全 文 ：第 50 卷 第 10 期
2 0 1 4 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 10
Oct．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20141011
收稿日期: 2013 － 06 － 17; 修回日期: 2014 － 04 － 29。
基金项目: 国家自然基金项目(310600110) ; 内蒙古自然科学基金项目(2012MS0526)。
* 白淑兰为通讯作者。
浅黄根须腹菌 γ-actin基因的克隆及表达分析*
峥 嵘1，2 王琚钢1 邰丽华2 白淑兰1 牛艳芳1，2
(1．内蒙古农业大学林学院 呼和浩特 010019; 2．内蒙古师范大学生命科学与技术学院 呼和浩特 010022)
摘 要: 以油松的优良外生菌根真菌即浅黄根须腹菌为对象，用简并 PCＲ 法和 ＲACE 技术分离其 γ － 肌动蛋
白基因(Ｒl-act)的全长 cDNA 序列。该全长序列为 1 339 bp，包含一个 1 128 bp 的开放阅读框 (OＲF)，编码 375
个氨基酸，5端非翻译区(5UTＲ)95 bp，3UTＲ 长度 116 bp。Port Param 软件在线分析结果表明，该 cDNA 所编码
的蛋白质理论等电点为 5. 01，相对分子质量为 94. 929 kD，具有真菌 γ-actin 基因 3 个保守特征序列。Blast 同源
性检索结果表明，Ｒl-act 序列与 12 种担子菌 actin 序列同源性均在 97% 以上，与同为外生菌根真菌的双色蜡蘑
actin 的亲缘关系最近。Ｒl-act 基因在不同碳源及磷水平培养条件下表达量基本一致，验证了该基因作为分子内
标的可靠性。
关键词: 浅黄根须腹菌; 肌动蛋白; cDNA; 克隆; 基因表达
中图分类号: Q933 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)10 － 0080 － 06
Cloning and Expression Analysis of γ-actin Gene from Ｒhizopogon luteolus
Zheng Ｒong1，2 Wang Jugang1 Tai Lihua2 Bai Shulan1 Niu Yanfang1，2
(1 ． College of Forestry，Inner Mongolia Agricultural University Hohhot 010019;
2 ． College of Life Sciences and Technology，Inner Mongolia Normal University Hohhot 010022)
Abstract: In this paper，a superior ectomycorrhizal fungus，Ｒhizopogon luteolus of Pinus tabulaeformis’was used as the
research object． The fungus γ-actin gene(Ｒl-act) was isolated by using homology based method and ＲACE technique．
The results showed that the full-length sequences of Ｒl-act cDNA 1 339 bp which was consisted of a 1 128 bp opening
reading frame (OＲF)，encoding a protein of 375 amino acids，a 5-UTＲ with 95 bp and a 3-UTＲ with 116 bp． The
online analysis of Port Param software displayed that the putative amino acids had an isoelectric point of 5. 01，a molecular
weight of 94. 929 kD，and 3 highly conserved regions of γ-actin gene of fungi． Homology search indicated that the
