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Molecular Identification of Crotalaria Witches’Broom Phytoplasma

猪屎豆丛枝病植原体的分子检测与鉴定


Crotalaria witches’-broom phytoplasma (CrWB) collected from Hainan Province, was classified and identified by sequencing techniques and Virtual RFLP. Two different type universal primer pairs of phytoplasma were used to amplify a 1.8 kb fragment of 16S rDNA and a 1.3 kb fragment of rp gene. The PCRamplified products were cloned and sequenced. The results of sequencing and homologuous comparison with other phytoplasmas showed that Crotalaria witches’-broom phytoplasma shared 99.9 % similarity with peanut witches’broom phytoplasma in 16S rRNA gene and 99.9% in rp gene. Crotalaria witches‘-broom phytoplasma is sorted into Peanut witches‘-broom group(16SrII), 16SrIIA, according to the results of Virtual RFLP of 16S rDNA, phylogenetic analysis of 16S rRNA and rp gene, which is related to Ca. Phytoplasma australasiae.


全 文 :第 !" 卷 第 # 期
$ % # % 年 # 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01 !",*/1 #
2345,$ % # %
猪屎豆丛枝病植原体的分子检测与鉴定
李 6 永 6 徐启聪 6 田国忠 6 郭民伟 6 朴春根
(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 6 国家林业局森林保护学重点实验室 6 北京 #%%%7#)
关键词:6 猪屎豆丛枝病;植原体;分子鉴定;序列测定
中图分类号:&!8$1 !6 6 6 文献标识码:,6 6 6 文章编号:#%%# 9 :!;;($%#%)%# 9 %#"8 9 %"
收稿日期:$%%; 9 #$ 9 #:。
基金项目:国家科技基础条件平台建设项目($%%<=>,$#$%:)和国家自然科学基金项目(8%!:#878)资助。
!朴春根为通讯作者。
!"#$%&#’( )*$+,-.-%’,-"+ ". /(",’#’(-’ 0-,%1$2’34(""5 617,"8#’25’
-? @/4A6 BC D?E/4A6 +?34 FC/GH/4A6 FC/ I?4JK?6 L?3/ ’HC4AK4
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9:2,(’%,:6 ’M/N303M?3 J?NEHKO’PQM//R SHTN/S03OR3( ’MUV) E/00KENKW XM/R Y3?434 LM/Z?4EK,J3O E03OO?X?KW 34W
?WK4N?X?KW QT OK[CK4E?4A NKEH4?[CKO 34W .?MNC30 \]-L5 +J/ W?XXKMK4N NTSK C4?ZKMO30 SM?RKM S3?MO /X SHTN/S03OR3 JKMK COKW
N/ 3RS0?XT 3 #1 ; ^Q XM3ARK4N /X #"& M=*, 34W 3 #1 8 ^Q XM3ARK4N /X (@ AK4K5 +HK L’\P3RS0?X?KW SM/WCENO JKMK E0/4KW 34W
