全 文 ：第 49 卷 第 5 期
2 0 1 3 年 5 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 5
May，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20130516
收稿日期: 2012 － 06 － 20; 修回日期: 2012 － 10 － 08。
基金项目: 中央高校基本科研业务费(YX2011-20) ;国家自然科学基金(C160901)。
* 王永林为通讯作者。
杨树炭疽病菌原生质体遗传转化的
建立及绿色荧光蛋白的表达*
李思蒙1 王永林1 黄冬辉2 田呈明1
(1. 北京林业大学林学院 省部共建森林培育与保护教育部重点实验室 北京 100083;
2. 河北秦皇岛经济技术开发区园林绿化管理处 秦皇岛 066004)
摘 要: 以杨树炭疽病菌菌株 C1-5-2 作为受体，通过 PEG 介导的原生质体转化法，将含有潮霉素 B(hph)和 GFP
表达基因的质粒 gGFP 转入杨树炭疽病菌菌丝的原生质体中。幼嫩菌丝在 0. 7 mol·L － 1 NaCl 溶解的 1% Lysing
enzyme 酶解液的作用下酶解 210 min 可以得到 108·mL － 1的原生质体; 在 PEG 介导下，通过含有潮霉素浓度为 300
μg·mL － 1的 PDA 选择培养基筛选转化子，每微克 DNA 获得 41 个转化子的平均转化效率。对转化子进行 PCR 鉴定
表明: hph 基因和 GFP 基因已经整合到杨树炭疽病菌转化子基因组中，通过荧光显微镜观察到转化子可以发出清
晰的绿色荧光，且转化子的潮霉素抗性和 GFP 表达性状可以稳定遗传。
关键词: 杨树; 炭疽菌; 遗传转化; 原生质体; 绿色荧光蛋白
中图分类号: S763. 11 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)05 － 0121 － 07
Establishment of a PEG-Mediated Genetic Transformation System and Expression
of Green Fluorescence Protein in Colletotrichum gloeosporioides
Li Simeng1 Wang Yonglin1 Huang Donghui2 Tian Chengming1
(1. Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education College of Forestry，Beijing Forestry University Beijing 100083;
2. Landscaping Management Office of Qinhuangdao Economic and Technological Development Zone Qinhuangdao 066004)
Abstract: We established a protoplasts transformation system mediated by polyethylene glycol (PEG)，in which poplar
anthracnose fungus Colletotrichum gloeosporioides strain C1-5-2 was used as the recipient，and obtained the transgenic
transformants expressing a green fluorescence protein (GFP) ． Protoplasts were mixed with the plasmid gGFP containing
the hygromycin phosphotransferase ( hph) gene and GFP gene with PEG treatment． Fresh hyphae of recipient strain
C1-5-2 were hydrolyzed in 20 mL enzyme solution containing 1% Lysing enzyme for 210 min，by which approximate 108
protoplasts·mL － 1 were obtained． Transformation frequencies of 41 transformants per μg DNA were achieved after being
screened on PDA medium containing hygromycin B concentration of 300 μg·mL － 1 ． The verification with gDNA PCR
