全 文 ：第 !" 卷 第 ## 期
$ % # $ 年 ## 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
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收稿日期" $%## 4%" 4$!# 修回日期" $%#$ 4%6 4#5$
基金项目" 国家自然科学基金项目’9#%5%;5"( # 长江上游林业生态工程省级重点实验室资助项目$
!朱天辉为通讯作者$
杂交竹梢枯病菌毒素蛋白纯化及致病力!
李姝江#:朱天辉#!$
’#1四川农业大学林学院:雅安 \$;%#!# $1四川农业大学森林保护省级重点实验室:雅安 \$;%#!(
关键词" :梢枯病菌# 毒素# 蛋白# 致病活性# 杂交竹
中图分类号! &5\91#:::文献标识码! ,:::文章编号! #%%# 45!"""$%#$### 4%#!! 4%?4&’*’.%1’")"*1B,+"Z’.?&"1,’)*&"#.5%’5+,+*#$’"(&/$(5#*# %)5Y1(?%1B"C,)’.’12
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67(1&%.1" :+/BVE0/CBS
=>Q FSCIRSICB/O:*+>*0104;E>’$)9E$*;4;S/VA>FTQBC
0B=2BF=>Q STAHF/O=FTBCB
BVSC=RSBQ OC/DSAIDFI0O=SBECBRAEAS=SA/> =>Q E/0LBSBH0LR/0R/>RB>SC=SA/>3c>B
R/DE/FASA/> ’Y9 ( TAS< E=SAR=RSA2ASLT=F/NS=A>BQ NL&BE<=QBVK?#%% HB0RQ lFBE<=C/FBO=FSO0/T
=>A/> BVR<=>HBCBFA>3+RA>HCBFI0S/OY9FA=?=RAQFFBkIB>RB=SS=0B>Q T=F
J$*?,0=?K0>?&BC?.=0?YC/?+LC?K0L! T EC/SB=FBOC/D.’=054994(+0509
NLS *’7(3+ EC/SB=FB3+E=SARASLBVEBCADB>S/OY9 A>QAR=SBQ S<=SASR/I0Q R=IFBS! NISSCB=RSA/> T=FkIARPBCS<=> S<=S/OS ASFB0O3+=SA2BR/>RB>SC=SA/> T=F; 4#% (H+D-4# ! =>Q
SRB>SC=SA/>! SHBCSARASL3
8,2 9"&5(" : :*+>*0104; E>’$)9E$*;4;# S/VA># EC/SBA># E=SAR =RSA2ASL# .’;(49’ E$*6’*0’(0509 a
N$1/*)=’5’;)E9092*’1/09
: : 撑 a绿 杂 交 竹 ’ .’;(49’ E$*6’*0’(0509a
N$1/*)=’5’;)E9092*’1/09(梢枯病是长江中上游退耕
还林毁灭性病害之一!可造成严重的生态和经济损
失$ 由于该病是近年来四川栽培区新发现的病害!
相关研究较少!目前仅对该病的病原及发生规律
’朱天辉等! $%%6=()症状特点及空间格局’朱天辉
等! $%%6N(等方面做了一些研究$ 暗孢节菱孢菌
’:*+>*0104;E>’$)9E$*;4;(为撑 a绿杂交竹梢枯病
最主要的病原菌!有较强的致病性 ’朱天辉等!
$%%6=(!但其致病机制尚无研究$
毒素为植物病原菌借以侵袭寄主植物的主要力
量!是植物病理学的研究热点之一 ’J=S=$+’5B!
$%%$# 于莉等! $%%$# &IXIPA$+’5B! $%%9# 张利辉
等! $%%9# ,CBDI $+’5B! $%%!(!但病原真菌种类不
同!所产生的致病毒素也有差异!且具有各种独特的
化学结构及生理活性$ 迄今真菌能够产生具有致病
活性的毒素物质的报道较多’7/IC>A2=0$+’5B! #66!#
h=FDIFFB> $+’5B! $%%!# 杨斌等! $%%;# 朱天辉等!
