全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % # % 年 # 月
林 业 科 学
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./01 !"，*/1 #
2345，$ % # %
杨树 !"!# $%&基因 ’($%&)* 的克隆及表达
宿红艳 6 王 6 磊 6 王仲礼 6 冯培勇 6 张 6 晔
（鲁东大学生命科学学院 6 烟台 $"!%$7）
关键词：6 杨树；$%& 基因；克隆；表达分析；雄花序
中图分类号：&8#91 !"；:;!<1 $6 6 6 文献标识码：,6 6 6 文章编号：#%%# = 8!99（$%#%）%# = %#!$ = %7
收稿日期：$%%9 = %; = #9。
基金项目：国家自然科学基金项目（<%8!%%#8）；鲁东大学学科建设项目。
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&> ?/4@A344 B34@ -CD4 B34@ EF/4@0D4 GC4@ HCDA/4@4 EF34@ IC
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567,*’+,：6 ,4 !"!# $%& @C4C，’($%&)*，J3K DK/03LCM NO/P P30C D4N0/OCKQC4QC /N ’,=5-54 R (59<>(902<3< SA
F/P/0/@/>K Q0/4D4@ Q/PSD4CM JDLF 03 40-02, Q0/4D4@ LCQF4DT>CK5 +FC N>00 0C4@LF /N ’($%&)* QU*, J3K # %;! SV C4Q/MD4@
$8" 3PD4/ 3QDMK5 +FC MCM>QCM 3PD4/ 3QDM KCT>C4QC Q/4L3D4CM LJ/ Q/4KCOWCM XIY M/P3D4K 4C3O LFC *ZLCOPD4>K，3
Q/4KCOWCM )# P/LDN 34M 34 3QDMDQ &CO [ +FO ODQF OC@D/4 L/J3OM DLK ’ LCOPD4>K5 HFA0/@C4CLDQ 3430AKDK OCWC30CM LF3L HCXIY-#
J3K Q0>KLCOCM JDLF ,LXIY97 NO/P ?9<@06,=404 :A<-0<3<，EPXIY-# NO/P B(< ><;4，\KXIY#7 NO/P C9;D< 4<:08< 34M
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O//L，KLCP，0C3N，P30C 34M NCP30C D4N0/OCKC4QCK，34M 3S>4M34L0A 3QQ>P>03LCM D4 P30C D4N0/OCKQC4QCK5 +FC C^VOCKKD/4 0CWC0
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N0/JCO MCWC0/VPC4L5
8-9 :#*(7：6 V/V03O；$%& @C4C；Q0/4D4@；C^VOCKKD/4 3430AKDK；P30C D4N0/OCKQC4QC
6 6 XIY 是植物转录因子中最大的家族之一，该家
族成员以含有 XIY 结构域为共同特征。按所含
XIY 结构域的数目，XIY 类转录因子可分成 < 种
类型，即分别含 # 个、$ 个和 < 个 XIY 结构域。每
个 XIY 结构域通常由 7# _ 7$ 个氨基酸组成，在空
间结构上，XIY 结构域形成螺旋 =螺旋 =转角 =螺
旋（FC0D^ZFC0D^ZL>O4ZFC0D^）结构，负责与 U*, 序列的
特异结合。植物中绝大多数 XIY 类转录因子都含
有 $ 个 XIY 结构域，对应于动物 QZXIY 蛋白的 ]$
和 ]< XIY 结构域，故称为 ]$]< XIY 蛋白。除具
有 U*, 结合功能域外，大多数 ]$]< XIY 类转录
因子还具有转录激活功能域，它们一般位于蛋白序
列的中间或 ’ 端，常以富含酸性氨基酸、脯氨酸、谷
氨酰胺或丝氨酸 [苏氨酸为其特征（‘O34a (: <-5，
#;;9；&QFJCQFFCDPCO 6 (: <-5，#;;9； 2D4 (: <-E，
#;;;；&LO3QbC (: <-5，$%%#）。目前已在多种植物中
发现数目众多的 !"!# $%& 基因。例如，仅在拟南