amplifications indicated that the hph gene and GFP gene were indeed integrated into the genome of the C1-5-2 strain．
Fluorescence observation showed clear and strong expression of the green fluorescent protein in fungal structures，and the
GFP-tagged transformants were of genetic stability．
Key words: poplar; Colletotrichum; genetic transformation; protoplast; GFP
杨树(Populus)是一类优良树种，具有抗性强、
生长快、轮伐期短的特点，在生态公益林、防护林、商
品林以及园林景观建设等用途中具有重要作用。由
胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的杨
树炭疽病是杨树的重要病害之一(朱克恭，1989)，
病原菌主要侵染枝、叶，导致大片的杨树叶片枯死
(贺伟等，1991)。杨树炭疽病先后在北京、河南、河
北、山东、陕西、宁夏等地区发生，尤以毛白杨
(P． tomentosa)和北京杨(P． × beijingensis)等杨树受
害严重。
受林木生长发育特点和传统森林病理研究局限
性等的影响，种水平上森林病害的发生机制森林病
林 业 科 学 49 卷
理学研究尤为缺乏，阐明病程中寄主 － 病原物相互
作用的分子基础，揭示寄主、病原物与病程相关的基
因及其结构、表达和调控机制等病理学问题已成为
森林病理学亟需开展的研究工作。
炭疽菌(Colletotrichum)作为一种重要的模式病
原真菌，在病原学、寄主与病原互作、侵染结构分化
等研究方面具有重要的价值 ( Perfect et al．，1999;
Dean et al．，2012)。胶孢炭疽菌作为炭疽菌属中重
要的种，其侵染策略为半活体营养型，在植物中可进
行潜伏侵染(徐红梅等，2004)，侵入机制复杂，期间
涉及大量的基因参与不同阶段的表达调控，只有对
其进行分子手段为基础的功能基因组学研究，才能
更好地完善其寄主 －病原物互作的相关机制。炭疽
病菌的遗传转化将是研究其生长发育与致病过程分
子机制的有效工具，也是更好地开发及利用其基因
功能的有益特性的前提 (Weld et al．，2006; Dean
et al．，2012)。
常用的真菌遗传转化方法有 CaC12 /PEG 介导
的原生质体转化法(CaCl2 / polyethylene glycol) ( Liu
et al．，2012)、电穿孔转化法( Tanaka et al．，2011)、
基因枪转化法(Djulic et al．，2011)、限制性内切酶介
导转化法(REMI)(Turgeon et al．，2010)和根癌农杆
菌介导的转化方法(ATMT)(Santhanam，2012)。最
早在 1987 年，Rodriguez 和 Yoder 利用带有 amdS +
基因和 hph 基因的质粒使用原生质体转化法成功转
化了菜豆炭疽菌 ( C． lindemuthiaum) ( Rodriguez et
al．，1987)。随后，包括原生质体转化法在内，电穿
孔转化法(Robinson et al．，1999)、限制性内切酶介
导的 ( Thon et al．，2000 ) 和根癌农杆菌介导的
(OConnell et al．，2004)转化方法被相继应用于不同
的炭疽菌遗传转化系统的建立中。目前，将基因绿
色荧光蛋白(GFP)和合适的转化系统结合起来，有
效地监控基因的活性并分析基因的功能，成为了研
究植物病原真菌与寄主互作的一种非常有效的非染
色技术(Rohel et al．，2001)，在炭疽菌中同样适用
(Horowitz et al．，2002)。真菌 PEG 介导的原生质体
转化是一种传统的转化方法，其基本的转化步骤为:
原生质体的制备，转化过程中外源 DNA 的吸收，选
择培养基中菌丝的再生。这种方法虽然存在一些潜
在的缺点，包括需要制备高浓度的原生质体、相对较
低的转化效率、产生部分瞬时转化子和多拷贝整合，
但是由于其具有简便有效的操作步骤、简单的试验
设备和较低的成本、稳定的核分裂以及受体种群的
广泛性等明显优势在不断优化下一直应用至今，成
为获得转化子的最普遍的转化技术 ( Case et al．，
1979; Olmedo-Monfil et al．，2004; Weld et al．，2006;
