无性型的分类地位 (向玉英等，1981; 邵力平
等，1984; 钟兆 康，1985; 杨 旺，1996; Sutton，
1980; Slippers et al．，2004)。
1. 2. 2 菌丝体收集 将经过无性型形态鉴定后的
62 个菌系活化于 PDA 培养基上，27 ℃黑暗培养 5
天。用直径 5 mm 的打孔器沿菌落边缘打取 7 块菌
饼，置入马铃薯葡萄糖液体培养基( PDB，马铃薯
200 g，葡 萄 糖 20 g，水 1 000 mL ) 中，27 ℃、
120 r·min － 1震荡培养 5. 5 天后收集菌丝团，用无菌
水冲洗 3 次，无菌滤纸吸干水分，再用无菌滤纸包裹
收集到的菌丝，置 40 ℃烘箱中烘干，－ 20 ℃保存
备用。
1. 2. 3 DNA 提取 称取冷冻干燥菌丝约 0. 06 g 放
入无菌研钵中，迅速加入适量液氮用研磨棒研磨至
粉末状后转入 2 mL 离心管中。真菌基因组 DNA 提
取采用 CTAB 法，参照张颖慧等 (2008)、孙立夫等
(2009)、姜自如等(2012)方法并做相应改进。模板
DNA 检测采用琼脂糖凝胶电泳法。
1. 2. 4 PCＲ 扩增和测序 采用通用引物 ITS1
(5 ＞ TCCGTAGGTGAACCTGCGG ＜ 3 )， ITS4
(5 ＞ TCCTCCGCTTATTGATATGC ＜ 3 ) ( White
et al．，1990 ) 对 核 糖 体 内 部 转 录 间 隔 区
ITS1-5. 8 S-ITS4 序 列 进 行 扩 增。扩 增 体 系 为
25 μL，包 括 DNA 模 板 1μL，ITS1 1μL，ITS4
1 μL，2 × Tap Master Mix 7. 5 μL， ddH2 O
14. 5μL。PCＲ 反应程序为: 94 ℃预变性 2 min，
55 ℃停留 40 s; 93 ℃变性 1 min，51℃退火 30 s，
72 ℃延伸 1 min 30 s，共 35 个循环; 72 ℃再延伸
10 min，4 ℃ 终 止 反 应 保 存。分 别 用 引 物
76
林 业 科 学 50 卷
表 1 试验菌系种类、分生孢子大小、寄主及其采集地①
Tab． 1 Species，conidial size，poplar host and collection locations of tested isolates
菌系
Isolate
分生孢子大小(长 ×宽)
Conidial size ( length × breadth) /μm
寄主
Host
采集地
Location
Fxdh1
Fxdh2
Fxfh
Fyxn
Fyrg
Fyxj
Ffjz
Fbky1
Fbky2
Flnh
Fldh1
Fldh2
Fldh3
Ffsl
Fzwh1
Fzwh2
Fzwh3
Fzwh4
Fzwh5
Fzwh6
Fnxh
Fnbl1
Fnbl2
Fhxm1
(13. 50 ～ 21. 25) × (4. 25 ～ 7. 50) 美洲黑杨 Populus deltoides 咸阳东河 Donghe，Xianyang
(15. 00 ～ 25. 00) × (3. 75 ～ 6. 25) 107 杨 P． × euramericana cv． ‘Neva’ 咸阳东河 Donghe，Xianyang
(13. 75 ～ 25. 00) × (4. 25 ～ 7. 00) 毛白杨 P． tomentosa 咸阳市区 Xianyang urban area
(17. 50 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 杨凌城区 Yangling urban area
(12. 50 ～ 20. 00) × (4. 50 ～ 6. 00) 毛白杨 P． tomentosa 杨凌揉谷 Ｒougu，Yangling
(15. 00 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 12. 00) 青杨 P． cathayanna 杨凌揉谷 Ｒougu，Yangling
(17. 50 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 新疆杨 P． bolleana 扶风绛帐 Jiangzhang，Fufeng
(15. 00 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 宝鸡市区 Baoji urban area
(12. 50 ～ 22. 50) × (7. 50 ～ 5. 00) 毛白杨 P． tomentosa 宝鸡市区 Baoji urban area
(12. 50 ～ 20. 00) × (4. 25 ～ 7. 50) 美洲黑杨 P． deltoides 陇县城区 Long county urban area
(15. 00 ～ 22. 50) × (4. 50 ～ 7. 50) 107 杨 P． × euramericana cv． ‘Neva’ 陇县城区 Long county urban area
(12. 50 ～ 22. 50) × (3. 50 ～ 6. 25) 新疆杨 P． bolleana 陇县城区 Long county urban area