芥（ ?9<@06,=404 :A<-0<3<）中就有大约 #$7 个 !"!#
$%& 基因，在玉米（B(< ><;4）基因组中也存在上百
个的 !"!# $%& 基因。它们在植物代谢和发育的各
个方面起着重要的调控作用，其主要功能是调节次
生代谢（特别是苯丙酸代谢）、控制细胞的分化和器
官的形态建成以及参与对环境胁迫、光和激素的应
答等。但迄今关于 XIY 类转录因子调控植物基因
表达的机制还远未阐述清楚，并且已有的研究主要
集中在拟南芥、烟草（F02,:0<3< :<@<25>）和玉米等草
本植物中，而林木中关于这类转录因子的研究相对
滞后（]3SD4/JDQa (: <-5，#;;;；&LO3QbC (: <-5，$%%#；
H3La03NN (: <-5，$%%<；‘3OVD4Kb3 (: <-5，$%%!；陈俊
等，$%%$）。
杨树是林木研究的模式植物，关于 XIY 类转录
因子调控其生长发育的研究已受到高度关注，并取
得一定进展。BD0bD4K 等（$%%;）利用生物信息学预
测在毛果杨（’,=5-54 :902A,2<9=<）基因组中存在 #;$
个 !"!#G$%& 基因，进而通过基因芯片分析，发现其
中约有 $; 个在雄花序中表达水平最高，另有 #! 个
左右在雄花序和雌花序中均有较高水平的表达。分
离、鉴定这些与花发育相关的 $%& 基因可为揭示杨
树花发育分子机制提供理想的切入点。
本文以黑杨派（ &CQLD/4 ?0.(09,4）的 欧 美 杨
! 第 " 期 宿红艳等：杨树 !"!# $%& 基因 ’($%&)* 的克隆及表达
（’+,-.-/ # (-012(034151）为研究材料，从其雄花序中
分离到 " 个编码 $%& 转录因子的 ’()* 克隆
’($%&)*，并利用 +,-./+ 对该基因的表达模式进
行初步分析。同时，通过与核酸、蛋白数据库的序列
比对，比较该基因的同源性。此项研究工作为深入
理解 $%& 转录因子调控机制提供新的资料。
!" 材料与方法
"0 "! 植物材料 ! 欧美杨样品取自鲁东大学校园，取
样后立即液氮速冻，并于液氮中冷冻保存直至使用。
"0 1 ! 总 +)* 提取 ! 总 +)* 的提取参照 +)2345
.6378 $979 :98（;<*=>)）说明书进行。
"0 ?! 目的基因克隆及序列测定 ! 以欧美杨雄花序
为材料提取总 +)*。用 &( @$*+,,$ +*/> ’()*
*AB69C9’389D7 :98（/6D782’E）试剂盒进行反转录，合
成 ’()* 的第 " 条链。根据保守区的氨基酸序列
+/=:@/+ 和 .=+,()> 设计 " 对兼并引物 .$%&C：
FG-/=,,=（, H /）==（* H /）**（* H =）*=（ , H /）,=
（, H /）/=,-?G和 .$%&I：FG-,/（* H =）,,*（ , H =）/
（, H =）=,,/,（, H /）//（* H , H /）==-?G，以 ’()* 为
模板进行 ./+，获得中间片段。./+ 扩增：JK L ?
A97 预变性后，JK L " A97，FK L " A97，M1 L JN 4 ，
共 ?F 个循环。目的片段的克隆参照 .IDA2O3 公司
的 B=$>-,2345 P2’8DI @5482A4 说明书进行，序列测
定由上海生工生物工程有限公司完成。
根据获得的中间片段序列，设计特异引物
.$%&"-"：FG-//,=*/,,=**=*=*==//,-?G，通过
?G+*/> ./+ 分离基因的 ?G端序列。具体操作参照
&( @$*+,,$ +*/> ’()* *AB69C9’389D7 :98
（/6D782’E）说明。将获得的序列在杨树的 >@, 数据
库（.DBQ6Q4(&，*4B27(&，.DB63I(&）和 )/&< 数据库
中运行 &R*@,7 程序，选择比对分值最高的 >@, 序
列，找出序列一致的部分，人工拼接合并 >@,，最终
拼接得到目的基因的 FG端理论序列。最后，在目的
基 因 的 两 端 设 计 特 异 引 物 .$%&"-1：FG-
=**/,*,*=,=*,===,*=*/-?G 和 .$%&"-?：FG-
==,/,,=**/,/,,/,,/=*,-?G，分离全长 ’()*，
进行测序验证。
"0 K! 目的基因的序列分析 ! 利用 ()*483I、.I9A2I
.I2A92I F0 N 软件对目的基因 ’()* 编码氨基酸序列
进行分析；用 )/&< 数据库中的 &6348 软件将目的基
因编码的氨基酸序列与 =27&37S 中的序列进行比
对和相似性搜索；进而利用 ()* A37 软件进行多序