Liu et al．，2012)。
因此，本研究建立了 PEG 介导的杨树炭疽病菌
原生质体转化系统，并且获得了性状能够稳定遗传
的 GFP 转化菌株，旨在为研究杨树炭疽病菌致病相
关基因提供有效便捷的工具，如在只构建 1 次载体
的情况下进行大量基因的敲除; 同时为探索该病菌
侵染杨树的相关机制奠定基础，以期寻求控制该病
害的有效途径。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 供试菌株及质粒 供试菌株为本实验室保
存的杨树炭疽病菌的强致病性菌株 C1-5-2，按常规
方法保存在 PDA 培养基上。含潮霉素 B 抗性的质
粒 gGFP 购自 FGSC (Kansas City，KS，USA)，携带
有分别以 trpC 和 gpd 为启动子的 hph 基因和 GFP
基因。
1. 1. 2 主要试剂及培养基 原生质体缓冲液: 1%
Lysing enzyme，用 0. 7 mol·L － 1 NaCl 作为稳渗液制
备。STC 溶液: 20% 蔗糖，50 mmol·L － 1 Tris-HCl
(pH8. 0)，50 mmol·L － 1 CaCl2，去离子水充分溶解，
高压蒸汽灭菌。PTC 溶液: 60% PEG4000 溶于 STC
中，高压蒸汽灭菌。潮霉素 B 购自生工生物工程
(上海)有限公司，使用终浓度为 300 μg·mL － 1。
PDA 固体培养基(常规方法配制)，TB3液体培
养基(酵母提取物 3 g、酪蛋白氨基酸 3 g、蔗糖20%、
1 L 蒸馏水)，TB3固体培养基(TB3液体培养基中加
入 0. 65% ～ 0. 75%琼脂)。
1. 2 杨树炭疽病菌对潮霉素 B 的敏感性测定
C1-5-2 培养 4 天后，沿菌落边缘用直径为 5 mm
的打孔器打取菌丝块，转接到潮霉素 B 浓度分别为
0，100，150，200，250 和 300 μg·mL － 1的 PDA 培养基
上，置于 25 ℃ 培养箱中生长 4 天，观察记录生长
情况。
1. 3 杨树炭疽病菌原生质体的制备及转化
1. 3. 1 杨树炭疽病菌原生质体的制备 用 4 mL
TB3液体培养基收集杨树炭疽病菌的分生孢子约
4 × 108个，接种于 100 mL TB3液体培养基中，25 ℃摇
床 150 r·min － 1培养 24 h，双层纱布过滤收集菌丝。
将幼嫩菌丝用 0. 7 mol·L － 1 NaCl 冲洗 2 次，置于
20 mL原生质体缓冲液中，30 ℃摇床 70 r·min － 1酶解
3. 5 h。双层 Miracloth(Calbiochem，USA)，过滤收集
原生质体于离心管中，冷冻离心机3 000 r·min － 1，
4 ℃ 下离心 10 min。去上清，1 mL STC 悬浮，
221
第 5 期 李思蒙等: 杨树炭疽病菌原生质体遗传转化的建立及绿色荧光蛋白的表达
5 000 r·min － 1室温下离心 5 min 再次收集原生质
体，去上清，加入 STC 悬浮原生质体，使终浓度达到
108·mL － 1备用。
1. 3. 2 杨树炭疽病菌原生质体的转化 在 50 mL
离心管中加入 30 μL gGFP 质粒 DNA，再加入
250 μL上述制备的原生质体，轻弹混匀，室温放置
20 min，分 2 次加入 1. 2 mL 的 PTC 溶液，轻弹混匀，
室温放置 20 min。先加入 3 mL TB3液体培养基，翻
转混匀，静置 2 min，再加入 5 mL TB3液体培养基，
翻转混匀，静置 2 min。将离心管倾斜 60°放入摇床
中固定，70 r·min － 1，20 ℃下过夜培养 12 ～ 14 h，进
行菌丝再生。第 2 天显微镜观察再生情况后，向离
心管中加入潮霉素浓度为 250 μg·mL － 1的 25 mL
TB3固体培养基，颠倒混匀，倒 2 个平板，置于 25 ℃
恒温培养箱中黑暗培养。
1. 3. 3 杨树炭疽病菌转化子的获得 待菌落从
TB3培养基上长出后，用潮霉素浓度为 300 μg·mL
－ 1
的 PDA 培养基覆盖，25 ℃培养。2 ～ 3 天后将长出
的单菌落转接到含有潮霉素 300 μg·mL － 1的 PDA
培养基上，25 ℃培养。将继续生长的转化子单胞纯
化，－ 70 ℃保存。
1. 4 杨树炭疽病菌转化子的 PCR 鉴定
从纯化后的转化子单孢菌株菌落上切出 20 ～
30 个边长 2 mm 菌丝块培养于 CM 液体培养基中，2
天后使用 CTAB 法提取液培的转化子和野生型菌株
基因组 DNA，分别用潮霉素特异性引物和 GFP 特异
性引物进行 PCR 扩增，鉴定阳性转化子。PCR 扩增
hph 基因的引物为 hph-sec ( 5-GCGAAGAATCTCG
TGCTTTC-3) 和 hph-for ( 5-GATGTTGGCGACCT