$%%;# &H
$+’5B! $%%6 ()萜类化合物 ’h=S=>! $%#% ()生物碱
’JAH=FX$+’5B! $%%6(及还
原酮类’[B究较 为 突 出$ 此 外! 蛋 白 类 毒 素 如 ,E?S/VA>
’lI=LLID $+’5B! $%%9 () .Q?S/VA> ’Y=0DBC$+’5B!
$%%;()YSC+/V,’&=CD=$+’5B! $%%;()YSC+/V7’7BSF
$+’5B! $%##(的研究也有报道$ 暗孢节菱孢菌致杂
交竹梢枯病的症状特点表明其致病作用极可能与毒
素有关’朱天辉等! $%%6N(!但为何种活性物质尚未
见证实$ 本研究以暗孢节菱孢菌为对象!对其致病
毒素进行了纯化)序列分析和致病力测定!旨在进一
步揭示该菌对杂交竹的致病机制$
:第 ## 期 李姝江等" 杂交竹梢枯病菌毒素蛋白纯化及致病力
#:材料与方法
#1#:试验材料:供试菌株" 暗孢节菱孢菌!分离于
杂交竹梢枯病株!由四川农业大学森林保护实验室
提供$
杂交 竹 品 种" ’撑 a绿 ( 杂 交 竹! 撑 篙 竹
’ .’;(49’ E$*6’*0’(0509( 为 母 本! 大 绿 竹
’N$1/*)=’5’;)E9092*’1/09(为父本!通过人工授粉培
育!一年生’四川省杂交竹栽培区($
毒素发酵液" 以改进 ZCABF为基础培养基’张金
林等! $%%;(!定量接种在 Y8,平板上培养的直径为
; DD的暗孢节菱孢菌丝块! $\ o!#!% C+DA> 4#震荡
培养 #; 天!双层纱布过滤后!取其滤液备用$
#1$:试验方法:#(毒素致病组分的确定:硫酸铵
分级盐析" 取$ %%% D-发酵液\ %%% C+DA> 4#分批离
心!取上清液!弃除菌体和发酵残渣$ 慢慢向上清液
中加入固体硫酸铵至 $%e 饱和度!冰箱中静置 $ <
后!" %%% C+DA> 4#离心 #; DA>!分别收集上清和沉
淀$ 将收集的上清液分为 $ 等份!一份作生物测定!
另一份加入固体硫酸铵!依次按照同样的方法调节
到 9%e!!%e!;%e!\%e!5%e!"%e!6%e的硫酸
铵饱和度$ 收集每 # 个饱和度的沉淀!将其溶解在
磷酸缓冲液’Y7&(中!用杂交竹浸渍法分别测定各
饱和度上清液和沉淀的致病活性!同时确定硫酸铵
的最适饱和度$
生物活性检测" 采用浸渍法’J/$+’5B! #66\(!
取生长均匀一致)无病虫害幼嫩枝条’每枝 ; 叶片(
用 5;e 酒精消毒 #% F!再用无菌水清洗 9 次!然后
插入保鲜膜封口的无菌 #1; D-离心管中!分别加入
上述分离后的溶液’!% (H+D-4#(# D-!以未接菌的
培养液和无菌水为对照$ $; o培养箱中培养’每天
光照 #$ <(!每处理 \ 枝!重复 9 次$ 于 $!!!"!5$ <
观察其枯萎状态$
$(毒素蛋白的纯化:’#(样品的透析和浓缩"
透析袋预处理后!将用最佳硫酸铵饱和度盐析的毒
素物质置透析袋中!用稀释 #% 倍的 EJ\1; 的磷酸
缓冲液透析过夜!除去硫酸铵!将透析过装有毒素的
透析袋用聚乙二醇 \%%%% 包埋!浓缩至原体积的
$%e 时取出!得到毒素蛋白粗提物$ ’$( &BE<=QBV
K?#%%凝胶层析’吴士良! $%%!(初步纯化!洗脱速度
为 %1\ D-+DA> 4#!配合核酸蛋白检测仪在波长
$"% >D检测!检测结果由计算机记录$ 收集各个蛋
白洗脱峰!浸渍法检测活性’J/$+’5B! #66\($ 将有
致病活性峰的样品!装入处理好的透析袋中采用上
述方法浓缩!至约 $ D-时收集!置 ! o冰箱!备用$
’9( &8&?Y,K)检测活性蛋白 ’李建庆等! $%%"("
选用分子量范围在$% %%% ‘6! %%%之间蛋白质标准
样品!常规方法配制电泳缓冲液)丙烯酰胺贮存液和
凝胶! &8&?Y,K)电 泳 上 述 活 性 物 质$ ’ ! ( l
&BE<=C/FBO=FSO0/T强阴离子交换层析 ’王家政等!
