全 文 ：第 49 卷 第 7 期
2 0 1 3 年 7 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 7
Jul．，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20130708
收稿日期: 2012 － 06 － 18; 修回日期: 2013 － 03 － 29。
基金项目: 国家自然基金项目(31100445 和 31070531)和中央高效基本科研业务专项资金项目(DL12CA05)和黑龙江省博士后科研启动
金(415288)。
* 范桂枝为通讯作者。
H2O2 介导真菌诱导子促进白桦酯醇积累
*
孙美玲 李晓灿 王晓东 詹亚光 范桂枝
(东北林业大学生命科学学院 哈尔滨 150040)
摘 要: 以产白桦酯醇的白桦悬浮细胞系为试材，利用药理学试验，结合高效液相色谱和荧光显微镜技术，探讨
过氧化氢(H2O2 )在拟茎点霉属真菌诱导子促进白桦酯醇积累中的作用。结果表明: 外源 H2O2 降低了细胞的活力
和干质量的积累量，却提高了白桦酯醇的含量。其中，1 mmol·L － 1 H2 O2 处理 12 h，白桦酯醇的含量比对照增加
89. 45%，0. 1 mmol·L － 1 H2 O2 处理 24 h，白桦酯醇的含量比对照增加 73. 72%。真菌诱导子促进了白桦悬浮细胞中
H2O2 和白桦酯醇的生成，在处理 24 h 时，分别比对照增加 391. 67%和 185. 22%。H2O2 的清除剂过氧化氢酶减弱
真菌诱导子对 H2O2 和白桦酯醇的诱导效应。由上述结果初步推断，H2O2 参与了真菌诱导子诱导白桦酯醇积累的
过程。
关键词: 白桦; 白桦酯醇; 真菌诱导子; 过氧化氢; 拟茎点霉属
中图分类号: S718. 46; Q943. 1 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)07 － 0057 － 05
H2O2 Mediated Synthesis of Betulin in Cells of Betula platyphylla
Induced by Fungal Elicitor
Su Meiling Li Xiaocan Wang Xiaodong Zhan Yaguang Fan Guizhi
(College of Life Science，Northeast Forestry University Harbin 150040)
Abstract: The role of H2O2 in the synthesis of betulin in cells of birch (Betula platyphylla) induced by fungal elicitor
was studied using suspension cell lines as the test materials． The results showed that the exogenously applied H2O2
decreased the cell viability and dry weight accumulation，however promoted the synthesis of betulin． Of them，the content
of betulin was increased by 89． 45% under treatment with 1 mmol·L － 1 H2O2 for 12 h，and was increased by 73． 72%
under treatment with 0． 1 mM H2O2 for 24 h． The fungal elicitor increased the synthesis of H2O2 and betulin by 391． 67%
and 185． 22%，respectively． H2O2 scavenger catalase ( CAT ) significantly decreased induction effects of the fungal
elicitor in H2O2 and betulin production in the birch cells and the contents reduced by 73． 10% and 35． 96% ． The results
suggested that H2O2 participated in the fungal elicitor-induced synthesis of betulin in birch cells．
Key words: Betula platyphylla; betulin; fungal elicitor; H2O2 ; Phomopsis
白桦酯醇(betulin)是具有羽扇豆烷型结构的五
环三萜类化合物，分子式为 R CH2OH。白桦酯醇
与白桦酯酸( betulinic acid)具有相同的五环三萜骨