(12. 50 ～ 22. 50) × (4. 75 ～ 5. 75) 新疆杨 P． bolleana 陇县城区 Long county urban area
(12. 50 ～ 25. 00) × (4. 50 ～ 7. 25) 毛白杨 P． tomentosa 凤县十里店 Shilidian，Feng county
(10. 50 ～ 18. 75) × (3. 25 ～ 7. 50) 欧洲黑杨 P． nigra 周至渭河林场 Weihe forest farm，Zhouzhi
(12. 50 ～ 21. 25) × (3. 50 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 周至渭河林场 Weihe forest farm，Zhouzhi
(15. 00 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 6. 25) 里普杨 P． × euramericana cv． ‘Lepizis’ 周至渭河林场 Weihe forest farm，Zhouzhi
(15. 00 ～ 20. 00) × (5. 00 ～ 6. 50) 84K 杨 P． alba × P． glandulosa 周至渭河林场 Weihe forest farm，Zhouzhi
(12. 50 ～ 22. 50) × (3. 75 ～ 7. 50) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 周至渭河林场 Weihe forest farm，Zhouzhi
(15. 00 ～ 22. 50) × (4. 75 ～ 6. 50) 107 杨 P． × euramericana cv． ‘Neva’ 周至渭河林场 Weihe forest farm，Zhouzhi
(17. 00 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 长安南五台 Nanwutai，Chang’an
(16. 25 ～ 26. 25) × (4. 50 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 长安南五台 Nanwutai，Chang’an
(13. 75 ～ 23. 75) × (4. 75 ～ 7. 50) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 长安南五台 Nanwutai，Chang’an
(15. 00 ～ 25. 00) × (4. 50 ～ 7. 50) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 户县西民路 Ximin road，Hu county
Fhxm2
Fhbm
Fhqh1
Fhqh2
Flxj
Flxh
Flxc
Fyhc
Fsxe
Fsdj
Fcsh
Fchj1
Fchj2
Fchg1
Fchg2
Fhlf
Fhfs
Fhyx
Fhhs
Ffzl1
Ffzl2
Ffnw
Fyyh
Fypa1
Fypa2
Fymp1
(15. 00 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 7. 50) 107 杨 P． × euramericana cv． ‘Neva’ 户县西民路 Ximin road，Hu county
(17. 50 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 6. 75) 107 杨 P． × euramericana cv． ‘Neva’ 户县白庙乡 Baimiao，Hu county
(13. 75 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 新疆杨 P． bolleana 户县南千户 Nanqianhu，Hu county
(17. 50 ～ 26. 25) × (5. 00 ～ 6. 50) 毛白杨 P． tomentosa 户县南千户 Nanqianhu，Hu county
(12. 75 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 10. 00) 毛白杨 P． tomentosa 蓝田席家河 Xijiahe，Lantian
(12. 50 ～ 25. 00) × (4. 50 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 蓝田洩湖镇 Xiehu，Lantian
(12. 50 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 8. 00) 毛白杨 P． tomentosa 蓝田县新街村 Xinjie，Lantian
(15. 00 ～ 22. 50) × (4. 50 ～ 5. 75) 新疆杨 P． bolleana 榆林火车站 Yulin railway station