$%%#(进一步纯化!洗脱速度为 %1\ D/0+DA> 4#!配合
核酸蛋白检测仪在波长 $"% >D检测!收集各个洗脱
峰!浸渍法检测活性’J/$+’5B! #66\($ ’;(超滤离
心管浓缩’吴士良! $%%!(" 将以上强阴离子交换层
析具有致病活性蛋白样品加入超滤离心管滤膜上
端!离心后体积为原来的 #%e!取出放入 ! o冰箱!
备用$ 将经过浓缩后的具有致病活性的样品分别用
上述 &8&?Y,K)电泳!确定其为单一蛋白!为 *末
端部分氨基酸序列测定做准备$
9(毒素蛋白 *末端部分氨基酸序列测定:纯
化的有致萎活性毒素蛋白经 &8&?Y,K)后!凝胶置
于 ’,Y& 缓 冲 液 ’ 含 有 %1# D/0+ -4#
9?RLR0//?0?EC/E=>BFI0O/>AR=RAQ! #%e 甲醇!
EJ##1%(中浸泡$ DA># 同时将测序级 Y.8Z膜在无
水甲醇中浸泡 #; F!再移至 ’,Y& 缓冲液中# 将
&8&?Y,K)凝胶上的毒素蛋白转移至 Y.8Z膜上#
切下 Y.8Z膜上的毒素蛋白带!由上海基康生
物技术有限公司测序# 采用 7-,&+Y程序!通过
*’7(’美国国家生物技术信息中心!*(J下属机构(
@BN 服务器进行蛋白质序列数据库的类似性检索!
网址为" RNA3>0D3>A<3H/2b$
!(:毒素蛋白致病力测定:分别用 ;!#%!$%!
!%! "% (H+ D-4# 的 毒 素 蛋 白 溶 液! 以 及
:BE>’$)9E$*;4;悬液 ’91; a#%\ ’Zi+D-4# ()无菌
水’’g#(和无菌培养液’’g$(作为活性测试液!采
用针刺法’YBQC=F$+’5B! $%%6(对毒素蛋白进行田间
致病力检测$ 每个处理 9% 株!每株 # D-$ 用灭菌
针从上倾斜向下刺入杂交竹主干竹节处’杂交竹生
长均匀一致)无病虫害# 针刺前用 5;e 酒精消毒
#% F!并用无菌水清洗 9 次(!然后抽出灭菌针!滴入
%1# D-液体$ 分别于 ;!#%!#;!$% 天后记录菱形病
斑数量并计算其面积!病斑面积’RD$ ( d’=aN(b$
’=! N 分别为菱形病斑的两条对角线($ 试验数据
采用 )U’)-和 &Y&[% 软件分析处理!-&8法进
行多重比较’Ds%1%;($
=<结果与分析
$1#:毒素致病组分和硫酸铵最适饱和度:将发酵
液进行分级盐析后!对不同饱和度硫酸铵沉淀所得
非蛋白类和蛋白类物质经杂交竹致病性生物检测显
示’表 #(!发酵液中非蛋白部分’上清液(无活性!