CGTAT T-3)。PCR 扩增 GFP 的引物为 GFPfor(5-
ATGGTG AGCAAGGGCGAGGAG-3) 和 GFPrev ( 5-
TTACTTG TACAGCTCGTCCATG-3)。
1. 5 杨树炭疽病菌转化子的稳定性检测
将阳性转化子转接于没有潮霉素选择压力下的
PDA 培养基上，生长 6 天后，再次转接，连续培养 5
代后，转接到含有潮霉素(300 μg·mL － 1 )的 PDA 培
养基上观察转化子是否对潮霉素保持抗性，并用荧
光显微镜观察 GFP 表达是否存在衰减现象。
1. 6 转化子 GFP 荧光的观察
取在 PDA 培养基上培养至产孢的转化子菌落，
挑取分生孢子和菌丝，在荧光显微镜 ( Leica DM
2500 的激光显微镜系统，装备有 474 /40 nm 激发波
长和 505 /40 nm 吸收波长的 Leica 数字相机 DFC
425C)下观察。使用 75% 的乙醇浸泡边长为 2 cm
的洋葱(Allium cepa)表皮，进行孢子萌发试验，在 2，
4，6，8，10，12，24 h 时观察洋葱表皮上孢子萌发产生
的附着胞和菌丝。
2 结果与分析
2. 1 杨树炭疽病菌对潮霉素 B 的敏感性
培养 4 天后，在不含有潮霉素的对照组 PDA 平
板中，杨树炭疽病菌野生型菌落平均直径为3. 92 cm
(图 1A)。在含有潮霉素的选择培养基中，潮霉素浓
度为 100，150，200，250，300 μg·mL － 1的菌落平均直径
依次为 1. 49，1. 31，1. 15，0. 99，0. 50 cm(图 1B ～ F)，
说明潮霉素可以有效抑制野生型杨树炭疽病菌的生
长。当潮霉素浓度达到 300 μg·mL － 1时，能够完全
抑制菌丝生长，因此，将后续试验中杨树炭疽病菌转
化子的筛选浓度确定为 300 μg·mL － 1。
2. 2 杨树炭疽病菌转化子的获得及筛选
转化过程中，当原生质体浓度达到 108·mL － 1时
(图 2B)，显微镜观察菌丝再生效果良好 (图 3A)，
即可获得相对较多的转化子。依据覆盖后的含有潮
霉素(300 μg·mL － 1)的初筛平板上再次长出的单菌
落计算转化效率，结果显示: 在加入质粒 DNA 为
10 μg时，平均获得 414 个转化子，平均转化效率为
41 个转化子·μg － 1 DNA。将转化子的单菌落挑出，
转接到潮霉素浓度为 300 μg·mL － 1的 PDA 平板上
再次筛选，小部分转化子生长速度缓慢且一定大小
后停止生长，初步分析可能由于质粒 DNA 插入位点
不同或在有丝分裂过程中基因片段丢失，引起表达
量过低或产生杂合体，导致其停止生长。
2. 3 杨树炭疽病菌阳性转化子的鉴定及遗传稳定
性分析
随机挑取 10 个纯化后的转化子基因组 DNA 和
野生型菌株C1-5-2的基因组 DNA 作为模板，用 PCR
方法鉴定其是否含有插入的潮霉素标记基因和 GFP
表达基因。以质粒 gGFP 和野生型菌株C1-5-2分别
作为正负对照，用潮霉素特异性引物 hph-sec / for和
GFP 特异性引物 GFPfor / rev 分别扩增 hph 和 GFP
基因片段，结果表明: 10 个转化子和作为阳性对照
的质粒 gGFP 均能扩增出预期条带，而作为阴性对
照的野生型 C1-5-2 则不能得到扩增条带 (图 4 )。
由 PCR 扩增结果可以得出结论，潮霉素抗性基因和
GFP 表达基因已经成功插入到转化子染色体中。
将鉴定后的 10 个转化子转接到不含有潮霉素
选择压力的 PDA 培养基上，培养 6 天，连续转接 5
代，然后再转接到含有潮霉素 (300 μg·mL － 1 ) 的
PDA 培养基上生长，生长速度没有发生变化，并且
仍然发出绿色荧光。
321
林 业 科 学 49 卷
图 1 杨树炭疽病菌对潮霉素 B 的敏感性
Fig． 1 Sensitivity of C． gloeosporioides C1-5-2 isolate to hygromycin B
A － F． 潮霉素浓度依次为 0，100，150，200，250，300 μg·mL － 1。
A － F． Concentrations of hygromycin B at 0，100，150，200，250 and
300 μg·mL － 1，respectively．
图 2 杨树炭疽病菌原生质体
Fig． 2 Protoplasts of C． gloeosporioides
A．优化前原生质体数量为 106·mL － 1 ; B． 优化后原生质体数量
超过 108·mL － 1 (标尺: 10 μm)
A． 106 protoplasts·mL － 1 ; B． More than 108 protoplasts·mL － 1 ．