homogeneity was more than 97% between Ｒl-act cDNA and 12 basidiomycetes actin sequence． Phylogenetic tree indicated
that it had closer relationship with Laccaria bicolor，an ectomycorrhizal fungus． In different culture conditions of carbon and
phosphorus level，the quantity expression of Ｒl-act was almost same，which validated the reliability of Ｒl-act as reference
gene in quantitative analysis of mＲNA expression． The research provided an internal standard for studying other stress
resistance genes’ expression and regulation in symbiosis of Ｒ． luteolus and P． tabulaeformis，and gave a theoretical
foundation for exploring the molecular mechanism in stress resistance．
Key words: Ｒhizopogon luteolus; actin gene; cDNA; gene cloning; gene expression
肌动蛋白 ( actin)是真核生物中广泛存在的一
种重要蛋白质，是构成细胞骨架和肌肉肌小节的主
要成分，执行着重要的生理功能，如细胞分裂、细胞
运动、细胞形状变化、内吞作用、胞吐作用，以及多种
细胞运动，如顶端生长、细胞器运动、胞质环流等
(Doherty et al．，2008)。该蛋白主要包括 α-actin，
β-actin 和 γ-actin 3 种类型，其中，α-actin 通常存在
于平滑肌细胞中，而 β-actin 和 γ-actin 则几乎在所
有细胞中存在。目前在高等真核生物中已报道了多
个不同的 actin 基因，在真菌中报道较多的是 γ-
actin 基因(卓侃等，2010)。actin 基因在各组织和
细胞中的表达相对恒定，是高度保守的管家基因，因
此，通常在实时定量 PCＲ、Northern 杂交和免疫蛋白
印迹中作为内参基因(Lin et al．，2012)。此外，actin
第 10 期 峥 嵘等: 浅黄根须腹菌 γ － actin 基因的克隆及表达分析
基因现已在植物界、动物界和真菌界作为分子系统
学研究的重要基因之一(Kapoor et al．，2008; 方玲
等，2013)。
浅黄根须腹菌(Ｒhizopogon luteolus)隶属于担子
菌亚门(Basidiomycotina)、腹菌目(Gasteromycetes)、
须 腹 菌 科 ( Ｒhizopogonaceae )、根 须 腹 菌 属
(Ｒhizopogon)，主要分布于云南、福建、内蒙古等地
(白淑兰，2011)。本研究所用菌株采集于内蒙古自
治区呼和浩特市大青山喇嘛洞干旱阳坡油松(Pinus
tabulaeformis)天然林中，通过子实体组织分离获得。
在实验室通过盆栽试验证实菌株对油松的侵染率达
80%，并对油松生长有显著的促进作用，同时能够显
著提高油松的抗旱能力，是油松的优良外生菌根菌
(Bai et al．，2009; 邵东华等，2013)。植物生理研究
仅揭示菌根真菌影响植物抗逆性的一些现象，但本
质上菌根真菌对于植物抗逆性的调节是基于对相关
基因表达的调控，即通过上调或下调某些基因的表
达以及诱导新的逆境基因表达来增强植物抗逆性
(李涛等，2012)。油松为典型菌根依赖型树种(白
淑兰，2011)，耐干旱贫瘠，逆境中油松的菌根共生
体可能通过调节一些抗逆相关基因的表达进而增强
油松的抗逆性。形成菌根的植株有 2 条吸收磷的途
径:一条是通过根系皮层细胞直接吸收;另一条是菌
根途径( Smith et al．，2010)。在菌根途径中，菌根
外延菌丝中大量表达的高亲和力磷酸盐转运蛋白发
挥着重要作用，可以帮助宿主植物吸收贫磷区的磷
(Bucher，2007)。另外，磷维持着植物根系的电导