;!#
林 业 科 学 !" 卷:
而蛋白部分’沉淀(有活性# 且随着硫酸铵饱和度的
增大!活性物质的沉淀量逐步增加!达到 ;%e时硫
酸铵沉淀量最多活性最大!继续增大饱和度!活性物
质的析出量逐步减少$ 由此可以确定活性物质为蛋
白类!且最佳硫酸铵饱和度为 ;%e$
表 :<发酵液不同组分的生物活性!
+%7>:<6.1’0’12 "*5’**,&,)1."#$"),)1(
’)1B,*,&#,)1%1’")3’G4’5
硫酸铵饱和度
&=SIC=SA/> /O
=DD/>AID
FI0O=SB’e(
组分
’/DE/>B>S
时间
+ADBb<
$! !" 5$
$%
上清液 &IEBC>=S=>S 4 4 4
沉淀 YCBRAEAS=SA/> 4 4 q
9%
上清液 &IEBC>=S=>S 4 4 4
沉淀 YCBRAEAS=SA/> 4 q q
!%
上清液 &IEBC>=S=>S 4 4 4
沉淀 YCBRAEAS=SA/> 4 q qq
;%
上清液 &IEBC>=S=>S 4 4 4
沉淀 YCBRAEAS=SA/> q qqq qqqq
\%
上清液 &IEBC>=S=>S 4 4 4
沉淀 YCBRAEAS=SA/> q qq qq
5%
上清液 &IEBC>=S=>S 4 4 4
沉淀 YCBRAEAS=SA/> q q qq
"%
上清液 &IEBC>=S=>S 4 4 4
沉淀 YCBRAEAS=SA/> 4 4 q
6%
上清液 &IEBC>=S=>S 4 4 4
沉淀 YCBRAEAS=SA/> 4 4 q
发酵原液 ZBCDB>S=SA/> 0AkIAQ q qq qq
’g# 4 4 4
’g$ 4 4 4
:: ) ’g# 无菌水 &SBCA0BT=SBC# ’g$ 无菌培养液 &SBCA0BZCABF
F/0ISA/>$ % 4&无作用 */BOBRS# % q&枯萎 @A0SA>H# q越多!枯萎越
强 +HBCBOBRS3
$1$: &BE<=QBVK?#%% 柱层析与活性峰 &8&?Y,K)
检测:经过分级沉淀后的物质!经 &BE<=QBVK?#%%
凝胶层析纯化后得到峰 # 和峰 $ 两个波峰’图 #(!
波峰间分离明显!几乎没有重叠$ 致病活性检测结
果表明’表 $(" 峰 # 具有致病性!而峰 $ 不具有活
性$ 收集活性峰 #!聚乙二醇 \%%%% 浓缩!进一步分
离纯化$
有致病活性的峰 # 浓缩样品经 &8&?Y,K)检
测!结果显示’图 $(!峰 # 由 $5!\5 PI $ 种蛋白质组
成!纯度不够好!因此需将活性峰 # 浓缩后用
lFBE<=C/FBO=FSO0/T阴离子交换树脂进一步纯化$
$19:lFBE<=C/FBO=FSO0/T强阴离子交换层析与活
性峰 &8&?Y,K)检测:将过 &BE<=QBVK?#%% 凝胶层
析纯化后收集的活性峰 # 浓缩!用 l&BE<=C/FBZ=FS
Z0/T强阴离子交换树脂进一步的分离纯化显示’图
9(!,$"% 洗脱曲线出现一个坡度较小的穿透峰 #!
随着 *=’0浓度的升高!紧随出现第 $ 个洗脱峰 $!
图 #:粗蛋白的 &BE<=QBVK?#%% 凝胶层析洗脱曲线
ZAH3#:)0ISA/> RIC2B/ORCIQBEC/SBA> NL
&BE<=QBVK?#%% HB0R图 $:活性峰 &8&?Y,K)电泳
ZAH3$:&8&?Y,K)FEBRSCID/OS但峰值较小$ 最后!随着 *=’0浓度的大幅度提高!