列同源性比对和聚类分析。
"0 F! +,-./+ 分析 ! 采用 +,-./+ 半定量法对目的
基因的表达模式进行分析。分别提取根、茎、叶、不
同发育时期的雄花序及雌花序的总 +)*。取 " !O
的总 +)*，用 1N !R 的 $-$RP 酶（.IDA2O3）反应体
系反转录合成 ’()* 的第 " 条链。根据目的基因的
?G 端 非 保 守 区 设 计 特 异 引 物 .$%&"-K：FG-
*=,,=//,*,==,/==*==,-?G 和 .$%&"-?：FG-
==,/,,=**/,/,,/,,/=*,-?G，进行 ./+ 扩增。
以肌动蛋白基因 6789: 为扩增内部参照，扩增引物
为 */,<)C： FG-*//*/*,*/**/,//*,/*,-?G，
*/,<)I：FG-/*//,,=*,,,//*,=/,=/-?G。./+ 扩
增的条件为：JK L ? A97 预变性后，JK L ?N 4 ，
TN L ?N 4，M1 L ?N 4，扩增 ?N 个循环，而 6789: 扩
增 1T 个循环，最后 M1 L延伸 "N A97。
#" 结果与分析
10 "! ’($%&) * 基因的分离及序列分析 ! 利用同源
克隆方法从欧美杨雄花序中分离到 " 个 $%& 基因
’($%&) * ，=27U37S 注册号为 VW1NJNXX。该基因
’()* 全长 " NJK UB，共编码 1MT 个氨基酸。图 " 示
’($%&)" 基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。
序列分析结果显示，.2$%&R" 蛋白分子质量为
?NY XKJ SQ，等电点为 F0 K。) 端具有 1 个典型的
$%& ()* 结合域：+1（"1 Z TK 33）与 +?（TF Z ""F
33）。+1 结构域自第 "M 33 开始，每间隔 "J 个 33
有 " 个保守的疏水氨基酸残基色氨酸（[，"M33，
?M33，FM33），共计 ? 个 [；+? 结构域中第 " 个 [ 为
亮氨酸（R，MN33）所取代，自 R 起每间隔 "X 个 33 有
" 个 [ 残基（XJ33，"NX33）。/ 端存在一段 @2I H ,EI
丰富区，这是转录因子激活结构域常见的特征。此
外，.2$%&R" 序列的另一个重要特征是在 +? 结构
域 的 下 游 含 有 " 个 保 守 的 >" 基 序
（R\\$=<(.P,]: H +.）（ WQ (; 1.0，1NNT）。以上结
果表明，’($%&)" 编码的蛋白是一个典型的 +1+?
$%& 转录因子家族成员。
10 1! ’($%&)* 基因的同源性比对及聚类分析 ! 用
&R*@,B 程序将 ’($%&)* 基因推导的氨基酸序列与
数据库中的序列比较，发现与其同源的序列全部是
$%& 基因，并具有较高的序列一致性。例如，
.2$%&R" 与拟南芥的 *8$%&XF（一致性 FM^）、玉
米的 _A$%&R"（一致性 FM^）、水稻的 ‘4$%&"F
（一致性 FT^）及矮牵牛（ ’(;-531 # <=>03?1）的
‘(‘+*),"（一致性 FF^），且同源区域都集中在 )
端 +1+? ()* 结合域（图 1），而 / 端同源性极低，说
明分离得到的 ’($%&)* 是 " 个新的杨树 $%&
基因。
?K"
林 业 科 学 !" 卷 #
图 $# !"#$%&’ %&’( 序列及推导的氨基酸序列
)*+, $# -./ 01%2/34*5/ 6%*5 7/81/0%/ 39 !"#$%&’ %&’( 9122:2/0+4. 605 *47 5/51%/5 6;*03 6%*5 7/81/0%/
下划线为 <=<> ?@A 结构域，其中高度保守的氨基酸残基“B”和“C”用粗体表示；方框部分为 D$ 基序；E/F G -.F 丰富区用阴影表示；终止密
码子用“!”标注。<= 605 <> ?@A 53;6*07 6F/ 105/F2*0/5 605 4./ .*+.2H %307/FI/5 6;*03 6%*5“B”605“C”6F/ 5/034/5 *0 J325；6 %307/FI/5 D$
;34*9 *7 *05*%64/5 K*4. J3L/7；6 E/F G -.F F*%. 6F/6 *7 7.3K/5 K*4. 6 7.65/5 F/%460+2/；4./ 743M %3530 *7 ;6FN/5 JH 60 674/F*7N,
图 =# O/?@AC$ 与其他相关 <=<> ?@A 转录因子的 ’ 端序列比较