OK[CK4EKW5 +HK MKOC0NO /X OK[CK4E?4A 34W H/R/0/AC/CO E/RS3M?O/4 J?NH /NHKM SHTN/S03OR3O OH/JKW NH3N ’M/N303M?3
J?NEHKO’PQM//R SHTN/S03OR3 OH3MKW 775 7 _ O?R?03M?NT J?NH SK34CN J?NEHKO’PQM//R SHTN/S03OR3 ?4 #"& M\*, AK4K 34W
775 7_ ?4 (@ AK4K5 ’M/N303M?3 J?NEHKO’PQM//R SHTN/S03OR3 ?O O/MNKW ?4N/ LK34CN J?NEHKO’PQM//R AM/CS( #"&M((),
#"&M((P,,3EE/MW?4A N/ NHK MKOC0NO /X .?MNC30 \]-L /X #"& M=*,,SHT0/AK4KN?E 3430TO?O /X #"& M\*, 34W (@ AK4K,JH?EH ?O
MK03NKW N/ =%A LHTN/S03OR3 3CONM303O?3K5
;$7 <"(*2:6 ’M/N303M?3 J?NEHKO’PQM//R SHTN/S03OR3;SHTN/S03OR3;R/0KEC03M ?WK4N?X?E3N?/4;OK[CK4E?4A
6 6 植原体( SHTN/S03OR3),原称类菌原体(I-‘),
在植物和昆虫中广泛分布,为无细胞壁原核微生物,
尚不能在人工培养基上离体培养。迄今,世界各地
已统计有 # %%% 多种植物自然感染植原体病害
(&KKRa00KM ") %:A,#77;),我国也报道了 #%% 多种植
物植原体病害(赖帆等,$%%;)。$% 世纪 7% 年代以
来,L’\ 及分子克隆等分子技术被应用于植原体的
研究以后,植原体检测、鉴定和鉴别技术有了很大的
发展,逐步确立了以核酸信息为主要依据的植原体
分类鉴定方法。根据 #"& M=*, 的 L’\ 产物的
\]-L 分析结果,植原体属被分成 #! 个组和 # 个未
确定组,8; 个亚组,候选种有 < 个,即 #"&M(( 的 =%A
LHTN/S03OR3 3CM34N?X/0?3 和 =%A LHTN/S03OR3
3CONM303O?3,#"&M.(( 的 =%A LHTN/S03OR3 XM3b?4?,以及
#"&MB(( 的 =%A LHTN/S03OR3 3COM30?K4OK 和 =%A
LHTN/S03OR3 c3S/4?ECR( -KK ") %:A,$%%%)。随着分
子生物学技术特别是测序技术的发展,植原体序列
信息迅速增多,为满足植原体分类鉴定要求,国际菌
原体研究计划植原体分类小组制定了植原体分类和
候选种鉴定的规则,分 : 条进行了描述,其中 # 条为
“如果某一植原体株系的 #"& M\*, 基因序列与已
经命名的植原体候选种的同源性小于 7:5 <_,则可
以描述成 # 个新的候选种”。此规则的发表为今后
植原体候选种的鉴定研究工作提供了理论依据,在
此论文中,植原体被分成了 #< 个组,$" 个候选种
( +HK (\L’I LHTN/S03OR3 d &S?M/S03OR3 U/M^?4A
+K3RPLHTN/S03OR3 N3b/4/RT AM/CS,$%%!),目前已发
表的候选种已有 8% 个( &3O^?3") %:5,$%%;)。随后,
虚拟 \]-L 也被应用于植原体的分类鉴定,并将植
原体属分成了 $; 个组(UK? ") %:A,$%%:)。另外植
原体的 (@ 核糖体蛋白基因的分类研究结果证明:(@
基因比 #"& M\*, 保守性差,可用于植原体属近缘
株系的区分和鉴定(I3MN?4?") %:A,$%%:)。
猪 屎 豆 ( =(’)%:%(/% @%::/3% ), 属 豆 科
(-KACR?4/OK3)猪屎豆属,多年生小灌木。原产于中
国福建、广东、云南、台湾以及印度、非洲、马来西亚
等地。分布于低海拔山野、路旁、荒地、干燥河床等
向阳处所,耐旱耐贫瘠,是农田和道路两旁边坡常见
林 业 科 学 !" 卷 #
的植物,也极适合栽种于田里当绿肥植物,茎叶可做
绿肥和饲料。戴月明等($%&$)在我国广东省博罗
县猪屎豆上发现丛枝病害的发生,并通过电镜证明
在病叶叶脉筛管内存在大小为 %’ ( $’’ )* 的植原
体细胞。李永等(+’’")应用 $", -./0 的序列同源
性,初步确定猪屎豆丛枝病植原体为植原体属,花生
丛枝组成员。本试验通过对猪屎豆丛枝病植原体
$", -./0 的序列分析、计算机虚拟 1234 分析以及
!" 基因序列分析,对猪屎豆丛枝病植原体进行了系
统的鉴定研究。构建的基于 $", -./0 的序列和 !"