出现了 # 个较大的洗脱峰 9!将以上 9 个峰依次命
名为 Y#!Y$和 Y9$ 收集 Y#!Y$!Y9!活性检测只有 Y9
具有致病活性 ’表 $($ 将 Y9浓缩至 %1$ D-!置于
! o冰箱备用$
有致病活性的 Y9峰样品浓缩后 &8&?Y,K)检
测表明’图 !(!$ 种层析法结合已经得到了纯度较
高的单一蛋白!该蛋白以 Y9表示$
图 9:活性峰 # 的 lFBE<=C/FBO=FSO0/T
强阴离子交换层析洗脱曲线
ZAH39:)0ISA/> RIC2B/O=RSA2=SBQ EB=P # NLl
FBE<=C/FBO=FSO0/T=>A/> BVR<=>HB
\!#
:第 ## 期 李姝江等" 杂交竹梢枯病菌毒素蛋白纯化及致病力
$1!:纯化过程中不同分离物的生物活性:通过 $
种层析方法获得有致病活性的毒素蛋白!有毒力的
为能测序的 Y9蛋白’表 $(!Y#!Y$无活性$
图 !:lFBE<=C/FBO=FSO0/T强阴离子变换层析
后毒素蛋白 Y9电泳
ZAH3!:&8&?Y,K)FEBRSCID/OS/VAREC/SBA>
Y9 =OSBClFBE<=C/FBO=FSO0/T
$1;:毒素蛋白 Y9的 *末端部分氨基酸序列分析及
对蛋白质序列库的类似性检索:将纯化得到的抗菌
蛋白 Y9经 &8&?Y,K)测定为单一条带!分子量约为
$5 PI!其 *末端 5 个氨基酸序列" J$*?,0=?K0>?&BC?
.=0?YC/?+LC?K0L$
测得 *末端氨基酸序列后!为判定 Y9是否为 #
种新蛋白!以 *末端 5 个氨基酸序列片段为靶序
列!在 *’7(蛋白质数据库进行蛋白质序列类似性
搜索!从中共检索出 #%% 个与 Y9:*末端序列相似$
结果表明" 检测出的 #%% 个序列多是丝氨酸蛋白酶
或丝氨酸蛋白酶前体及重组酶的序列!这 #%% 个序
列具有致病活性的只有枯草芽孢蛋白酶 ’FINSA0AFA>
EC/SB=FB(’登录号" ,,,$$"#!1#(!而且枯草芽孢蛋
白酶分子量 $5 PI!与 Y9的分子量极为相近$ 另外!
Y9多是从 *末端第 # 个残基与库中序列的第 "! ‘
"\ 或 #%5 ‘#%6 对准!这些序列在对准点之前的序
列属于信号肽序列!作为一个胞外蛋白酶!分泌过程
中已除去信号肽序列!检索到的 FINSA0AFA> EC/SB=FB
除去对准点的序列!剩余的长度与 Y9的序列长度
相符$
表 =<纯化过程中不同分离物生物活性
+%7>=<6.1’0’12 "*5’**,&,)1."#$"),)1(’)1B,$4&’*’.%1’")
组分
’/DE/>B>S
时间 +ADBb<
$! !" 5$
&BE<=QBVK?#%% 凝胶层析
&BE<=QBVK?#%%HB0R峰 # YB=P # qq qqq qqqq
峰$ YB=P $ 4 4 4
l&BE<=C/FBZ=FSZ0/T强阴离子交换层析
lFBE<=C/FBO=FSO0/T=>A/> BVR<=>HBCBFA>
峰# YB=P # ’Y# ( 4 4 4
峰 $ YB=P $ ’Y$ ( 4 4 4
峰 9 YB=P 9 ’Y9 ( q qq qqq
粗蛋白 ’CIQBEC/SBA> 4 qqq qqqq
’g# 4 4 q
’g$ 4 4 4
$1\:毒素蛋白 Y9致病力与病原菌侵染力的比较:
用 :BE>’$)9E$*;4; 悬 液 和 Y9 ’ #%! $%! !%!