(Bar: 10 μm) ．
2. 4 杨树炭疽病菌 GFP 转化子的荧光观察
荧光显微镜下观察原生质体的再生菌丝，通
过与明亮视野下的观察(图 3A)进行对比，表明部
分再生菌丝已表达荧光 (图 3B)。为了证实上述
经鉴定整合了 GFP 的转化子能够表达绿色荧光，
随机选择一个转化子在 PDA 培养基上培养至产生
大量分生孢子，收集孢子和菌丝在荧光显微镜下
观察。杨树炭疽病菌分生孢子可以发出很强的绿
色荧光(图 5A)，单独放大一个孢子可以看到整个
孢子具有绿色荧光，中心的细胞核处荧光更强(图
5C)，与明亮视野下显微镜观察的形态一致 (图
5B)，菌丝和分生孢子梗均能发出明亮的荧光(图
5F)，分生孢子盘在荧光显微镜下也全部可见 (图
5G)。将收集到的分生孢子接种至洋葱表皮上，4
h 时孢子开始萌发产生附着胞(图 5D)，与明亮视
野下显微镜观察形态一致(图 5E)。
3 讨论
本研究在借鉴禾谷镰刀菌 PEG 介导的原生质
体转化(Wiebe et al．，1997)、禾生炭疽菌 REMI 转化
法(Thon et al．，2000)等丝状真菌原生质体转化方
法(Liu et al．，2012)的基础上，通过不断优化，成功
实现了 PEG 介导的杨树炭疽病菌的转化，得到了 41
个转化子·μg － 1DNA 的平均转化效率。1988 年禾生
炭疽菌(C． graminicola)原生质体转化效率为 13 个
转化 子·μg － 1 DNA ( Panaccione et al．， 1988 )，
Poplawski 等(1997)使用 5 种质粒对柱花草炭疽菌
(C． gloeosporioldes)进行原生质体转化，发现不同质
粒和相同质粒不同加入量下得到的转化效率差异悬
殊。近年来对建立不同寄主植物的胶孢炭疽菌转
化体系的研究中，多数研究使用了农杆菌介导的
转化方法(De Groot et al．，1998; 方丽，2005; 曾大
兴等，2006; 林春花等，2009; 张俊等，2011 )。
虽然这种方法可以得到很高的转化效率，1 次转化
可以得到大量突变体，便于突变体库的建立。但
是对于作为后续进行基因敲除等研究的基础，需
要反复构建载体以适合不同的敲除片段。所以本
试验在建立杨树炭疽病菌转化系统时使用了 PEG
介导的原生质体转化法，以便于简化后续致病基
因研究中的工作量。
在原生质体的制备阶段，原生质体的数量直接
影响转化效果，包括菌丝量、菌龄、酶解液的选择、酶
解时间、离心参数的设定等都对原生质体的数量产
生显著影响。YEPD 液体培养基是很多丝状真菌转
化中的菌丝培养液，但在本试验中对于杨树炭疽病
菌，使用 TB3液体培养基所获得的菌丝更多，并且菌
龄为 24 h 的菌丝生理状态最佳，释放的原生质体活
力最强。使用 1. 2 mol·L － 1 KCl 制备酶解液通常可
以得到理想的酶解效果，但试验中原生质体数量始
终无法超过 103·mL － 1。后使用 0. 7 mol·L － 1NaCl 溶
解 Lysing enzyme 制备原生质体缓冲液使原生质体
数量明显增加。酶解 120 min 后，每 15 min 记录 1
次原生质体数量，发现从 210 min 开始原生质体数
量基本不再增加，此时室温下 4 000 r·min － 1 离心
5 min可以得到 106·mL － 1的原生质体(图 2A)，同时
发现有相当数量的原生质体死亡，初步判断由于原
生质体自身非常脆弱，在裂解酶的破坏和稳渗液的
保护同时存在下，对外界压力非常敏感。在对离心
参 数 进 行 调 试 后 发 现，当 离 心 参 数 设 为
3 000 r·min － 1，4 ℃，离心 10 min 时，原生质体数量
能够达到 108·mL － 1以上(图 2B)。
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第 5 期 李思蒙等: 杨树炭疽病菌原生质体遗传转化的建立及绿色荧光蛋白的表达
图 5 杨树炭疽病菌 GFP 转化子的绿色荧光观察
Fig． 5 Green fluorescence of GFP-tagged C． gloeosporioides isolate
分生孢子(A，C)，分生孢子萌发产生附着胞(D，箭头所示)，菌丝和分生孢子梗(F)，分生孢子盘(G) ; 在明亮视野
下分生孢子(B)和萌发产生附着胞(E)。(标尺: B，C，D，E 10 μm，A，F，G 25 μm)
Conidia(A and C)，appresorium germinated from conidium (D，arrow)，mycelia and conidiophores(F)，acervulus (G)
viewed under fluorescence microscopy． (Bar: B，C，D，E 10 μm，A，F，G 25 μm)