(15. 00 ～ 27. 50) × (5. 00 ～ 6. 25) 毛白杨 P． tomentosa 商洛仙鹅湖 Xian’e lake，Shangluo
(13. 75 ～ 22. 50) × (4. 50 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 商洛市区 Shangluo urban area
(13. 75 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 7. 50) 南抗杨 P． deltoides cv． ‘Nankang’ 城固沙河营 Shaheying，Chenggu
(12. 00 ～ 22. 50) × (4. 50 ～ 7. 50) 南抗杨 P． deltoides cv． ‘Nankang’ 城固汉江大桥 Hanjiang bridge，Chenggu
(12. 50 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 城固汉江大桥 Hanjiang bridge，Chenggu
(13. 75 ～ 20. 00) × (4. 75 ～ 6. 25) 毛白杨 P． tomentosa 城固黄岗 Huanggang，Chenggu
(11. 25 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 河北杨 P． hopeiensis 城固黄岗 Huanggang，Chenggu
(13. 75 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 7. 50) 107 杨 P． × euramericana cv． ‘Neva’ 华阴市区 Huayin urban area
(15. 00 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 6. 75) 毛白杨 P． tomentosa 华阴罗敷 Luofu，Huayin
(15. 00 ～ 28. 75) × (5. 00 ～ 7. 50) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 华阴岳西 Yuexi，Huayin
(15. 00 ～ 20. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 华阴华山 Hua mount，Huayin
(14. 50 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 新疆杨 P． bolleana 富平庄里 Zhuangli，Fuping
(15. 00 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 富平庄里 Zhuangli，Fuping
(15. 00 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 河北杨 P． hopeiensis 富平庄里 Zhuangli，Fuping
(12. 50 ～ 25. 00) × (4. 50 ～ 7. 50) 毛白杨 P． tomentosa 铜川市耀州区 Yaozhou urban area，Tongchuan
(12. 50 ～ 22. 50) × (4. 50 ～ 7. 50) 新疆杨 P． bolleana 铜川市耀州区 Yaozhou urban area，Tongchuan
(15. 00 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 铜川市耀州区 Yaozhou urban area，Tongchuan
(14. 50 ～ 20. 00) × (4. 50 ～ 5. 25) 波兰 15 号 P．× euramericana cv．‘Polska －15A’ 杨凌西林苗圃 Xilin nursery，Yangling
86
第 4 期 梁超琼等: 杨树水泡型溃疡病菌培养性状、无性型与分子系统学分析
续表 Continued
菌系
Isolate
分生孢子大小(长 ×宽)
Conidial size ( length × breadth) /μm
寄主
Host
采集地
Location
Fymp2
Fymp3
Fymp4
Fymp5
Ftqa
Fhzy
Ffhn
Fffz
Fwdl
Fhmx
Fzzn
Fhsz
(15. 00 ～ 22. 50) × (4. 75 ～ 6. 25) 108 杨 P． × euramericana cv．‘Guariento’ 杨凌西林苗圃 Xilin nursery，Yangling
(12. 50 ～ 25. 00) × (5. 00 ～ 7. 50) 中林美荷 P × euramericana cv．‘Zhonglinmeihe’ 杨凌西林苗圃 Xilin nursery，Yangling
(17. 50 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 7. 50) 中绥 12 号 P． deltoides × P． therstina P． nigra 杨凌西林苗圃 Xilin nursery，Yangling