架，是白桦酯酸合成的前体化合物。目前，白桦酯酸
主要通过白桦酯醇的半合成获得 (范桂枝等，
2008)。近年来的研究表明，白桦酯醇、白桦酯酸具
有镇咳祛痰、清热利湿、消肿解毒、提高机休免疫力、
降血脂等作用，更重要的是白桦酯酸作为天然药物
在抗肿瘤和抗 HIV 等活性上显示出了靶向作用性
更强，几乎无不良反应等特点( Suresh et al．，2012;
Kommera et al．，2011; Chintharlapalli et al．，2007)。
对白桦酯醇、白桦酯酸提取和测定的研究发现，
白桦酯酸在植物中含量极低，仅为 0. 084% ( Zhao
et al．，2007)，而白桦酯醇在植物中含量较高，特别是
在白桦 (Betula platyphylla)树皮中含量达132. 45 ～
257. 11 mg·g － 1 (范桂枝等，2007)。由于白桦自然
资源有限，从白桦树皮中提取和分离白桦酯醇不仅
造成白桦资源的破坏，而且作为新型药剂的临床研
究，特别是推广应用的数量受到限制。
白桦酯醇和齐墩果酸等三萜物质可以在白桦愈
林 业 科 学 49 卷
伤组织中积累(范桂枝等，2007; 2011; Fan et al．，
2010)，同时，从多种白桦内生真菌中筛选到了有效
提高三萜积累的真菌诱导子种类，并优化了其诱导
条件(Zhai et al．，2011，翟俏丽等，2011)。而真菌
诱导子诱导次生代谢物合成是一个复杂的生物学过
程，受众多内源信号分子调控。过氧化氢(H2O2 )被
认为是真菌诱导子诱发植物细胞防卫反应的主要胞
内信使物质之一(徐茂军等，2006)，H2O2 是否介导
真菌诱导子诱导白桦酯醇积累的研究还未见报道。
本文分析外源 H2O2 和真菌诱导的内源 H2O2 对白
桦酯醇积累的调控作用，不仅证实 H2O2 对白桦酯
醇的调控作用，而且对理解真菌诱导子诱发植物次
生代谢产物合成的信号转导机制具有重要意义。
1 材料与方法
1. 1 白桦悬浮细胞系的培养
产白桦酯醇的白桦悬浮细胞系由本实验室选
育。悬浮细胞的培养基为 NT 附加 0. 1 mg·L － 1
6-benzyladenine( 6-BA ) 和 0. 01 mg·L － 1 thidiazuron
(TDZ)以及 20 g·L － 1蔗糖，灭菌前调 pH 5. 5 ～ 6. 0。
250 mL 摇瓶中盛有 100 mL 培养液，每瓶接种 4 g 鲜
质量的愈伤组织，培养温度为 25 ～ 27 ℃，光照强度为
2 000 lx，光照 16 h·d － 1，摇床转速为 120 r·min － 1。试
验中所用的白桦悬浮细胞已经过 50 ～ 60 次继代培
养，具有稳定的形态特征和生长速率。
1. 2 外源 H2O2 的添加
将 0(CK)，0. 1 和 1 mmol·L － 1无菌的 H2O2 溶
液添加到培养 8 天的白桦悬浮培养体系中，在处理
后 12，24，48 和 96 h 取样测定白桦悬浮细胞的活
力、干质量和白桦酯醇的含量。对照加入等体积的
无菌水，每种处理重复 3 次。添加的 H2O2 溶液采
用无菌的 0. 45 μm 微孔滤膜进行过滤除菌。
1. 3 拟茎点霉真菌诱导子的添加
将白桦内生真菌的菌丝在 PDA 液体培养基中
发酵培养 10 天，将菌体匀浆，121 ℃ 高压灭菌
20 min后作为真菌诱导子加入白桦悬浮培养液中，
诱导子质量浓度以糖质量浓度表示，以葡萄糖为标
准，用蒽酮比色法测定(李合生，2000)。
将 40 μg·mL － 1拟茎点霉真菌诱导子添加到培养
8 天的白桦悬浮培养体系中，在处理 24 h 后分析白桦
悬浮细胞的活力和三萜含量(翟俏丽等，2011)，对照
加入等体积的无菌水，每种处理重复 3 次。
1. 4 过氧化氢清除剂过氧化氢酶(CAT)的添加
CAT 溶液经 0. 45 μm 微孔滤膜过滤除菌后添
加，使其终浓度为 2 mkat·L － 1，在添加清除剂后
20 min添加真菌诱导子，对照加入等体积无菌水，每
种处理重复 3 次。
1. 5 白桦酯醇的提取和测定
将收获的白桦悬浮细胞烘干、研磨，取 0. 5 g 用
盐酸 －乙醇溶液(配比为 2 ∶ 8)25 mL 浸泡过夜，加
热回流 3 h，过滤，水浴浓缩提取液，再用乙醚萃取提
取液 3 次，萃取液经旋转蒸发仪回收溶剂，得到白桦
酯醇粗品，再用甲醇溶解并定容，取定容液 1 mL，并
将其用 0. 45 μm 滤膜过滤作为样品检测液。
色谱条件检测条件为: 色谱柱 HiQ sil C18V
4. 6 mm × 250 mm; 流动相乙腈 (乙腈与水体积比
4∶ 1); 柱温 25 ℃ ; 灵敏度 16AUFS; 流速 1. 0 mL·
min － 1; 检测波长 210 nm，进样 20 μL (范桂枝等，
2007)。白桦酯醇与其他组分完全分离，保留时间
合适，峰形好(图 1)，适合定量分析。
以白桦酯醇为对照品做标准曲线。以白桦酯醇
质量浓度(Y)为纵坐标，吸光度值( A)为横坐标，得
回归方程 Y = 0. 000 000 3X + 0. 003，相关系数