基因序列系统发育树,探究猪屎豆丛枝病植原体与
花生丛枝病植原体亲缘关系。
!" 材料与方法
$5 $# 植原体样品 # +’’! 年从海南省三亚市鹿回头
公园采集猪屎豆丛枝样品,枝叶表现典型丛枝症状
的(图 $);本试验设阳性和阴性对照各 $ 个,阴性对
照为健康猪屎豆枝叶样品,采自海南省三亚市鹿回
头公园(图 +);阳性对照来自本实验室多年保存的
泡桐丛枝病组织培养苗。
$5 +# ./0 提取与 461 扩增 # ./0 提取:称取猪屎
豆丛枝样品、阳性对照和阴性对照的叶片各 ’5 7 8,
放入灭菌研钵,然后向研钵中倒入液氮冷冻叶片并
将其研碎,采用常规的 690: 法提取植物总 ./0,
于 ; +’ <保存备用。461 反应:应用 + 对植原体
的特异性引物分别以提取的 7 个植物总 ./0 为模
板进行 461 扩增,$", -./0 的引物对为 4$ = 4>(引
物序列和 461 反应条件详见 .?)8 #$ %&5 ,$%%$),!"
引物对 -@2$6 = -@( A)1$(引物序列和 461 反应条件
见 BC-DE)E #$ %&’,+’’>)。健康猪屎豆总 ./0 为阴
性对照模板和泡桐丛枝病组培苗总 ./0 为阳性对
照的模板。电泳检测:461 产物用 $F琼脂糖凝胶
电泳检测,电泳缓冲液为 $ G 90H,&’ I 电泳 $ J,
,K:1 L-??) !染色,用 ,M8?)? 凝胶成像系统观察
并记录电泳结果。
$5 7# $", -./0 和 !" 基因 461 产物的序列分析 #
将植原体 $", -./0 和 !" 基因的 461 产物经 ./0
纯化试剂盒(北京鼎国生物技术发展中心)纯化后,
连接到 4B.$&N9 载体上,用热击发法转化到大肠杆
菌(()*+#!,*+,% *-&,)中(.OP"),涂板培养 7> <倒置
培养 $" ( +’ J(选用抗生素为氨苄青霉素),挑取白
色菌斑于 3: 液体培养中 7> <摇床上震荡培养并
提取质粒,经 461 和酶切鉴定为阳性的重组质粒送
上海英骏生物技术有限公司测序。
$5 !# $", -./0 序列的虚拟 1234 分析 # 将猪屎豆
丛枝病植原体 $", -./0 序列和从 /6:A 核酸数据
库中调出的 $",-AA 组中 P 个亚组中具代表性的植原
体 $", -./0 序列(酶切序列名称、序列号、亚组信
息见表 $)输入 ./0QDC- P5 ’$ 软件,应用 L?)?RS?QD
程序对 " 种植原体的 $", -./0 序列进行限制性酶
切位点分析,从十几个限制性内切酶中筛选出了 7
个( .%#AAA,.)#A,/%0A ),并 应 用 C8C-TQ? L?U
,E*SUCDET) 程序输出酶切电泳图片,根据酶切片段的
大小和数量的异同来确定猪屎豆丛枝病植原体亚组
的分类地位。
$5 P# 序列同源性比较、系统发育树构建 # 分别从
/6:A 核酸数据库( JDD@: = = VVVW )XYEW )U*W )EJW 8TZ =
8RS?-M = 8RS?-MW [X8E)中调出 $P 个植原体组中具有代
表性的 ++ 个的 $", -./0 序列和 $+ 个 !" 基因序
列,以及 1*+-&#"&%)2% &%,3&%4,, 的 $", -./0 序列和
!" 基因序列。应用 ./0QDC-P5 ’$ 分析软件分别对所
选植原体 +7 个 $", -./0 序列和 $7 个 !" 基因序列
进行多序列同源性比对分析。应用分子进化遗传分
析软件 BHL075 $ 分别构建基于 $", -./0 序列、!"