(10. 00 ～ 17. 5) × (4. 50 ～ 6. 25) 陕林 3 号 P． deltoides × P． cathayana 杨凌西林苗圃 Xilin nursery，Yangling
(15. 00 ～ 25. 00) × (4. 25 ～ 7. 25) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 甘肃秦安 Qin’an yebu，Gansu
(12. 50 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 6. 50) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 韩城芝阳 Zhiyang，Hancheng
(11. 25 ～ 20. 00) × (3. 25 ～ 5. 50) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 凤县黄牛埔 Huangniupu，Feng county
(12. 50 ～ 20. 00) × (4. 75 ～ 5. 50) 毛白杨 P． tomentosa 凤县凤州 Fengzhou，Feng county
(12. 50 ～ 22. 50) × (5. 00 ～ 7. 25) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 大荔县城区 Dali county urban area
(14. 00 ～ 22. 50) × (4. 75 ～ 5. 75) 南抗杨 P． deltoides cv． ‘Nankang’ 勉县城区 Mian county urban area
(12. 50 ～ 20. 00) × (3. 75 ～ 6. 25) 107 杨 P． × euramericana cv．‘Neva’ 周至终南镇 Zhongnan，Zhouzhi
(12. 50 ～ 22. 50) × (4. 50 ～ 7. 50) 84K 杨 P． alba × P． glandulosa 户县尚庄 Shangzhuang，Hu county
①菌种根据菌系在 PDA 培养基上的形态特征、分生孢子特征及序列测定结果等鉴定。The fungal species identification was based on the
morphological characteristics，conidial shape of isolates on PDA medium and sequence determination． 无性型 ( anamorph)七叶树壳梭孢 Fusicoccum
aesculi，有性型( teleomorph)葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea。
Bt2a ( 5 ＞ GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC ＜ 3) /
Bt2b (5 ＞ ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGG C ＜ 3)
和 EF1-728F ( 5 ＞ CATCGAGAAGTTCGAGAAGG ＜
3) /EF1-986Ｒ(5 ＞ TACTTGAAGGAACCCTTACC ＜
3)对 β-tubulin 基因和 EF-1α基因序列进行扩增
(White et al．，1990; Glass et al．，1995; Carbone
et al．，1999)。扩增体系均为25 μL，包括 DNA 模板
1 μL，正反向引物各 1 μL，2 × Tap Master Mix 7 μL，
ddH2O 15 μL。 PCＲ 反应程序为: 94 ℃ 预变性
5 min; 94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸
1 min，共 35 个循环; 72 ℃再延伸7 min，4 ℃终止反
应保存(冯小慧等，2012)。操作均在冰上进行。
扩增产物置 4 ℃冰箱中保存。取 5 μL PCＲ 产
物样品，以 Marker DL2000 为分子质量标准，在 2%
琼脂糖凝胶中 100 V 稳压电泳约 45 min，EB 染色
15 min后观察电泳结果。所有 PCＲ 产物由上海生
物工程公司进行序列测定，测序引物与扩增引物
相同。
1. 2. 5 序列分析及系统发育树构建 将所有检测
序列提交 GenBank，经 Blast 同源性比较，根据比对
的期望值( expect values)、提交序列与参比序列的一
致度( identities)以及空位 ( gaps)综合判断每一个
Blast 结果后选择参比序列。从 GenBank 搜集到 18
条 Botryosphaeria spp． 基 因 序 列 作 为 参 比 序
列(表 2)。
将检测序列和参比序列以 FASTA 格式编辑成
为一个文本文档，用 Clustalx2 和 BioEdit 软件分别
校正比对 68 个 rDNA-ITS 序列、69 个 β － tubulin 基