)*+, =# (2*+0;/04 39 O/?@AC$ K*4. F/264/5 <= <> ?@A 4F607%F*M4*30 96%43F
(4?@APQ，(4?@A=R：拟南芥 ()*+,-./0,0 12*3,*4*（’OSQ"T""!，’OS$T"TUT）；V&V<(’-$：矮牵牛 !"154,* W 26+),-*（XQRDY"）；Z;?@AC$：
玉米 7"* 8*60（’OSRR$$R"RRT）；V7?@A$Q：水稻 9)6:* 0*1,;*（[([PQRQ=）；\.?@AU：陆地棉 <.006/,58 2,)05158（((EU=>!T）。黑色阴影表
示同源序列；下划线部分为 <=<> ?@A 结构域。高度保守的氨基酸残基用“!”标注，“ ,”表示空位。&6FN 7.65*0+ K*4. K.*4/ 2/44/F7 F/92/%4
$RR] 7/81/0%/ %307/FI64*30, <= 605 <> ?@A 53;6*07 6F/ J325 105/F2*0/5,“!”*7 17/5 43 *05*%64/ 4./ *5/04*%62 6;*03 6%*57, \6M7 *04F351%/5 43
*;MF3I/ 62*+0;/04 6F/ *05*%64/5 JH 567./7,
# # 应用 &’(?(’ 软件包中的 ?(ED& 软件，对来
自拟南芥、矮牵牛、水稻、玉米、金鱼草（ (41,))2,458
8*=50）、西红柿（ &6>./")0,>.4 "0>53"4158）、杨树等植
物的 =! 个 ?@A 转录因子成员，采用 ’/*+.J3F:
^3*0*0+ 的 方 法 进 行 进 化 树 分 析（图 >），发 现
O/?@AC$ 与拟南芥的 (4?@APQ、玉米的 Z;?@AC$、
水稻的 V7?@A$Q 及矮牵牛的 V&V<(’-$ 聚为同一
分支，表明它们可能具有相同的起源。
!!$
! 第 " 期 宿红艳等：杨树 !"!# $%& 基因 ’($%&)* 的克隆及表达
图 #! $%&’()" 与其他物种 &’( 蛋白的聚类分析
*+,- #! $./01,%2%3+4 35%% 16 $%&’()" 728 &’(
9513%+2: 651; <75+1=: 90723 :9%4+%:
>;&?@A>，>;&’(#BC：金鱼草 +,-.//0.,12 23415（ D>>CCEFC，
$G"#H"）；$.&’("，$.&’(F，$.&’(#，$.>IF，JKJL>IA"：矮
牵牛 ’(-1,.3 M 067/.83（ N"#HHO，N"#HHE，N"#HHG，P*QF#GOG，
RCBP@O）；J:&’("C，J:&’(C"：水稻 9/6:3 53-.;3（ D>DGCBCF，
>S#""BC"）；N;&’()"，N;D"，N;$"：玉 米 <(3 2365（ I$ T
BB""BOBBE，"O"#Q"FP， >>UBHQCO ）； >3&’(GC， >3&’(FB，
>3&’(C，>3$>$"，>3$>$F，>3&’("B"， >3&’("BG： 拟 南 芥
+/37.8=>5.5 -03?.3,3（ I$ T COEOOQ，I$ T "EOEHE，I& T ""FFBB，
>*BOFHBG，>*BOFH"C，I$TBB"BEEHH#，I&T"""CFC）；)%AV&"O：
西红柿 )6@=>(/5.@=, (5@1?(,-12（@HHF"B）；$3&’("：火炬松 ’.,15
-3(83（>’#CO#EF）；$:&’(FO：豌豆 ’.512 53-.;12（D>>E"HHF）；
W.&’(H：陆地棉 A=556>.12 0./51-12（ >>XHF#QE）；$%&’()"：
欧美杨 ’=>1?15 M (1/32(/.@3,3（*SFBHBGG）。部分 &’( 蛋白的功
能作了标注。Y21Z2 6=243+12: 16 :%<%570 &’(: 75% +28+473%8-
F- # ! ’($%&)* 在不同组织中的表达分析 ! 利用
LA[$DL 技术对 ’($%&)* 在不同组织中的表达模式
进行分析。结果显示，’($%&)* 在根、茎、叶、雄花
序和雌花序中均表达，但在雄花序中表达水平最高。
为进一步了解 ’($%&)* 在雄花序的不同发育时期
中的表达情况，分别提取幼嫩和成熟雄花序的总
LI> 进行分析。如图 Q 所示，随着雄花序发育成
熟，’($%&)* 的表达量逐渐提高。
!" 讨论
多年生木本植物是大多数森林生态系统中的主
图 Q! 应用 LA[$DL 技术进行 ’($%&)* 的表达水平分析