基 因 序 列 的 分 子 系 统 发 育 树。 首 先 应 用
63\,903] 程序分别对所选 $", -./0 序列、!" 基
因序列进行对位排列,然后用邻接法( /^)构建
YTTDQ-C@ 分子系统有根树,组外对照为 1*+-&#"&%)2%
&%,3&%4,,。
#" 结果与分析
+5 $# 461 扩增结果 # 电泳结果显示:4$ = 4> 引物
对成功的从染病猪屎豆和阳性对照总 ./0 中均扩
增出特异性 ./0 片段,片段大小为 $ &’" Y@;
!"2$6 = !"( A)1$ 引物对从染病猪屎豆和阳性对照总
./0 中均扩增出$ +%! Y@的特异性 ./0 片段,而健
康猪屎豆总 ./0 均未扩增出特异性 ./0 片段(图
7)。此 + 对引物均为植原体特异性引物,而且扩增
./0 片段大小与预测片段大小相符,而阴性对照未
能扩增出特异性的 ./0 片段,排除污染的因素,可
以确定猪屎豆丛枝病是植原体侵染引起的。
+5 +# ./0 片断的序列分析 # $", -./0 序列测定
和分析结果显示,猪屎豆丛枝病植原体的扩增片段
长 为 $ &’" 个 核 苷 酸( L?):C)_ 登 录 号 为
H\"P’$&$),包括 $", -./0,$", ; +7, -./0 间区和
部分 +7, -./0 序列。猪屎豆丛枝病植原体与花生
丛枝病植原体(L?):C)_ 登录号为 377>"P)和候选
种 5%W 4JMDT@UCQ*C CSQD-CUCQEC?(L?):C)_ 登录号为
K$’’%>)同源性最高,均为 %%5 %F,与候选种 5%’
4W CS-C)DE[TUEC(L?):C)_ 登录号为 \$P!!+)同源性
!"$
! 第 " 期 李 ! 永等:猪屎豆丛枝病植原体的分子检测与鉴定
图 "! 猪屎豆丛枝病症状
#$%& "! ’() *+,-./, /0 !"#$%&%"’% (%&&’)% $10)2.)3 4567
图 8! 健康猪屎豆
#$%& 8! ’() ()9:.(% !"#$%&%"’% (%&&’)%
为 ;<= >?;与 "@A5BC 组 候 选 种 !%* D(+./-:9*9
E59*$:$)1*)(F)1791G H#"I>>J<)同源性为 ;@= ;?;
与其他候选种的同源性为 <8? K ;8?。根据植原
体分类鉴定规定,即使与‘参考株’的 "@A 5LMH 基
因序列差别再小,也不能将其归‘属于’此候选种,
而 只 是 与 它 相 关( ’() NLD4O D(+./-:9*,9 P
A-$5/-:9*,9 6/5G$1% ’)9,QD(+./-:9*,9 .9R/1/,+
%5/S-,8JJI)。因此猪屎豆丛枝病植原体与 "@A5 NN
组 !%* D(+./-:9*9 9S*.59:9*$9) 候选种相关,与花生丛
枝病 亲 缘 关 系 最 近,与 候 选 种 !%* D(+./-:9*9
9S591.$0/:$9( "@A5 NN 组)和候选种 !%* D(+./-:9*9
E59*$:$)1*)("@A5BC 组)的亲缘关系较近。
"( 基因片段的序列分析结果显示,D4L 扩增片
段核苷酸序列长度为" 8;I E-(F)1791G 登录号为
TU@VJ"<8),包括核糖体蛋白基因 +88( "(&88)和 ,W
( "(-W)全部序列。猪屎豆丛枝病植原体与所选花生
丛枝组植原体间序列同源性均在 花生丛枝病植原体、苜蓿丛枝病植原体间的同源性
分别为 ;;= ?。与其他组所选序列同源性
分别在 @J? K >J? 间。证明猪屎豆丛枝病植原体
与花生丛枝病、苜蓿丛枝病植原体间关系最近,而苜
蓿丛植病与 !%* D(+./-:9*9 9S*.59:9*$9) 候选种相关,
是 "@A5NNQX 亚组成员,因此 "( 基因片段的序列分析