R2 = 0. 999 6，在 2. 0 ～ 8. 0 g·L － 1具有良好的线性
关系。
图 1 白桦酯醇的色谱
Fig． 1 HPLC chromatogram of betulin in B． platyphylla
1. 6 细胞活力的测定
取白桦悬浮细胞鲜样 0. 20 g，加入 2. 5 mL 现配
的 0. 4% 氯化三苯四氮唑 ( TTC)，再加入 2. 5 mL
PBS 缓冲液( pH7. 0)，常温下暗处理 14 h。去除上
清溶液，用 5 mL 蒸馏水清洗细胞，待细胞沉淀静止
后，吸去上清再次洗涤细胞，共重复 3 次。用 5 mL
95%乙醇脱色处理，于 60 ℃水浴 30 min，每隔 5 min
轻晃倒置试管摇匀。待细胞沉淀后用紫外分光光度
计测定上清溶液的 OD 值，OD 值大则细胞活力强
(王博等，2008)。
1. 7 H2O2 的荧光检测
H2DCF-DA ( carboxy-2， 7-dichlorodihydrofluore-
scein diacetate) 购自 Sigma 公司，将待测细胞用蒸馏水
清洗，加入 H2DCF-DA 使其终浓度为 50 μmol·L － 1，避
85
第 7 期 孙美玲等: H2O2 介导真菌诱导子促进白桦酯醇积累
光放置于 26 ℃下孵育 2 h，取出后使用 pH7. 4 的
Tris-HCl 洗掉细胞表面的荧光探针，利用荧光显微
镜的激发滤光片波长 488 nm，阻断滤光片波长 515
nm 观察，每个试验重复 5 ～ 10 次 (张小莉等，
2009)。
2 结果与分析
2. 1 外源 H2O2 对白桦悬浮细胞生长和白桦酯醇
含量的影响
将 0. 1 和 1 mmol·L － 1 H2O2 分别添加到培养 8
天的白桦悬浮培养体系中，分析 H2O2 处理对白桦
悬浮细胞活力、干质量和白桦酯醇含量的影响 (图
2)。0. 1 和 1 mmol·L － 1 H2O2 处理均降低白桦细胞
的活力和干质量的积累量，并且均随 H2O2 处理时
间的延长降低幅度增大。其中，1 mmol·L － 1 的
H2O2 比 0. 1 mmol·L
－ 1 H2O2 降低幅度大，H2O2 处
理 96 h，白桦细胞活力和干质量分别降低 61. 02%
和 25. 16%。对白桦酯醇含量的分析发现，1 mmol·
L － 1 H2O2 处理 12 h 后，白桦酯醇含量比对照增加了
89. 45%，而后随着处理时间的延长降低至对照水
平。0. 1 mmol·L － 1 H2O2 处理后白桦酯醇含量呈先
增加后降低趋势，在处理后 24 h 增加率最高，比对
照增加 73. 72%。
2. 2 真菌诱导子对白桦悬浮细胞中 H2O2 含量的
影响
DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞
膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成二氯
荧光素(DCFH)。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而
使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可
以氧化无荧光的 DCFH 生成有荧光的 DCF，因此
DCF 荧光强弱反应细胞内 H2O2 的含量。白桦细胞
中 H2O2 的荧光强度随真菌处理时间的延长先增强
后减弱，其中，细胞内 H2O2 的荧光强度在真菌处理
12 和 24 h 后，分别比对照增加了 517. 18% 和
391. 67% (图 3)。由此可见，真菌诱导后白桦悬浮
细胞中 H2O2 的含量增加。而在真菌诱导前20 min
添加 H2O2 清除剂过氧化氢酶(CAT)后，细胞中的
H2O2 的荧光强度从真菌诱导后的 74. 39 降低到
20. 01，但仍高于对照水平。
2. 3 真菌诱导子对白桦悬浮细胞活力和白桦酯醇
含量的影响
由图 3 和翟俏丽等(2011)可知，真菌诱导子处
理后白桦悬浮细胞中 H2O2 含量和白桦酯醇含量均
增加了，且白桦酯醇含量在 24 h 时达最高值，因此
H2O2 介导真菌诱导子促进白桦酯醇积累的研究选
图 2 外源 H2O2 对白桦悬浮细胞活力、
干质量和白桦酯醇含量的影响
Fig． 2 Effect of H2 O2 on cell viability，dry mass and
betulin content in cells of B． platyphylla
择真菌诱导子处理 24 h。
真菌诱导子处理 24 h 后，白桦悬浮细胞的活力
比对照降低 27. 63%，而在真菌诱导子处理前20 min
添加 H2O2 的清除剂过氧化氢酶(CAT)，白桦悬浮
细胞的活力比真菌诱导后增加 12. 66%。真菌诱导
子使白桦酯醇积累增加的 185. 22%，却被添加的
CAT 降低了 35. 96% (图 4)。
3 结论与讨论
H2O2 是植物体内一种常见的信号分子，在植物
生长发育和抗逆过程中起重要作用。H2O2 和次生