因序列和 70 个 EF － 1α 基因序列，并将开始和末尾
处长短不同的序列剪切整齐，得到聚类的碱基序列
矩阵。用 Tajima-Nei 法检测序列中性突变的稳定
性。使 用 MEGA5. 05 软 件 中 的“Sequence Data
Explorer”分析构建系统树所使用序列的统计学特征
(赵嘉平，2007)，如序列的保守区、可变区等。分别
以 Fusarium solani，F． oxysporum 和 F． proliferatum 3
种镰刀菌作为 rDNA-ITS，β-tubulin 和 EF-1α 基因序
列的外类群(表 2)，采用 p-距离对 3 种基因序列进
行 NJ 聚类分析，以自展法 ( bootstrap)检测，重复
1 000次( Felsenstein，1985)，构建邻接树( neighbor-
joining tree)。
表 2 来自 GenBank 参比序列相关信息
Tab． 2 The information of reference sequences
from GenBank
真菌种名
Fungal species
寄主名称
Host species
登录号
Accession No．
Botryosphaeria dothidea 杨树 Populus spp． EU520229
B． dothidea 蓝莓 Vaccinium sp． JX524805
B． dothidea 核桃 Juglans regia JN809914
B． dothidea 葡萄 Vitis vinifera JF682849
B． dothidea 葡萄 V． vinifera JF441083
B． dothidea 葡萄 V． vinifera HQ392742
B． dothidea 鳄梨 Persea americana HQ529722
B． dothidea 鳄梨 P． americana HQ529720
B． dothidea 桃树 P． persica HQ660486
B． dothidea 桃树 P． persica HQ660483
B． dothidea 石榴 Punica granatum FJ358701
B． ribis 山龙眼科 Proteaceae AF452527
B． ribis 紫槭 Syzygium cordatum JF440836
B． ribis 茶藨子 Ｒibes sp． AY808170
B． ribis 桉树 Eucalyptus sp． DQ235142
B． parva 百合 Lilium lancifolium DQ499155
B． parva 巨桉 Eucalyptus grandis AY226848
B． parva 桉树 Eucalyptus sp． AY226850
Fusarium solani — GU170638
F． oxysporum 葫芦 Lagenaria siceraria JQ965486
F． proliferatum 鹰嘴豆 Cicer arietinum EU091072
96
林 业 科 学 50 卷
2 结果与分析
2. 1 供试菌系培养性状与无性型形态
杨树水泡型溃疡病菌在 PDA 培养基上生长 3
天时菌落呈污白色绒毛状，气生菌丝发达。培养第
4 天起出现浅墨绿色色素沉淀，呈散点状或环状分
布。多数菌系菌落在生长中后期(7 ～ 10 天)呈现灰
色、灰黑色至墨黑色，中央菌丝稠密、棉絮状，向上生
长呈喷泉状可达培养皿盖，菌丝层较厚，部分倒伏，
边缘菌丝灰色、较稀疏，呈辐射状生长。菌系 Fhbm
和 Fzwh3 生长中后期菌落呈平伏状，并有明显环状
色素沉淀。依据 27 ℃下 PDA 培养基上生长 8 天的
菌落特征将供试菌系划分为 2 个菌落类群: 类群Ⅰ
为典型喷泉状菌落，包括除菌系 Fhbm 和 Fzwh3 以
外的 60 个菌系，如菌系 Fbky2，Fhqh2 等; 类群Ⅱ为
平伏状菌落，包括菌系 Fhbm 和 Fzwh3(图 1)。
图 1 杨树水泡型溃疡病菌在 PDA 上的菌落形态特征
Fig． 1 Colonial characteristics of poplar blister canker’s pathogenic fungus isolates on PDA medium
菌落类群ⅠColonial groupⅠ: 菌系 Fbky2，Fhqh2 Isolates Fbky2，Fhqh2; 菌落类群Ⅱ Colonial groupⅡ: 菌系 Fhbm，Fzwh3 Isolates Fhbm，Fzwh3 ．
多数供试菌系在 PDA 培养基上培养 15 ～ 45 天
可产生分生孢子，全壁芽殖型( holoblastic)发育，无
色、单胞，纺锤形至不规则纺锤形(近棒状)，基部平
截或钝圆，细胞内含颗粒状物; 分生孢子大小为
(12. 5 ～ 25. 0) μm × (3. 5 ～ 7. 5) μm，菌系之间并
无显著差异 (表 1 )。此外，多数菌系 (如 Fbky2，
Fyxj，Fchj1 等)可同时产生无色、杆状的小分生孢子
(microconidia) (图 2 )。采自户县白庙乡的菌系
Fhbm 和杨凌菌系 Fyxn 在 PDA 上难以产生分生孢