"% (H+D-4#(处理的 #;% 株杂交竹针刺处均出现
不同大小的褐色菱形病斑!而 ’g# 和 ’g$ 在整个
检测 期 都 没 有 病 斑 出 现 ’ 表 9 ( $ 对 比 :B
E>’$)9E$*;4;悬液和毒素蛋白 Y9的处理发现!除 ;
(H+D-4#的 Y9外!菱形病斑面积在 ; ‘#% 天均大
幅增长!且:BE>’$)9E$*;4;悬液与 $% (H+D-4#的 Y9
在此期间差异不显著# 而 #% 天后 Y9 ’#% ‘"% (H+
D-4#(处理的病斑面积保持在相对稳定的水平!
:BE>’$)9E$*;4;悬液的处理在 #% ‘#; 天还有一个
显著 增 长 的 趋 势! #; ‘$% 天 增 长 缓 慢! 且
:BE>’$)9E$*;4;悬液与 !%!"% (H+D-4#Y9处理从 #;
天开始差异不显著$ 从毒素蛋白 Y9的浓度上看!
; (H+D-4#的处理检测前期没有病斑出现!直到 $%
天时才有较小的病斑# #% (H+D-4#的处理在整个检
测期内病斑面积都没有超过 %1# RD$# $% ‘"% (H+
D-4#的处理增长趋势相似!但 !% 与 "% (H+D-4#无显
著差异! $% (H+D-4#处理的病斑面积与上述处理差
异显著$
5!#
林 业 科 学 !" 卷:
表 @<不同处理下杂交竹主干上的菱形病斑面积!
+%7>@处理 +CB=SDB>S
面积 ,CB=bRD$
; Q #% Q #; Q $% Q
’g# % % % %
’g$ % % % %
:BE>’$)9E$*;4;91; a#%\ ’Zi+D-4# $1!" t%1%$ N ;1$$ t%1%\ N #%1\5 t%1#5 = #$1!9 t%1#! =
Y9 ’;(H+D-
4# ( % % % %1%# t%1%% Q
Y9 ’#%(H+D-
4# ( %1%! t%1%# R %1%6 t%1%$ R %1#% t%1%# R %1#% t%1%$ R
Y9 ’$%(H+D-
4# ( $1;# t%1%; N ;1!" t%1$! N ;1"6 t%1#; N ;16! t%1%" N
Y9 ’!%(H+D-
4# ( 51"5 t%1%5 = #$1!% t%1#9 = #$1;# t%1%9 = #$1;! t%1%! =
Y9 ’"%(H+D-
4# ( 5169 t%1#% = #$1!; t%1#% = #$1;; t%1%$ = #$1\# t%1%9 =
::) ’g#" 无菌水 &SBCA0BT=SBC# ’g$" 无菌培养液 &SBCA0BOCABFF/0ISA/>3表中各数据均为 9% 次重复的平均值# 同列数据后不同小写英文字母
表示在 Ds%1%; 水平上差异显著’-&8法( $ 8=S=A> SF/OSF38AOBCB>S0/TBCR=FB0BSBCFA> S A>QAR=SB
FAH>AOAR=>SQAOBCB>RBF=SDs%1%; 0B2B0NL-&8SBFS3
9:结论与讨论
本研究采用柱层析和阴离子交换层析从暗孢节
菱孢发酵液中纯化出一种对杂交竹有致病活性的蛋
白质类物质!这一结果与 .AW=L=PID=C等 ’#66\(和
70//C’$%%"(从引起人体皮肤病的暗孢节菱孢菌中
分离获得的致病因子 =CS 和 =CSAR=RAQ 不
同!印证了同种真菌在不同寄主不同条件下所产生
的致病活性物质存在差异$ 该蛋白经 *末端测序
得到 5 个氨基酸序列为 J$ *?,0=?K0>?&BC?.=0?YC/?