率和皮层细胞膜电位，其缺乏不利于植物对水分的
吸收(王琚钢等，2012)。作为油松优良外生菌根真
菌的浅黄根须腹菌可能通过菌根途径最大限度地提
高了油松对环境中磷和水分的吸收。研究浅黄根须
腹菌的磷酸盐转运蛋白基因在不同水分条件和不同
胁迫处理条件下的变化规律，对于了解恶劣立地条
件下外生菌根真菌提高油松生存的分子机制非常重
要。作为前期研究，本研究以浅黄根须腹菌菌丝体
培养物为材料，用简并 PCＲ 法和 ＲACE 技术克隆了
浅黄根须腹菌 γ-actin cDNA 全长，并验证其作为内
标基因的可靠性，为研究浅黄根须腹菌与油松菌根
共生体的抗逆性相关基因表达和调控机制奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
浅黄根须腹菌通过子实体组织分离获得，现保
存于内蒙古农业大学林学院微生物实验室。
主要试剂: EASY spin Plus 植物 ＲNA 快速提取
试剂 盒 ( 北 京 艾 德 莱 生 物 科 技 有 限 公 司 );
GoldScript cDNA 合 成 试 剂 盒 ( invitrogen ); Midi
Purification Kit 离心柱型普通琼脂糖凝胶回收试剂
盒 (天根公司 ); 5 ＲACE 试剂盒 ( invitrogen );
SMAＲTerTM ＲACE cDNA Amplification Kit 试剂盒
(Clontech); Taq DNA 聚合酶 ( TAKAＲA); 克隆载
体 PMD19-T ( TAKAＲA ); 感 受 态 大 肠 埃 希 菌
(Escherichia coli)DH5α(TAKAＲA)。
1. 2 引物
根据已知大型真菌肌动蛋白基因序列，在其保
守区域设计简并引物 Ｒl-actF 和 Ｒl-actＲ，利用简并
PCＲ 扩增浅黄根须腹菌 γ-actin cDNA 核心片段; 根
据分离得到的核心片段序列，设计该基因的特异性
引物 GSP-1，GSP-2，GSP-3 和 GSP-4，GSP-5，用于 5
和 3-ＲACE-PCＲ。引物由上海生工生物技术公司
合成(引物序列见表 1)。
表 1 浅黄根须腹菌 γ-actin 基因 cDNA 克隆引物序列
Tab. 1 Primers used for cloning γ-actin
gene of Ｒhizopogon luteolus
目的片段
Fragment
名称
Name
序列(5 － 3)
Sequence(5-3)
核心片段
Ｒl-actF ATGGAＲGAＲGAＲGTYGCYGC
Ｒl-actＲ GGＲCCVGACTCGTCＲTACTC
5-ＲACE
GSP-1 AGAGTCCTTCTGTCCC
GSP-2 ATACCCACCATCACACCC TG
GSP-3 AAGCCAGCCTTGCACATGCC
3-ＲACE
GSP-4 GAAGGTCAAGATAGT TGCTCCTCCCG
GSP-5 CGAAAGTACTCCGTGTGGATTGGTGG
1. 3 总 ＲNA 的提取
采用 ＲNA 提取试剂盒提取浅黄根须腹菌总
ＲNA，利用紫外分光光度计测定其纯度和浓度，通过
琼脂糖凝胶电泳进行浓度和完整性检测。利用
GoldScript cDNA 合成试剂盒合成第一链 cDNA，具
体操作步骤参照试剂盒说明书。
1. 4 浅黄根须腹菌 γ-actin cDNA 全长扩增及产物
克隆、测序
核心片段扩增，以 cDNA 为模板进行 ＲT-PCＲ
扩增。反应体系(总体积 50 μL): 10 × PCＲ 缓冲液
5 μL，2 mmol·L － 1 dNTPs 3 μL，10 μmol·L － 1的上游
和下游引物各 2 μL，cDNA (约 30 ng) 5 μL，5 U·
μL － 1 Taq 酶 0. 5 μL，去离子水 32. 5 μL。反应条件:
94 ℃预变性 4 min; 94 ℃变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，
72 ℃延伸 1 min，35 个循环; 72 ℃延伸 10 min，4 ℃
保存。PCＲ 产物经 1. 0% 的琼脂糖凝胶电泳分离，
将目的 DNA 片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收
18
林 业 科 学 50 卷
纯化。
5 -ＲACE 扩增基因末端，采用 5- ＲACE 试剂
盒克隆浅黄根须腹菌 γ-actin 基因的 5端序列。参