结果与 "@A 5XMH 序列分析的结果基本一致。
8= W! 虚拟 L#YD 分析 ! 虚拟 L#YD 分析结果见图 I
和图 V。图 I 为 @ 个植原体(植原体基本信息见表
")的 .-/N 酶切图,图 V 为 .%/NNN 和 0%1N 酶切图。W
个限制性内切酶的酶切片段中,猪屎豆丛枝病与
"@A5NNQH 亚组的花生丛枝病植原体所有的酶切片段
的大 小 和 数 量 完 全 相 同,而 "@A5NNQX 的 !%*
D(+./-:9*9 9S*.59:9*$9) 间仅有 .%/NNN 的酶切片段的
大小和数量相同,而 .-/N 和 0%1N 的酶切片段大小
和数量均有部分差异,与其他 W 个亚组("@A5NNQ7 亚
组的 !%& D(+./-:9*9 9S591.$0/:$9,"@A5NNQ4 亚组的
4/../1 -(+::/3+,"@A5NNQT 亚 组 的 D$25$* )2($/3)*
-(+::/3+)的 W 个内切酶的酶切片段大小和数量均有
部分差异。因此猪屎豆丛枝病植原体应属 "@A5NN,
"@A5NNQH 亚组的株系。
8= I! 系统发育分析 ! 用 OTFH W= " 软件的 MZ 法和
植原 体 "V 个 组 的 8W 个 "@A 5XMH 序 列 以 及
234#&/(&%-5% &%’)&%6’’ 的 "@A 5XMH 序 列 构 建 的
7//.*.59- 系统发育树如图 @(系统树自展值表示
" JJJ次重复检验得到的支持率)。7//.*.59- 检验的
结果表明:系统发育树各分支的自展值除 " 个分支
小于 VJ 以外(自展值为 IV),其他分支均高于 VJ,说
明所构建的拓扑结构置信度较高。进化树明显地分
成了 I 个大的稳定的分支,其中 " 个分支包括
"@A5NN 组的 @ 个植原体和 "@A5BC 组的候选种 !%*
D(+./-:9*9 E59*$:$)1*)。这个大的分支可再分成 8 个
分支," 个分支是候选种 !%* D(+./-:9*9 E59*$:$)1*),
另 " 个分支则包括 "@A5NN 组的 @ 个植原体,在这个
分支下又明显分成了 V 个小的分支,分别对应
"@A5NN 组的 V 个亚组,分别为 "@A5NNQH 亚组的
D)91S. [$.2()*"QE5//, 和 45/.9:95$9 [$.2()* "QE5//,、
"@A5NNQ7 亚组的 !%& D(+./-:9*9 9S591.$0/:$9,"@A5NNQ4
亚 组 的 4/../1 -(+::/3+、"@A5NNQX 亚 组 的 !%&
D(+./-:9*9 9S*.59:9*$9) 和 "@A5NNQT 亚 组 的 D$25$*
)2($/3)* -(+::/3+。因此 45/.9:95$9 [$.2()*"QE5//, 与
D)91S. [$.2()* "QE5//, 遗传进化关系最近,其次为
!%& D(+./-:9*9 9S*.59:9*$9)。
利用植原体的 "W 个 "( 基因序列以及 2*
&%’)&%6’’ 的 "( 基因序列构建的 7//.*.59- 系统发育
树如图 >(系统树自展值表示" JJJ次重复检验得到
的支持率)。7//.*.59- 检验的结果表明:系统发育树
各分支的自展值除 " 个分支小于 VJ 以外(自展值为
V@"
林 业 科 学 !" 卷 #
!"),其他分支均高于 $%,说明利用 !" 基因序列构建
的拓扑结构置信度也很高。从图中可知:&’ 个植
原体分成了 " 个稳定的分支,其中 & 个大的分支包
括 ( 个 &")*++ 组的植原体(&")*++,- 亚组的 ./0123
45367/89,:*;;< 和 =*;30>0*50 45367/8 ",:*;;<,&")*++,?