子，经对这 2 个菌系采用划伤菌丝、近紫外光诱导等
处理方法使其在 PDA 上培养 20 天左右产生分生孢
子，且较大。
依据各菌系所产生的分生孢子个体发育及其形
态大 小，认 定 均 为 七 叶 树 壳 梭 孢 ( Fusicoccum
aesculi)，与 Slippers 等 (2004)及 Crous 等 (1999)所
描述的 Botryosphaeria dothidea 无性型形态相符合。
2. 2 rDNA-ITS，β-tubulin，EF-1α 基因 PCＲ 扩增
及序列测定与比对
供试 62 个杨树溃疡病菌菌系的 rDNA-ITS-PCＲ
产物直接测序长度为 514 ～ 560 bp，平均 GC 含量
54% ; β-tubulin 基因 PCＲ 产物直接测序长度为 417
～ 437 bp，平均 GC 含量 58% ; EF-1α 基因 PCＲ 产
物直接测序长度为 265 ～ 280 bp，平均 GC 含量
57%。将供试菌系的 rDNA-ITS，β-tubulin，EF-1α 基
因序列在 GenBank 数据库进行 Blast 同源比较，显示
所有试验菌系均为葡萄座腔菌，与其相似率在 97%
以上，该结果与形态学鉴定结果一致。
2. 3 DNA 序列矩阵的特征分析
对 供 试 菌 系 68 个 rDNA-ITS 序 列、69 个
β-tubulin序列和 70 个 EF-1α 序列进行多重比对分
析表明，在 rDNA-ITS 序列构成的碱基序列矩阵中，
包括空位在内共有 469 个碱基位点，其中保守位点
( conserved sites) 328 个，可变位点 ( variable sites)
119 个，简约信息位点( parsim-Info sites)31 个，单一
位点( singleton sites)88 个。β-tubulin 分析数据包括
空位在内共有 393 个碱基位点，其中保守位点 92
个，可变位点 282 个，简约信息位点 58 个，单一位点
224 个。EF-1α 分析数据包括空位在内共有 266 个
碱基位点，其中保守位点 90 个，可变位点 168 个，简
约信息位点 55 个，单一位点 102 个。
07
第 4 期 梁超琼等: 杨树水泡型溃疡病菌培养性状、无性型与分子系统学分析
图 2 杨树水泡型溃疡病菌分生孢子形态
Fig． 2 Conidium morphology of poplar blister canker’s pathogen isolates
分生孢子与小分生孢子 Conidia and microconidia: 菌系 Fbky2，Fxdh1，Fchj1，Fyrg 和 Fyxn isolates Fbky2，Fxdh1，
Fchj1，Fyxn and Fyrg; 分生孢子 Conidia: 菌系 Flxy，Fzwh3，Fxdh2 和 Fhbm Flxy，Fzwh3，Fxdh2 and Fhbm．
2. 4 rDNA-ITS，β － tubulin，EF － 1α 序列的聚类
分析
分析(表 3)显示，rDNA-ITS，β-tubulin 和 EF-1α
基因序列的 Tajima-Nei 检验值分别为 － 2. 764 298，
－ 2. 740 716 和 － 2. 423 210，核苷酸多样性值分别
为 0. 011 945，0. 035 355 和 0. 041 348，说明各种基
因序列无明显多样性，且进化稳定。 rDNA-ITS，β-
tubulin 和 EF-1α 序列系统发育树的分支长度值
( sum of branch lengths，SBL) 或进化距离依次为
0. 276 304 25，0. 891 805 17 和 0. 779 918 73。
表 3 各基因序列中性 Tajimas 检验①
Tab． 3 Tajimas neutrality test for multiple gene sequence
基因序列 Gene sequence m S ps Θ π D
rDNA-ITS 68 128 0. 286 996 0. 059 924 0. 011 945 － 2. 764 298
β-tubulin 69 293 0. 783 422 0. 163 075 0. 035 355 － 2. 740 716
EF-1α 70 152 0. 666 667 0. 138 354 0. 041 348 － 2. 423 210
① m:序列数 Number of sequences，S:分离位点 Number of segregating sites，ps:泊松系数 S /m，Θ:每个座位分离位点数 ps / a1，π:核苷酸多样
性 Nucleotide diversity，D:Tajima 检验值 The Tajima test statistic．
17
林 业 科 学 50 卷
聚类分析结果表明:供试菌系在基于 rDNA-ITS
序列的系统发育树(图 3)中可分为 2 个类群: Group
Ⅰ包括了 Fyxj，Fzzn，Fymp2，Fhzy，Fymp1，Fchj1，
Fsdj，Fzwh1，Fyyh，Fzwh5，Ftqa，Fypa2，Fhqh1，
Fymp5，Fnbl2，Fbky1，Ffhn，Fhhs，Fhyx，Ffzl1，Fypa1，