照试剂盒说明，对总 ＲNA 进行目的基因第 1 链
cDNA 的合成，纯化后，对 cDNA 末端加上多聚 C。
用引物 GSP-2 和试剂盒内的桥连铆钉引物 AAP 对
已经加 dC 尾的 cDNA 进行 PCＲ 第 1 轮扩增。PCＲ
反应体系: 加 dC 尾的 cDNA 5. 0 μL，10 × PCＲ
buffer 5. 0 μL，25 mmol·L － 1 MgCl2 3 μL，10 mmol·
L － 1 dNTPs 1. 0 μL，10 μmol·L －的引物 GSP-2和桥连
铆钉引物 AAP 各 2. 0 μL，5 U·μL － 1 Taq 酶 0. 5 μL，
无菌去离子水补至 50 μL。反应程序: 94 ℃预变性
2 min; 94 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸
2 min，35 个循环; 72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。用引
物 GSP-3 和试剂盒内的桥连通用扩增引物 AUAP 进
行第 2 轮巢式 PCＲ 扩增。PCＲ 反应体系: 第 1 轮
PCＲ 产物 5. 0 μL，10 × PCＲ buffer 5. 0 μL，25 mmol
·L － 1 MgCl2 3 μL，10 mmol·L
－ 1 dNTPs 1. 0 μL，
10 μmol·L － 1的引物 GSP-3 和引物 AUAP 各 1. 0 μL，
5 U·μL － 1 Taq 酶 0. 5 μL，无菌去离子水补至 50 μL。
反应程序同上。将第 2 轮 PCＲ 产物进行电泳并对
目的条带进行切胶回收纯化。
3-ＲACE 扩增基因末端，参照 ＲACE 试剂盒说
明 书，使 用 逆 转 录 酶 SMAＲTScribeTM Ｒeverse
Transcriptase 和引物 3 CDS primer A 对总 ＲNA 进
行逆转录合成 cDNA。以上述合成的 cDNA 为模板，
用引物 GSP-4 和 UPM 进行第 1 轮 PCＲ 扩增。反应
体系: cDNA 2. 5 μL，引物各 1 μL，Maser Mix 41. 5
μL，无菌去离子水补至 50 μL，降落 PCＲ 反应程序:
94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 个循环; 94 ℃ 30 s，70 ℃
30 s，72 ℃ 3 min，5 个循环; 94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，
72 ℃ 3 min，27 个循环。将第 1 轮 PCＲ 扩增产物稀
释 50 倍，用引物 GSP-5 和 UPM 进行第 2 轮 PCＲ 扩
增，反应体系同上。反应程序: 94 ℃ 30 s，68 ℃
30 s，72 ℃ 3 min，20 个循环。将第 2 轮 PCＲ 产物
进行电泳，并对目的条带进行切胶回收纯化。
将上述 3 个纯化后的 PCＲ 产物分别与 pMD19-
T 连接，转化到感受态细胞大肠埃希菌 DH5α，菌落
PCＲ 检测阳性克隆后送至上海生工生物技术有限
公司进行测序。
1. 5 浅黄根须腹菌 γ-actin 表达分析
分别在不同碳源、磷水平条件下培养浅黄根须
腹菌菌丝体，进行其 γ-actin 的表达特异性分析。
PACH 培养基中分别选用不同碳源 (葡萄糖、麦芽
糖、蔗糖、D-山梨醇、可溶性淀粉); 用 0. 025，0. 05，
0. 1，0. 2，0. 4 和 0. 8 mmol· L － 1 6 个 水 平 磷
(KH2PO4)浓度，28 ℃培养菌丝体 20 天后提取菌丝
体总 ＲNA。以等量的 ＲNA 反转录 cDNA，取等量
cDNA 进行 ＲT-PCＲ 反应，再取等量的 PCＲ 产物进
行琼脂糖凝胶电泳，经过 3 次重复，通过比较目的条
带的灰度判定基因表达的强弱。
1. 6 序列比较与系统进化树构建
根据获得的 mＲNA 拼接序列，网上 Blast 搜索
同源性高的序列，进行同源性分析。利用 NCBI 的
OFＲ Finder ( http:∥ www． ncbi． nlm． nih． gov / gorf /
gorf． html)识别 OFＲ ( open reading frame)序列并推
定其所对应的氨基酸序列。使用 ExPASy 数据库的