*+,- Q! P\95%::+12 7270/:+: 16 ’($%&)*
+2 <75+1=: 3+::=%: ]/ LA[$DL
L：根 L113； X：茎 X3%;； )：叶 )%76； &*：雄 花 序 &70%
+26015%:4%24%；**：雌花序 *%;70% +26015%:4%24%- "，F，# 分别为在
FBBE 年 E 月、FBBG 年 F 月和 # 月取的不同发育时期雄花序 &70%
+26015%:4%24% +2 S=2%，FBBE，*%]5=75/，FBBG 728 &754.，FBBG
5%:9%43+<%0/-
要生命形式，具有与草本植物不同的解剖学、生理学
及遗传学特性，因此以木本植物为材料开展对 &’(
转录因子家族新成员的分离、鉴定对深入理解该类
转录因子的调控机制具有独特的价值（(578:.7Z (-
3?-，FBBB；A7/015，FBBF）。杨树由于其基因组较
小，且具有完善的遗传转化体系，已成为研究林木遗
传、发育及基因工程改良的模式植物。同时，杨树基
因组计划及一系列 PXA 计划的完成也将为研究其
生长和发育规律提供理想平台（ (5=22%5 (- 3?-，
FBBQ；X3%5^/ (- 3?-，FBBQ；张勇等，FBBO）。本研究
从欧美杨分离到 " 个 !"!# $%& 基因 ’($%&)*，该
基因编码的蛋白具有典型的 &’( 转录因子的序列
特征。目前，正在进一步通过检测 ’($%&+*：：AB’
融合基因的表达情况及一系列的缺失分析确定
$%&’()" 的亚细胞定位情况和蛋白不同区段的转
录激活活性。
植物 &’( 转录因子较明确的功能之一是参与
植物苯丙烷类次生代谢途径的调节（’72, (- 3?-，
FBB"；K%0=4 (- 3?-，FBBG；)7+3+2%2 (- 3?-，FBBG；
I7^73:=^7 (- 3?-，FBBG）。$7_[>5%: 等（"HGE）从玉米
中发现第 " 个植物 &’( 基因 C*。研究表明，D" 与
顺式作用元件相结合，调控花青素生物合成途径中
相关基因的表达，作用于种子糊粉层色素形成过程。
而花青素便是通过一条苯丙烷代谢通路产生的。随
后，人们发现许多 LFL# &’( 家族成员也在苯丙烷
代谢途径的调控中发挥重要作用。例如：矮牵牛的
’0$%&#，金鱼草的 +2$%&#DE，豌豆的 ’5$%&"F
以及玉米的 <2$%&* 等基因可以调节花器官中花
青素和类黄酮合成的水平（ *572^%2 (- 3?-，"HHQ；
X10721 (- 3?-，"HHC；&1/721 (- 3?G，"HHO；U+;75+ (-
3?G，"HHE），而玉米的 <2$%&’) 则在营养器官中行
使类似的功能（D12% (- 3?-，"HH#）。与上述基因的
表达产物不同，‘%5812^ 等（FBBC）报道的矮牵牛中
&’( 转录因子 JKJL>IA" 则通过调节莽草酸途径
CQ"
林 业 科 学 !" 卷 #
调控挥发性芳香族化合物的生物合成。系统进化分
析将 $%&’()* 同 +,+-./0* 聚在同一分支中，这
为推测 !"#$%&’ 的功能提供一定的线索。-01$2-
分析显示，!"#$%&* 雄花序中表达水平远远高于
其他被检组织中的表达量，且随着雄花序发育成熟，
!"#$%&’ 的表达量逐渐提高，暗示该基因与雄花发
育密切相关。尽管序列同源性分析和基因表达模式
常常作为推测基因功能的重要标准，但是功能分析
才能最终说明它在植物发育过程中的作用，因此，今
后将构建 !"#$%&’ 表达载体，通过同源和异源转化
对该基因的功能进行鉴定。对 !"#$%&’ 的分离鉴
定及进一步的功能研究将为更全面、深入地了解该
基因家族的功能提供新资料。
参 考 文 献
陈 # 俊，王宗阳 3 45543 植物 &’( 类转录因子研究进展 3植物生理与
分子生物学学报，46（ 4）：6* 7 663
张 # 勇，张守攻，齐力旺，等 3 455"3杨树———林木基因组学研究的模
式物种 3 植物学通报，48（8）：46" 7 4983
(:;<=>;? @ ,，2%AB%C;D= -，,;EF= G，"( )*3 45553 HC%:IFDI CJ<%B
=K=L%C= FD MB;DL NFJBJIK：$JMB;:（!+,-*-.）;= ; CJ<%B OJ:%=L L:%%3 G
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（责任编辑 # 徐 # 红）
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