Fzwh2，Fzwh6，Fhfs，Flxc，Fchg2，Fhxm2，Fwdl，Fnxh，
Ffnw，Fcsh，Fhbm，Fhqh2，Fzwh4，Fchj2，Ffsl，Ffjz，
Fsxe，Fymp3，Fldh3，Flnh，Fhmx，Fldh2，Fchg1，Fyrg，
Fymp4，Flxh，Fnbl1，Fffz，Ffzl2，Fhsz，Fxfh，Flxj，
Fzwh3，Fbky2，Fhxm1，Fyhc，Fhlf，Fyxn，Fxdh1 和
Fxdh2 共 61 个 Fusicoccum aesculi 菌 系，均 与
GenBank 中报道的 3 条 Botryosphaeria dothidea 序列
聚在一起; 而来自宝鸡陇县的菌系 Fldh1 独立成
群。诸菌系与葡萄座腔菌属已知种 B． parva，
B． ribis关系明显较远。
β-tubulin 基因序列的聚类分析结果见图 4。参
试的 62 个菌系按照序列分析形成 3 个不同的分支
类群: GroupⅠ包括 Fsxe，Fyhc，Fhsz，Fchg1，Fhfs，
Ffhn，Fzwh1，Fhbm，Fsdj，Fldh2，Fymp4，Fzwh2，Fwdl，
Fyyh，Fhzy，Fhmx，Fhlf，Fymp5，Fzzn，Ffzl2，Fypa2，
Fnxh，Fhqh1，Ftqa，Fzwh6，Fypa1，Fnbl2，Fhxm2，Ffjz，
Fhxm1，Fzwh3，Fymp1，Fymp3，Ffnw，Fymp2，Fbky2，
Fchj2，Flxh，Fcsh，Flnh，Fchg2，Flxj，Fhqh2，Flxc，
Fxdh1，Fxdh2，Fhyx，Fffz，Fxfh，Ffzl1，Fhhs，Fbky1，
Fnbl1，Fldh1 和 Fzwh5 共 55 个菌系序列及来自
GenBank 中的 4 条 B． dothidea 序列; GroupⅡ包括
菌系 Fchj1，Ffsl，Fldh3 和 Fzwh4; GroupⅢ包括采自
杨凌的 Fyrg，Fyxj 和 Fyxn 3 个菌系。表明参试菌系
系统发育与 B． ribis 不同。
EF-1α 基因序列系统发育分析结果与 β-tubulin
基因序列分析大致相似 (图 5 )，将参试 62 个 F．
aesculi 菌系分为 3 个类群: GroupⅠ包括 Fhsz，Fnxh，
Fldh1，Fhqh2，Fbky2，Ffsl，Ffzl1，Fhxm1，Fzwh3，Fffz，
Fhmx，Fymp4，Fzzn，Fzwh6，Fhbm，Fzwh1，Ffnw，
Ffzl2，Fldh3，Ftqa，Fhhs，Fzwh2，Fnbl1，Fymp3，Fhfs，
Fsdj，Ffjz，Fchj1，Fchj2，Fchg1，Fchg2，Ffhn，Fzwh5，
Fnbl2，Fhzy，Fymp2，Fyyh，Fhyx，Fzwh4，Fymp5，
Fhxm2，Fldh2，Fcsh，Flnh，Flxh，Fypa1，Fyhc，Fypa2，
Fymp1，Fhqh1，Flxc，Fbky1，Fsxe，Fwdl，Fhlf，Flxj 共
56 个 菌 系 序 列 及 GenBank 中 报 道 的 4 条
B． dothidea序列; GroupⅡ包括来自杨凌的 Fyrg，
Fyxj 和 Fyxn 3 个菌系; GroupⅢ由咸阳的 Fxfh，
Fxdh1 和 Fxdh2 3 菌系组成，显示与 B． dothidea 种
内其他地域菌系亲缘关系较远。然而，所有参试菌
系与 B． parva，B． ribis 关系仍然明显较远。
从不同基因序列构建的 3 个 NJ 系统发育树中
可看出，采用 p-距离对 rDNA-ITS，β-tubulin，EF-1α
基因进行测度得到的聚类结果基本一致。3 个系统
发育树中的 GroupⅠ分别包括了 61，55 和 56 个供试
菌系，占供试菌系总数的比例分别为 98. 3%，
88. 7%和 90. 3%，另外，β-tubulin 系统树 GroupⅠ中
的 55 个菌系和 EF-1α 系统树 GroupⅠ中的 56 菌系
均聚在 rDNA-ITS 系统树 GroupⅠ中。来自杨凌的 3
个菌系 Fyrg，Fyxj 和 Fyxn 在β-tubulin，EF-1α 基因
序列构建的 NJ 树中均聚在一起，且独立成群，表明
Fusicoccum aesculi 种内菌系之间存在一定的遗传
分化。
3 讨论
Botryosphaeria dothidea 是一种能引起杨树等树
木溃疡病的重要葡萄座腔菌科真菌，长期以来国内
外对其无性型的分类存在很大争议。1979 年关于
我国杨树水泡型溃疡病的病原菌鉴定报道以后，首
次确认杨树水泡性溃疡病由真菌聚生小穴壳孢
Dothiorella gregaria 引起，其有性型为葡萄座腔菌
B． dothidea，同物异名为 B． ribis (向玉英等，1979;
Arx et al．，1954; Witcher et al．，1963)。由于该病菌
无性型较为常见，所以国内几乎所有的研究报道都
以 Dothiorella gregaria 作为病原菌 (景耀等，1987;
向玉英，1979; 向玉英等，1987; 杨旺，1996; 张星耀
等，1999; 2003 )。但 Sutton ( 1980 )，Pennycook 等
(1985)和王金利等(2007)认为 B． dothidea 的无性
