全 文 ：第 wv卷 第 ts期
u s s z年 ts 月
林 业 科 学
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黄皮 ΛΕΑΦΨ同源基因的克隆与序列分析 3
郭永泽t 何新华t ou 李杨瑞u 罗 聪t
kt1 广西大学农学院 南宁 xvsssw ~ u1 广西农业科学院广西作物遗传改良与生物技术重点实验室 南宁 xvssszl
关键词 } 黄皮 ~ ΛΕΑΦΨ~克隆
中图分类号 }≥yyy1y ~ ±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszlts p stvs p sw
收稿日期 }ussy p s| p u{ ∀
基金项目 }广西自然科学基金k桂科自 sxwusuul和广西科学基金应用基础研究专项k桂科基 szvtswsl ∀
3 何新华为通讯作者 ∀
Χλονινγ ανδ Σεθυενχε Αναλψσισ οφ ΛΕΑΦΨ Ηοµολογουσ Γενεφροµ Χλαυσεναλανσιυµ
Š∏² ≠²±ª½¨ t ‹¨÷¬±«∏¤tou ¬≠¤±ªµ∏¬u ∏² ≤²±ªt
kt1 Χολλεγε οφ Αγριχυλτυρε o Γυανγξι Υνιϖερσιτψ Ναννινγ xvsssw ~ u1 Γυανγξι Χροπ Γενετιχ Ιµπροϖεµεντ ανδ Βιοτεχηνολογψ Λαβ o
Γυανγξι Αχαδεµψοφ ΑγριχυλτυραλΣχιενχεσ Ναννινγ xvssszl
Αβστραχτ } Χλαυσεναλανσιυµ o Χιτρυσσινενσι󤱧 Πονχιρυστριφολιατα ¥¨ ²¯±ª·²·«¨ §¬©©¨µ¨±·ª¨±∏¶²©•∏·¤¦¨¤¨ q’±·«¨ ¥¤¶¬¶²©
ΛΕΑΦΨkΛΦΨ¬± ¥µ¬¨©l ª¨ ±¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶²© Χq σινενσισ ¤±§ Πq τριφολιαταo¤ ³¤¬µ²©ut ¥³³µ¬°¨ µ¶º¤¶§¨¶¬ª±¨ §¤±§∏¶¨§·²
¤°³¯¬©¼ ¤¥²∏·¤u vss ¥³⁄‘„©µ¤ª°¨ ±·©µ²° Χqλανσιυµ ¥¼ °≤• q׫¨ ⁄‘„©µ¤ª°¨ ±·º¤¶¦¯²±¨ §¬±·²³⁄t{2× √¨ ¦·²µ¤±§·«¨ ±
¶¨ ∏´¨±¦¨§q׫¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ¤±¤¯¼¶¬¶¶«²º¨ §·«¤··«¨ ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ ¦¯²±¨ º¬·«u vwy ¥³¦²±·¤¬±¨ §¤¦²°³¯ ·¨¨ ¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨±¦¨ ²©
ΛΦΨ«²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ kΧλΛΦΨl º«¬¦«v ¬¨²±¶º¨ µ¨ ¦²°³²¶¨§²©¤¦²°³¯ ·¨¨§²³¨ ±µ¨¤§¬±ª©µ¤°¨ ¤±§ ±¨¦²§¨§v|z ¤°¬±²¤¦¬§¶q
׫¨ ¬§¨±·¬·¬¨¶²©±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶²© ΛΦΨ ª¨ ±¨ ¶¥¨·º¨ ±¨ Χq λανσιυµ º¬·« Χq σινενσισ ¤±§ Πq τριφολιατα º¨ µ¨ °²µ¨ ·«¤±
|u h o¤±§·«¨¬µ¬§¨±·¬·¬¨¶²©¤°¬±² ¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨¶º¨ µ¨ |x h q׫¨ µ¨¶∏¯·¤¯¶²¬±§¬¦¤·¨§·«¤·Χq λανσιυµ ΛΦΨ ª¨ ±¨ º¤¶²±¨
¤°¬±²¤¦¬§¯¨¶¶·«¤±·«¨ ΛΦΨ «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ¶©µ²° Χq σινενσισ ¤±§ Πq τριφολιαταq׫¨ µ¨¶¨¤µ¦« ¤¯¬§¤¶²∏±§©²∏±§¤·¬²± ©²µ