亚组的 @5A7B>>;CB,&")*++,D 亚组的 E;<03; :5F :2C 和 ->G0>G0
45367/8",:*;;<,#$H .7B3;A>080 0283*0>0850/ 和 &")*++,I
亚组的 .56*58 /675;C/8 A7B>>;CB。!" 基因的遗传进化
图与 &") *DJ- 的遗传进化图基本一致,=*;30>0*50
45367/8",:*;;< 与 ./0123 45367/8",:*;;< 遗传进化关
系最近,其次为 &")*++,D 亚组的 E;<03; :5F :2C 和
->G0>G0 45367/8",:*;;<。
表 !" 用于虚拟 #$%& 分析的序列信息
’()* !" ’+, -./-01(2-3. 3/ 4,56,.7,4
64,8 9-026(: #$%&
植原体
.7B3;A>08<08
K/1?01L
序列号
J;H
亚组名称
J0./0123 45367/8",:*;;< @’’("$ &")*++,-( ++,-)
#$H .7B3;A>080 02*0135G;>50 M&$!!N &")*++,?( ++,?)
=;33;1 A7B>>;CB IO&P"PN( &")*++,=( ++,=)
#$H .7B3;A>080 0283*0>0850/ Q&%%R( &")*++,D( ++,D)
.56*58 /675;C/8 A7B>>;CB Q&"’R’ &")*++,I( ++,I)
=*;30>0*50 45367/8",:*;;< IM"$%&P& —
图 ’# .=S 产物电泳结果
O5FH ’# .=S 05G5/C A*;C263 ;G A7B3;A>08<0
& T ’:&") *DJ- .=S 产物 .=S A*;C263 ;G &") *DJ-;
! T ":!" 基因 .=S 产物 .=S A*;C263 ;G !" F/1/;
&,!:阴性对照 D58/08/ 6;13*;>;
N,$:=*U?;’,":健康对照 V/0>37B 6;13*;>H
图 !# &") *DJ- 虚拟 SO@. 分析结果
O5FH !# E7/ */82>38 ;G &") *DJ- W5*320> SO@. 010>B858
%&’(:++,-,=*U?,++,?,++,=,++,D,++,IH
图 $# &") *DJ- 虚拟 SO@. 分析结果
O5FH $# E7/ */82>38 ;G &") *DJ- X5*320> SO@. 010>B858
左图 @/G3:%$’!:YU,++,-,=*U?,++,?,++,=,++,D,++,I;右图 S5F73:)$*":YU,++,-,=*U?,++,?,++,=,++,D,++,IH
;" 结论与讨论
戴月明等(&RP&)通过电镜证明发生在我国广
东省博罗县猪屎豆丛枝病害的病叶叶脉筛管内存在
大小为 R% Z &%% 1< 的植原体细胞,此研究仅仅利用
电镜证明猪屎豆丛枝病病原菌为植原体,未对病原
菌进行深入研究。李永等(N%%")应用 &") *DJ- 的
同源性分析,初步确定猪屎豆丛枝病植原体为植原
体属,花生丛枝组成员,并未对其分类地位进行深入
系统的研究和报道。本研究在前人研究的基础上,
利用 &") *SJ- 和 !" N 个基因的序列分析、系统发
育树构建以及 &") *DJ- 序列的虚拟 SO@. 分析等
方法从分子水平上对猪屎豆丛枝病植原体进行了系
统鉴定。猪屎豆丛枝病植原体为 &")*++,&")*++,- 亚
组的株系,与候选种 #$+ .7B3;A>080 0283*0>0850/ 相
关,与花生丛枝病植原体的遗传进化关系最近,其次
为 #$H .7B3;A>080 0283*0>0850/。
在细菌中,&") *SJ- 基因和核糖体蛋白基因
( !")是细菌进化演变的 N 个重要基因,是系统发育
的重要信号。本研究基于 N 基因构建的系统发育
""&
! 第 " 期 李 ! 永等:猪屎豆丛枝病植原体的分子检测与鉴定
! ! !