PortParam 软件在线( http:∥ www． expasy． org / tools /
protparam． html ) 分析推定蛋白质基本性质。在
GenBank 中，搜索不同真菌的肌动蛋白序列，与浅黄
根须腹菌肌动蛋白序列进行 Clustal W 多重序列比
较，使用 MEGA5 软件邻接法 ( neighbor-joining，N-J
法) 运 算 1 000 次 构 建 系 统 进 化 树，用 自 展 法
(Bootstraping) 对进化树进行评估。
2 结果与分析
2. 1 总 ＲNA 的检测结果
取 10 μL ＲNA 样液，稀释 100 倍，在核酸蛋白
测定仪 ( Eppendrof BioPhotometer) 中检测，OD260 /
OD280为 1. 94 ～ 1. 96，OD260 /OD230为 2. 45 ～ 2. 60，说
明 ＲNA 纯度高，无蛋白质、酚污染，均一性很好。
电泳结果(图 1)表明，28S rＲNA，18S rＲNA 与
5S rＲNA 带形整齐，无拖尾，说明 ＲNA 完整性很好，
点样孔中及其附近也未发现有 DNA 的污染，证明提
取的 ＲNA 质量较高，可以用于后续的 ＲT-PCＲ。
图 1 ＲNA 电泳
Fig. 1 Agarose electrophoresis of ＲNA
M: DNA MarkerⅢ ．
2. 2 cDNA 全长的分析
分别用简并 PCＲ 法和 ＲACE 技术扩增出浅黄
根须腹菌肌动蛋白基因核心片段和 5端、3端片段
(图 2)。由图 2A 可知，在标准分子质量 1 kb 处出
28
第 10 期 峥 嵘等: 浅黄根须腹菌 γ － actin 基因的克隆及表达分析
现较亮的 DNA 条带，大小基本接近目的条带。但是
在样品体系中出现了非特异性条带，因此进一步纯
化回收了目的条带。由图 2B 和图 2C 可看出，分别
在标准分子质量 250 bp 处出现了较亮的单一条带，
表明得到的 5和 3末端片段大小为 200 ～ 250 bp。
阳性克隆子测序结果表明，浅黄根须腹菌肌动蛋白
基因中心片段和 5端、3端片段分别为 1 100 和
242，254 bp。经过全长拼接，浅黄根须腹菌肌动蛋
白基因的 cDNA 全长序列除 1 128 bp 的开放阅读框
(OＲF)外，还包含 5端95 bp的非编码片段和 3端
116 bp 的非编码片段，同时 3端有一个 27 个核苷酸
的 polyA 尾，将其命名为 Ｒl-act，cDNA 全长序列提交
GenBank，登录号为 KC995171。
图 2 简并 PCＲ 及 ＲACE-PCＲ 产物凝胶电泳
Fig． 2 Product of degenerate-PCＲ and ＲACE-PCＲ
M: DL2000 Marker;
A: 简并 PCＲ 结果 Product of degenerate PCＲ;
B: 5ＲACE-PCＲ 结果 Product of 5 ＲACE-PCＲ;
C: 3ＲACE-PCＲ 结果 Product of 3 ＲACE-PCＲ．
2. 3 氨基酸序列分析
利用 NCBI 的 OＲF finder 进行开放阅读框识别
后得知，Ｒl-act 包含一个完整的开放阅读框，起始密
码子为 ATG，终止密码子为 TAA，编码 375 个氨基
酸。该推测蛋白质的理论分子质量大小为 94. 929
kD，理 论 等 电 点 是 5. 01; 其 序 列 中
53 YVGDEAQSKＲG64， 357WCSKQEYDE365 和
104 LLTEAPLNPKANＲ116属于真菌 actin 蛋白的保守特
征序列。
根据 Ｒl-act 氨基酸序列，Blast 搜索出 12 种同源
性高的序列，其中，Ｒl-act 氨基酸序列与担子菌肌动
蛋白序列有较高的相似性。该序列与 Punctularia
strigosozonata、裂褶菌 ( Schizophyllum commune)、粗
毛硬革菌 ( Stereum hirsutum)、双色蜡蘑 ( Laccaria
bicolor) 4 种 真 菌 的 肌 动 蛋 白 氨 基 酸 序 列
( EIN04355， XP0030 26150， EIM-85406，
XP001884444)相似性最高，达 99%，其次与嗜蓝孢
孔 菌 属 的 Fomitiporia mediterranea、双 孢 蘑 菇
(Agaricus bisporusva)、干朽菌(Serpula lacrymans)、毒