图 3 杨树炭疽病菌原生质体的再生菌丝
Fig． 3 Regeneration of protoplasts of C． gloeosporioides
A．明亮视野下观察结果; B． 荧光显微镜观察结果。(标尺:
25 μm)
A． View under brightfield; B． View under fluorescence microscopy．
(Bar: 25 μm)
在原生质体转化过程中，PEG 的凝聚作用是原
生质体吸收外源 DNA 的关键。研究发现: 溶解
PEG 的缓冲液中 CaCl2浓度对 PEG 发挥作用至关重
要。使用浓度为 50 mmol·L － 1 CaCl2配制的 STC 溶
液溶解 PEG 得到的 PTC 溶液，能够使原生质体和质
粒 DNA 的凝聚效果达到最好。初步分析，可能当
Ca2 +浓度低时，不能保持原生质体膜内外的电位平
图 4 杨树炭疽病菌转化子 PCR 鉴定
Fig． 4 PCR identification of transformants of C． gloeosporioides
A． 潮霉素特异性引物扩增结果，在 605 bp 处得到扩增条带;
B． GFP 特异性引物扩增结果，在 720 bp 处得到扩增条带。M．
Marker(DL2000) ; 1． gGFP 质粒; 2． 阴性对照; 3 － 12. 10 个转
化子。
A． Amplification of gene hph， and the sizes was 605 bp; B．
Amplification of gene GFP，and the size was 720 bp．
M． Marker ( DL2000 ) ; 1． gGFP plasmid; 2． Negative control;
3 － 12． Ten randomly selected transformants．
衡，使原生质体生理活性下降。同时发现温度过高
可能影响菌丝再生，在 20 ℃条件下进行再生，过夜
摇培后再生的大量菌丝肉眼可见。
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林 业 科 学 49 卷
在获得突变再生菌丝后，使用有效的选择标记获
得转化子成为了关键步骤，本试验选用的为潮霉素 B
抗性标记基因 hph，是目前炭疽菌转化中使用最为广
泛的选择标记，对于黄瓜炭疽菌 ( C． lagenarium)
(Kojima et al．，2002)、鳄梨炭疽菌(C． gloeosporioides)
(Yakoby et al．， 2001 )、有 节 黧 豆 炭 疽 菌 ( C．
gloeosporioides)(Robinson et al．，1999)等的生长有良
好的抑制效果，抑制浓度为 50 ～ 100 μg·mL － 1。依据
杨树炭疽病菌对潮霉素 B 的敏感性测定结果笔者
将 300 μg·mL － 1定为筛选浓度，虽然可以达到预期
筛选效果，但是敏感性相对较小，使用浓度过高使试
验成本增加，不能作为最佳选择标记。
在杨树炭疽病菌转化系统成功建立的同时，转
化子的 GFP 荧光表达强而清晰，性状可以稳定遗
传，分生孢子和菌丝的生长发育没有发生变化，因此
可以为进行杨树炭疽病菌与杨树互作的相关研究提
供良好材料，如杨树炭疽病菌侵染杨树叶片过程中
的显微结构的观察。在对稻瘟菌 ( Magnaporthe
grisea)与寄主互作的研究中(Marcel et al．，2010)，
GFP 不仅可以示踪侵染过程，还可以监测侵染过程
中相关基因的表达，为证明病原真菌的侵染策略提
供初步的依据。同时，GFP 在定量检测植物组织中
病原物的数量和侵染过程中寄主植物抗性反应等方
面的应用潜力巨大。
随着分子生物学技术的高速发展，大量真菌及
寄主的全基因组成功测序，基因随机诱变和定向突
变技术作为研究真菌基因功能的有效工具，与不同
真菌的转化系统相结合便可对其进行遗传操纵，使
遗传转化在功能基因组学的研究方面做出巨大
贡献。
综上所述，PEG 介导的杨树炭疽病菌遗传转化
系统的建立，将为探索杨树炭疽病菌致病相关基因
功能与作用方式奠定基础，成为基因敲除的有力工
具，并且可以为阐明杨树炭疽病菌生长发育与致病
过程的分子机制提供强大的技术支持。
参 考 文 献
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贺 伟，杨 旺，沈瑞祥 ． 1991． 北京杨炭疽病的初步研究，森林病
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(责任编辑 王艳娜)
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