代谢物的累积均是植物逆境下的表征，二者是否有
关联呢? 杨芳等 ( 2011 ) 研究发现，10 μmol·L － 1
H2O2 处理下丹参(Salvia miltiorrhiza)细胞中丹参酚
酸比对照组的增加了 2. 43 倍，方芳等 (2009)发现
外源 H2O2只引起茅苍术(Atractylodes loncea)细胞中
苍术醇和 β －桉叶醇量的增加，而对其他的挥发油
积累没有促进作用。而本研究发现，外源 H2O2 促
进白桦酯醇的积累，1 mmol·L － 1 H2O2 处理 12 h，白
95
林 业 科 学 49 卷
桦酯醇含量比对照增加 89. 45%，0. 1 mmol·L － 1
H2O2 处理 24 h 比对照增加 73. 72%。由此可知，外
源 H2O2 对次生代谢物积累的影响存在种类效应、
浓度和时间效应。
图 3 真菌诱导子对白桦悬浮细胞中 H2O2 荧光强度的影响
Fig． 3 Effect of fungal elicitor on fluorescence intensity of H2 O2 in cells of B． platyphylla
A ～ D 为真菌处理 12，24，48 和 96 h，E 为真菌处理 + CAT，F 为对照;
不同字母表示差异显著(P ＜ 0. 05，Tukey 分析)。
Figures in the diagram for the optical density，A ～ D is for 12，24，48 and 96 h after
fungal treatment，E is fungal treatment + CAT，F is control． Different letters show
significant differences between means (P ＜ 0. 05，Tukey test) ．
真菌诱导子是来源于真菌的一种特定化学信
号，在植物与真菌的相互作用中，能快速、高度专一
和选择性地诱导植物特定基因的表达，进而活化特
定次生代谢途径，积累特定目的次生产物 (张莲莲
等，2006)。目前对真菌诱导子诱发植物细胞中次
生代谢产物合成积累的信号转导等分子机制尚不十
分清楚。一般认为真菌诱导子作为一种胞外刺激
物，首先与植物细胞膜上的特定受体识别并结合，进
而促进细胞产生一些特定的胞内信使物质并通过相
应的信号转导途径调控细胞核中相关基因的表达，
最终激活细胞中的防御性次生代谢系统。H2O2 的
迸发是植物细胞在各种生物及非生物逆境胁迫下普
遍出现的特征性反应之一，H2O2 被认为是真菌诱导
子诱发植物细胞防卫反应的主要胞内信使物质之一
(徐茂军等，2006)。本研究将真菌诱导子添加到白
桦悬浮体系中，发现白桦细胞中 H2O2 的荧光强度
和白桦酯醇含量均增加，而在真菌诱导子与 H2O2
清除剂(CAT)共同处理下，白桦悬浮细胞中白桦酯
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第 7 期 孙美玲等: H2O2 介导真菌诱导子促进白桦酯醇积累
图 4 真菌诱导子对白桦悬浮细胞活力和
白桦酯醇含量的影响
Fig． 4 Effect of fungal elicitor on cell viability and
betulin content in cells of B． platyphylla
不同字母表示差异显著(P ＜ 0. 05，Tukey 分析)。
Different letters show significant differences
between means (P ＜ 0. 05，Tukey test) ．
醇含量和 H2O2 的荧光强度均低于真菌诱导处理
的，由此可见，由真菌诱导子诱发产生的 H2O2 是白
桦细胞中白桦酯醇合成积累所必需的信号分子，这
与方芳等(2009)的研究一致，即内源 H2O2 介导了
内生真菌 AL4 粗诱导子促进茅苍术悬浮细胞挥发
油的合成，这初步证明 H2O2 参与了真菌诱导子促
进白桦酯醇积累的过程。
另外，笔者发现真菌诱导子虽然促进白桦酯醇
的合成，却抑制了白桦细胞的生长。在本试验中，外
源 H2O2 的添加降低白桦细胞的活力和干物质的积
累量，而真菌诱导子处理后细胞生长的抑制可被添
加的 CAT 部分缓解，因此推断，真菌诱导子激发的
H2O2 是抑制细胞生长的因子之一。
本试验结果同时表明，H2O2 的清除剂 CAT 虽
然可以抑制真菌诱导子处理后白桦酯醇的积累，但
不能完全阻断真菌诱导子对白桦酯醇积累的促进作
用，说明虽然 H2O2 是介导真菌诱导子促进白桦酯
醇积累的信号分子，但不是唯一的信号分子，这同时
也暗示真菌诱导子促进植物次生代谢物积累的复杂
性，需要检测更多的信号分子来揭示其诱导合成代
谢物的机制。
综上所述，本试验利用药理学试验推断 H2O2
参与真菌诱导子诱导白桦酯醇积累的过程，H2O2 如
何介导真菌诱导白桦酯醇合成的机制还有待于进一
步研究。
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