蝇伞(Amanita muscaria)4 种真菌的肌动蛋白氨基酸
序 列 ( EKM82128， EJD00785， ABQ17974，
EGO04181) 相 似 性 达 98%，与 原 毛 平 革 菌 属
( Phanerochaete ) 的 Phanerochaete carnosa、皱 木耳
(Auricularia delicate)、乳牛肝菌 ( Suillus bovinus)等
真 菌 的 肌 动 蛋 白 氨 基 酸 序 列 ( EKM59011，
EJD35981，AF156258)相似性达 97%。
2. 4 不同碳源和磷水平培养条件下表达特性及稳
定性分析
半定量 ＲT-PCＲ 分析结果(图 3，4)显示，Ｒl-act
基因在不同碳源及磷水平条件培养的菌丝体中均表
达，且表达量基本一致，显示该基因的表达不受外界
环境影响。
图 3 不同碳源培养条件下 Ｒl-act 的表达
Fig． 3 The expression level of Ｒl-act in
different culture condition of carbon
1: 葡萄糖 Glucose; 2: 麦芽糖 Maltose;
3: 蔗糖 Sucrose; 4: D －山梨醇 D-sorbitol;
5: 可溶性淀粉 Soluble starch．
图 4 不同磷水平培养条件下 Ｒl-act 的表达
Fig． 4 The expression level of Ｒl-act in
different culture condition of phosphorus levels
1: 0． 025 mmol·L － 1 ; 2: 0． 05 mmol·L － 1 ;
3: 0． 1 mmol·L － 1 ; 4: 0． 2 mmol·L － 1 ;
5: 0． 4 mmol·L － 1 ; 6: 0． 8 mmol·L － 1 ．
2. 5 系统发育树的构建
为进一步探讨浅黄根须腹菌肌动蛋白与其他担
子菌(包括腐生型和外生菌根真菌)、丛枝菌根真菌
(AMF)和子囊菌肌动蛋白在分子系统学上亲缘关
系，根据 Ｒl-act 蛋白序列，在 GenBank 中搜索和参考
文献报道(卓侃等，2010; Thorunn et al．，2003)，获
得了 16 种真菌的肌动蛋白序列 (表 2 )。利用
MEGA5. 0 软件，通过 N-J 法运算1 000次，获得了浅
黄根须腹菌与上述 16 种真菌的肌动蛋白系统进化
树(图 5)。
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林 业 科 学 50 卷
表 2 GenBank 搜索得到的真菌及其肌动蛋白登录号
Tab. 2 Fungi and accession No． of actin from GenBank
微生物
Microorganism
肌动蛋白登录号
Accession No． of actin
微生物
Microorganism
肌动蛋白登录号
Accession No． of actin
双色蜡蘑 Laccaria bicolor XP-001884444 毒蝇伞 Amanita muscaria ABQ17974
乳牛肝菌 Suillus bovinus Q9Y701 黄孢原毛平革菌 Phanerochaete chrysosporium BAC79388
灰拟鬼伞 Coprinopsis cinerea XP-001839365 黄曲霉 Aspergillus flavus EED51260
灰绿犁头霉 Absidia glauca AAA32619 柄孢霉 Podospora anserina XP-001911932
马尔尼菲青霉菌 Penicillium marn effei XP-002153345 淡紫拟青霉 Paecilomyces lilacinus ADB44905
颖枯壳针孢 Phaeosphaeria nodorum XP-001791794 珍珠巨孢囊霉 Gigaspora margarita CAE01403
光壁无梗囊霉 Acaulospora laevis CAE01405 双紫盾巨孢囊霉 Scutellospora dipurpurescens CAE01410
Funneliformis caledonium CAE01402
从系统进化树可以看出，上述 16 种肌动蛋白序