型应为 Fusicoccum aesculi，而不是D． gregaria。因为
Dothiorella 属真菌可在分生孢子器内产生暗色、双
胞的分生孢子 ( Phillips et al．，2005; Crous et al．，
2006)。本研究根据供试菌系在 PDA 培养基上的形
态学特征、分生孢子特征并结合相关基因序列分析
结果，将引起陕西、甘肃等地的杨树水泡型溃疡病的
病原菌鉴定为七叶树壳梭孢 ( Fusicoccum aesculi)，
与有性型 B． dothidea 相对应，此鉴定与国内外学者
近年来的研究结果相符合。
本试验依据菌落特征将供试菌系划分为 2 个菌
落类群: 类群Ⅰ为典型喷泉状菌落，类群Ⅱ为平伏
状菌落。但从 rDNA-ITS，β-tubulin 和 EF-1α 基因序
列系统进化树分类来看，不同菌落特征菌系之间并
未表现明显差异。具有平伏状菌落特征的 Fhbm，
Fzwh3 2 菌系均与大多数典型喷泉状菌落特征的菌
系一起被聚在同一分子系统类群中(GroupⅠ)，显
示它们之间的亲缘关系很近，序列无差异。虽然培
养性状与分生孢子形态特征为该病原真菌分类鉴定
27
第 4 期 梁超琼等: 杨树水泡型溃疡病菌培养性状、无性型与分子系统学分析
图 3 62 个供试菌系 rDNA-ITS 基因序列的 p －距离 NJ 系统发育树(SBL = 0. 276 304 25)
Fig． 3 Phylogenetic tree generated by p-distance NJ analysis using the rDNA-ITS gene sequence data for 62 isolates
提供了基本依据，但试验菌系的培养性状易受培养
基成分、培养温度和培养时间等因素影响，不同菌系
之间、甚至同一菌系不同重复之间的形态特征都有
一定 差 异，仅 仅 依 靠 培 养 特 征 并 不 足 以 对
Botryosphaeria 属真菌做出符合其亲缘关系的分类
(赵嘉平等，2007)，因此需要用分子系统学方法来
验证形态学鉴定结果，此为 Botryosphaeria spp． 分类
学研究趋势(Slippers et al．，2004)。
本研究中杨树水泡型溃疡病菌诸菌系 3 个基因
位点的系统分析结果大致相似。所有供试菌系均与
GenBank 中报道的 Botryosphaeria dothidea 序列聚在
一起，而与 B． parva 和 B． ribis 亲缘关系远，该结果
37
林 业 科 学 50 卷
图 4 62 个供试菌系 β-tubulin 基因序列的 p-距离 NJ 系统发育树(SBL = 0. 891 805 17)
Fig． 4 Phylogenetic tree generated by p-distance NJ analysis using the β-tubulin gene sequence data for 62 isolates
证实本研究根据培养学特征对杨树水泡型溃疡病菌
种的鉴定结论是正确的。从 rDNA-ITS 序列系统发
育树来看，宝鸡陇县菌系 Fldh1 独立成群，与 B．
dothidea 种内其他地域菌系的亲缘关系明显较远，
但该菌系在 β-tubulin 和 EF-1α 系统树中均被划归
GroupⅠ中，且在培养性状和分生孢子形态特征上与
其他菌系并无差异。来自杨凌的 3 个菌系 Fyrg，
Fyxj 和 Fyxn 在 β-tubulin，EF-1α 基因序列构建的 NJ
树中均聚在一起，且独立成群; 咸阳的 Fxfh，Fxdh1
和 Fxdh2 3 菌系也在 EF-1α 基因序列系统树中独立
成群，表明 Fusicoccum aesculi 种内诸菌系间存在一
定的遗传分化。杨凌揉谷菌系 Fyrg 和户县白庙菌
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第 4 期 梁超琼等: 杨树水泡型溃疡病菌培养性状、无性型与分子系统学分析
图 5 62 个供试菌系 EF-1α 基因序列的 p-距离 NJ 系统发育树(SBL = 0. 779 918 73)
Fig． 5 Phylogenetic tree generated by p-distance NJ analysis using the EF － 1α gene sequence data for 62 isolates
系 Fhbm 的培养性状表现特殊，即在 PDA 培养基上
很难产生无性繁殖体; 接种证明周至菌系 Fzwh、凤
县菌系 Ffhn 及城固菌系 Fcsh 表现出较其他地域菌
系强的致病性。这些表明 F． aesculi 在陕西存在一
定的生理分化现象。但总的来看，供试菌系之间在
培养性状、分生孢子形态及致病性等方面的差异与
其分子系统发育类群分化并不存在明显对应关系，
其机制还需进一步研究。
参 考 文 献
冯小慧，张星耀，严东辉 ． 2012． 杨树溃疡病病原的多重 PCＲ 检测技
术 ． 林业科学，48 (5) : 73 － 77．
姜自如，张刚龙，曹支敏，等 ． 2012． 陕西省杨树溃疡病菌地理种群
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