图 #! 基于 "#$ %&’( 序列构建的系统 ’) 树
*+,- #! ./01,2324+5 4%22 51364%75428 9+4: ’) ;24:18 "#$ %&’( 62?723526
图 @! 基于 !" 基因序列构建的系统发育 ’) 树
*+,- @! A:/01,2324+5 4%22 51364%75428 9+4: ’) ;24:18 !" &’( 62?72352
@#"
林 业 科 学 !" 卷 #
树主要分支的顺序有差异,$"% &’() 基因系统发育
树,组外对照 !" #$%&#$’%%,然后是 $"%&** 组植原体,
而 () 基因系统发育树则距离最外对照 !" #$%&#$’%%
最远,详细的分支也不是完全平行的,但是进化树中
的植原体间的遗传进化关系基本一致。+,&-./. 等
(0112)在植原体株系关系和系统发育研究中,发现
$"% &’() 和 () 基因构建的系统发育树主要分支的
顺序基本一致,但详细的分支并不完全平行,() 基
因可能比 &’() 基因承受着更快的变异速度,因此
() 基因系统发育树能描绘出更详尽的遗传进化关
系,能揭示更多有价值的信息和系统发育的标记,用
于 &’() 基因不易区分的近缘株系的研究。0 基因
构建的系统发育树中 $"%&** 组植原体分支的 3 个小
的分支是平行的,而且 4&5-,6,&., 7.-89:; "<=&55> 和
?:,/@- 7.-89:;"<=&55> 都在一个小的分支上。说明
4&5-,6,&., 7.-89:;"<=&55> 和 ?:,/@- 7.-89:;"<=&55> 遗
传进化关系非常近。
A:.(0112)等认为 ’BC? 仍然是 $ 个很好的工
具。原因有 D 个,一是已经建立了权威的植原体
’BC? 分类系统和分类模式;二是虽然以序列分析
为基础的同源性比较、遗传进化分析都可以用于植
原体株系的分类鉴定,但 ’BC? 仍然是 $ 个很好的
微生物多样性研究和分类鉴定的工具;另外虚拟
’BC? 方法方便快捷,而且更加准确,可以更好地应
用于植原体的分类鉴定的研究。
酸枣(*+,-(,.),/&%$. $0%##$(%.)是民间公认的野
生宿主,酸枣和枣树间可以通过嫁接传染病菌(温
秀军等,0113),根据 $"% &E() 序列和 123 序列分析
结果推测枣疯病( F@F@=: 7.-89:;"<=&55>)和酸枣丛枝
病(A.6G H@F@=: 7.-989:;"<=&55>)为同一个种的不同
寄主生物学型(王海妮等,0112 年)。根据本研究序
列分析的结果推测,猪屎豆和花生的关系很可能与
酸枣和枣树的关系大小,猪屎豆是花生丛枝病植原
体的野生宿主。植原体可通过嫁接和昆虫媒介传
播,传播媒介昆虫主要为叶蝉和木虱(?9I66.; -1 $#",
011")。花生丛枝病植原体的传毒虫媒为小绿叶蝉
(45),$.6$ 3#$7-.6-/.),其成虫的最短获毒饲育时间
为 0! 9 以内,虫体循徊期 J K $$ 天,带毒成虫和若
虫可终身传毒。陈慕容等($JJ!)认为此病的发病
率的高低很可能与豆科绿肥种植面积有关。花生为
$ 年生植物,而植原体不能靠种子和土壤传播,因此
花生丛枝病的发生和流行必须有野生的病菌传播
源。猪屎豆是农田和道路两旁边坡常见的绿肥植
物,发生丛枝病后,韧皮部的植原体病菌可常年存活
和繁殖,是花生丛枝病植原体理想的野生寄主。对
海南岛植原体病害调查,在发生猪屎豆丛枝病的地
块,也发现臭矢菜丛枝及其他豆科植物丛枝病的发
生,而花生种植的农田附近也有猪屎豆和臭矢菜丛
枝病的发生,因此猪屎豆极有可能是花生丛枝病植
原体的野生寄主。
本研究为花生丛枝病的病原菌的传播源的确定
提供了分子依据,但不能肯定花生丛枝病的病原菌
的转主寄主就是猪屎豆,因此有必要开展病原传播
媒介,嫁接传毒等生物学方面的研究。通过进一步
的分子证据和生物学实验证明栽培花生丛枝病与猪
屎豆丛枝植原体之间的关系,将有助于海南豆科植
物植原体病害流行规律的揭示和病害的防治。
参 考 文 献
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(责任编辑 # 王艳娜)
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