列聚类为担子菌、AMF 和子囊菌 3 个分化群。本研
究的浅黄根须腹菌肌动蛋白聚在担子菌分化群，亲
缘关系依次与同为外生菌根真菌的双色蜡蘑、毒蝇
伞和乳牛肝菌的肌动蛋白近，与腐生型担子菌灰拟
鬼伞和黄孢原毛平革菌的肌动蛋白亲缘关系较远。
这在一定程度上可以说明能够形成外生菌根的真菌
肌动蛋白相似性较高，原因有待于进一步探讨。本
系统进化树中的 AMF 真菌肌动蛋白由 2 个次级分
化群组成，光壁无梗囊霉与 Funneliformis caledonium
聚为一支，珍珠巨孢囊霉与双紫盾巨孢囊霉聚为其
姊妹支。子囊菌肌动蛋白由 2 个次级分化群组成。
3 讨论
本研究通过简并 PCＲ 法和 ＲACE 技术首次克
隆了浅黄根须腹菌 γ － 肌动蛋白的 cDNA 全长序
列。该全长序列为 1 339 bp，包含一个 1 128 bp 的
开放阅读框(OＲF)，编码 375 个氨基酸，具有 actin
基因的保守特征序列，与前人报道的真菌 γ-actin 基
因特征一致 (Diez et al．，2001)。肌动蛋白最初是
1941 年在脊椎动物骨骼细胞中发现并命名的，在高
等真核生物中，一般情况下肌动蛋白由家族基因编
码，哺乳动物至少有 10 个由不同基因编码的肌动蛋
白异型体。除了大多数酵母菌和丝状子囊菌只有 1
个单一的肌动蛋白基因外，其他真菌有少数肌动蛋
白基因(朱雯雯等，2011)。从外生菌根真菌乳牛肝
菌克隆得到 2 个肌动蛋白基因，并通过试验证实其
肌动蛋白基因在营养菌丝及与宿主植物形成的菌根
共生体中表达恒定( Tarkka et al．，2000)，该基因可
以作为功能基因研究的内标参照。本试验也得到相
同结果，在不同碳源和磷水平培养条件下，Ｒl-act 表
达恒定。因此，本文 Ｒl-act 的获得可为将来浅黄根
须腹菌 － 油松菌根共生体功能基因的研究奠定
基础。
肌动蛋白基因高度保守，进化速率相对恒定，其
氨基酸残基替换率约为每亿年 1% (王丽等，
2012)，因此常被用作分子系统学研究的靶标基因。
本研究构建的肌动蛋白系统进化树中 16 种不同真
菌肌动蛋白聚为担子菌、AMF 和子囊菌 3 个分化
群，这一聚类结果与传统形态分类结果一致。另外，
担子菌类中生活方式相同的真菌其肌动蛋白亲缘关
系较近，即本研究中的浅黄根须腹菌肌动蛋白与另
外 3 种外生菌根真菌肌动蛋白亲缘关系很近，而与
另 2 种腐生型担子菌肌动蛋白亲缘关系较远，这一
结果非常值得深入探究。
将浅黄根须腹菌 Ｒl-act 蛋白序列与 Blast 搜索
出的高同源性序列进行比对分析发现，该序列与多
种担子菌肌动蛋白氨基酸序列高度相似，其中包括
双色蜡蘑、乳牛肝菌、毒蝇伞等外生菌根真菌。从它
们的分类地位看，4 种外生菌根真菌中浅黄根须腹
菌属于担子菌亚门、须腹菌目，而其他 3 种属于伞菌
目(Agaricales)。由聚类图可知，浅黄根须腹菌与双
色蜡蘑亲缘关系最近，但这 2 种菌形态及分类地位
差异较大。在肌动蛋白序列分析中不同目真菌聚为
一类，一方面可能表明其肌动蛋白在进化上具有高
度保守性，另一方面可能与外生菌根真菌本身的进
化有关，这些疑问是今后关注的热点。
本聚类结果在肌动蛋白序列上初步分析了浅黄
根须腹菌与其他 16 种真菌间的相互关系，但由于未
搜索到更多真菌肌动蛋白基因方面的信息，不能在
较低的分类阶元更好地反映浅黄根须腹菌的分类进
化地位，因此浅黄根须腹菌与其他真菌间的亲缘关
系有待于更进一步的研究。
参 考 文 献
白淑兰 ． 2011．菌根研究及内蒙古大青山外生菌根资源 ． 呼和浩特:
内蒙古人民出版社，160 － 161．
方 玲，刘歧莎，李 倩，等 ． 2013．肌动蛋白基因和 β －微管蛋白基
48
第 10 期 峥 嵘等: 浅黄根须腹菌 γ － actin 基因的克隆及表达分析
因用于真黏菌系统发育的可行性研究 ． 菌物学报，32 ( 6 ) :
1004 － 1011．
李 涛，陈保冬 ． 2012．丛枝菌根真菌通过上调根系及自身水孔蛋白
基因表达提高玉米抗旱性 ．植物生态学报，36(9) :973 － 981．
邵东华，杨喜平，张晓东，等 ． 2013．浅黄根须腹菌侵染油松形成外生
菌 ．生态学杂志，32(1) : 80 － 83．
王 丽，黎妃凤，张文波，等 ． 2012． 西伯利亚白刺肌动蛋白基因的分
离与特性分析 ．草业学报，21(4) :151 － 158．
王琚钢，峥 嵘，白淑兰，等 ． 2012． 外生菌根对干旱胁迫的响应 ． 生