+LC?K0L!通过 *’7(对蛋白质数据库的类似性检索!
发现其与枯草芽孢蛋白酶 ’FINSA0AFA> EC/SB=FB(无论
在分子量大小还是 *端序列均类似!由此推测其与
FINSA0AFA> EC/SB=FB同源性较高或者有可能为该物质$
结合赵从等’$%%5(和姚刚等 ’$%%6(从枯草芽孢杆
菌 .’=054994(+0509中分离得到 FINSA0AFA> EC/SB=FB的
报道!该物质是否能由暗孢节菱孢产生还需进一步
的结构测定和比对来验证$
蛋白质的分离纯化至今没有单独或一套现成的
方法!往往都是将分子筛层析)离子交换层析)疏水
层析)亲和层析等联合使用达到目的$ 本试验首先
用柱层析纯化获得的活性峰检测后纯度并不理想!
而后经阴离子交换层析才得到纯度较高分子量为
$5 PI 的单一蛋白!可见蛋白质这种大分子物质的
纯化较为复杂且要求较高$ 此外!本研究中纯化过
程不同波峰的获取物!其致病力及所导致的症状都
有所不同!对比前人在研究板栗疫病菌毒素 ’’E?(
S/VA>(’韩珊等! $%%6()松赤枯病毒素’YO?S/VA>( ’朱
天辉等! $%%9(中的结果!可以看出本试验中引起杂
交竹萎蔫的活性物质比较单一!而不是多种物质的
协同作用$ 用纯化物进行生测!其反应时间较粗毒
素快# 在田间致病力检测中!纯化物反应时间也比
病原菌快!分析其原因可能是检测用毒素的浓度较
杂交竹自然发病时所产毒素的浓度高!故其致萎性
也相对增强$ 另外!用纯蛋白 Y9对杂交竹处理时!
显示的症状与病原菌所致典型症状相同!再次印证
了该毒素蛋白是引起杂交竹梢枯病的主要因素$ 浓
度差异显示 ; ‘#% (H+D-4#为该蛋白的有效起始作
用浓度!且浓度越高其致病力越强!验证了该毒素的
毒力大小!这与甘莉等’#66;()陈桂平等’$%%6(研
究结果相似$ 当一个新的蛋白质或核酸序列被测定
出来后!为判定是否是新蛋白或新基因!就需要进行
对序列数据库的类似性检索!本研究采用 *’7(检
索发现存在与纯蛋白 Y9相似的序列!获得有生物性
意义的结果$ 暗孢节菱孢菌作为杂交竹的新病原!
致病机制尚未完全清楚!其毒素导致杂交竹枯死只
是机制的一个方面!有关该毒素蛋白的作用位点及
寄主细胞信号识别)传导机制需深入研究$
参 考 文 献
陈桂平!客绍英!陈玉芹3$%%63菘蓝根腐病菌毒素最适浓度的筛选
及其对菘蓝幼苗可溶性蛋白的影响3安徽农业科学!95 ’99 ( "
#\96$ 4#\96!3
甘:莉!吕金殿!汪沛洪3#66;3棉花黄萎病菌分泌的糖蛋白毒素与
其致病力的关系3中国农业科学!$"’$( " ;" 4\;3
韩:珊!朱天辉3$%%63寄生隐丛赤壳菌致病毒素 ’E?(的分离纯化
和结构分析3菌物学报!$"’!( " ;9; 4;!%3
李建庆!张永安!杨忠岐!等3$%%"3杀天牛毒蛋白的分离纯化及其
*?末端氨基酸序列的测定3西北农林科技大学学报" 自然科学
版!9\’9( " #5# 4#5;3
汪家政!范:明3$%%#3蛋白质技术手册3北京" 科学出版社!
55 4#%%3
吴士良3$%%!3生物化学与分子生物学实验教程3北京" 科学出版
社!$% 4$!3
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