态学杂志，31( 6) : 1571 － 1576．
朱雯雯，林晓飞，张文波，等 ． 2011．兴安落叶松肌动蛋白基因的分离
与序列分析 ．生物技术通报，(7) :95 － 100．
卓 侃，罗 梅，廖金玲，等 ． 2010． 淡紫拟青霉 γ-actin 基因 cDNA
全长的克隆与序列分析 ．植物保护，36(3) : 78 － 81．
Bai S L，Li G L，Liu Y，et al． 2009． Ostryopsis davidiana seedlings
inoculated with ectomycorrhizal fungi facilitate formation of
mycorrhizae on Pinus tabulaeformis seedlings． Mycorrhiza，19 (6) :
425 － 434．
Bucher M． 2007． Functional biology of plant phosphate uptake at root
and mycorrhiza interfaces． New Phytologist，173:11 － 26．
Diez B， Marcos A T， Ｒodrguez M， et al． 2001． Structural and
phylogenetic analysis of the γ － actin encoding gene from the
penicillin-producing fungus Penicillium chrysogenus． Current
Microbiology，42(2) : 117 － 121．
Doherty G J， McMahon H T． 2008． Mediation， modulation， and
consequences of membrane- cytoskeleton interactions． Annual
Ｒeview Biophysics，37: 65 － 95．
Kapoor P， Sahasrabuddhe A A， Kumar A， et al． 2008． An
unconventional form of actin in protozoan hemoflagellate，
Leishmania． Journal of Biological Chemistry， 283 ( 33 ) :
22760 － 22773．
Lin J，Ｒedies C． 2012． Histological evidence: housekeeping genes beta-
actin and GAPDH are of limited value for normalization of gene
expression． Development Genes and Evolution，222(6) :369 － 376．
Smith S E，Facelli E，Pope S， et al． 2010． Plant performance in
stressful environments: interpreting new and established knowledge
of the roles of arbuscular mycorrhizas． Plant and Soil，326:3 － 20．
Tarkka M T， Vasara Ｒ， Gorfer M， et al． 2000． Molecular
characterization of actin genes from homobasidiomycetes: two
different actin genes from Schizophyllum commune and Suillus
bovines． Gene，251(1) : 27 － 35．
Thorunn H， Irene J． 2003． Phylogeny of the glomerales and
diversisporales ( Fungi: Glomeromycota) from actin and elongation
factor 1-alpha sequences． FEMS Microbiology Letters，229 ( 1 ) :
127 － 132．
(责任编辑 朱乾坤)
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