¶·∏§¼¬±ª·«¨ µ¨ª∏¯¤·¬²± ¤±§¦²±·µ²¯ ¬±©¯²º¨ µ¬±ª °¨ ¦«¤±¬¶°¬± Χqλανσιυµ ¤··«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¯ √¨¨ ¯¬±·«¨ ©∏·∏µ¨ q
Κεψ ωορδσ} Χλαυσεναλανσιυµ ~ ΛΕΑΦΨ~¦¯²±¬±ª
ΛΕΑΦΨk简写为 ΛΦΨl同源基因是控制花分生组织形成的基因之一 o并调控植物开花的时间k • ¬¨ª¨¯ ετ
αλqot||ul o是开花启动所必需的 o处于成花相关基因网络中比较关键的位置 o为转入生殖发育的中心调节
剂 o ΛΦΨ基因不仅参与花分生组织属性的决定 o还对抑制成花的 ΕΜΦ基因和 ΤΦΛ1基因起负调作用k王利琳
等 ousswl ∀毛果杨k Ποπυλυσ τριχηοχαρπαl !枳橙k Χιτρυσ σινενσισ ≅ Πq τριφολιαταl !烟草k Νιχοτινα ταβαχυµl !菊花
kΧηρψζαντηεµυµ µοριφολιυµl !水稻k Ορψζα σατιϖαl等植物中 o ΛΦΨ的超量表达均使花期提前k • ¬¨ª¨¯ ετ αλqo
t||x ~邵寒霜等 ot||| ~„«¨¤µ± ετ αλqousst ~ ‹¨ ετ αλqousst ~°¨ ±¤ ετ αλqousstl ∀如 °¨ ±¤等kusstl将拟南芥
kΑραβιδοπσιστηαλιαναlΛΦΨ基因转入枳橙 o得到的转基因枳橙当年开花 o且果实正常 o其种子当年播种 o翌年春
天即开花结果 ∀马月萍等kussxl对近 ts 年来 ΛΦΨ基因研究进展进行了综合分析 o从已报道的文献和
Š¨ ±…¤±®中的序列来看 o目前仅从 us多种植物中克隆出了 ΛΦΨ的全长基因 ∀研究 ΛΦΨ同源基因对于调节植
物开花 o了解果树童期的分子调控机制具有十分重要的意义 ∀
无核黄皮k Χλαυσεναλανσιυµl系芸香科黄皮属热带亚热带常绿果树 o是一种很有发展潜力的经济林果k潘
建平等 ousszl o其开花的分子机制尚未见报道 ∀作者克隆了无核黄皮k Χλαυσενα λανσιυµ l ΛΦΨ全长基因
kŠ¨ ±…¤±®登录号 ⁄±w|zssyl o比较芸香科k•∏·¤¦¨¤¨ l不同属植物 ΛΦΨ基因的异同 o为研究黄皮开花的分子调
控机制 o并通过转 ΛΦΨ基因来培育童期短的黄皮奠定基础 ∀
1 材料与方法
t1t 材料 tl植物材料 采自广西大学园艺系果树标本园 o以无核黄皮的叶片为材料提取基因组 ⁄‘„ ∀ul
菌株和质粒 大肠杆菌k Εσχηεριχηια χολιl׊t和质粒 ³˜≤t{广西大学园艺生物技术实验室保存 ∀vl化学试
剂 ³⁄t{2×载体 !§‘×° !פ´ ³¯∏¶⁄‘„ 聚合酶 !限制性内切酶 !Š¨ ±¨ • ∏¯ µ¨× tss ¥³ ⁄‘„ ¤¯§§¨µ³¯∏¶均购自
פŽ¤•¤公司 o÷Š¤¯ !Œ°×Š !氨苄青霉素k„°³l购自上海生物工程公司 ~其他试剂均为国产分析纯试剂 ∀wl寡核
苷酸引物 根据 Š¨ ±…¤±®上已知甜橙k Χιτρυσσινενσισl和枳壳k Πονχιρυστριφολιαταl的 ΛΦΨ全长基因k„≠vv{|zy !
„≠|zs{uv 和 „≠|zs{uwl设计 t 对引物 o上游引物 }xχ2Š„„ŠŠ≤„„׊Š„≤≤≤ŠŠ„„Š≤2vχ o下游引物 }xχ2
„≤×≤≤Š≤≤≤„„„×≤≤„×≤≤××2vχ o委托捷瑞生物工程k上海l有限公司合成 ∀
t1u 方法 tl基因组 ⁄‘„与质粒 ⁄‘„的提取 用改良 ≤ׄ…法提取叶片基因组 ⁄‘„作为模板k‹¨ ετ αλqo
ussxl ∀碱法小批量抽提质粒k奥斯伯等 ousswl ∀ul°≤• 扩增 在 ׫¨µ°²¦¼¦¯¨ µ°≤• 仪中扩增 o采用 us ˏ反
应体系 }ts °°²¯#pt ×µ¬¶2‹≤¯ k³‹ {1vl oxs °°²¯#pt Ž≤¯ ot1x °°²¯#pt ª≤¯ u os1u °°²¯#pt °¬¬¨ §§‘×° o
上 !下游引物各 s1ux Λ°²¯#pt ot ˜ µ×¤´ ⁄‘„聚合酶 kפ®¤µ¤ …¬²·¨¦«±²¯²ª¼o¤³¤±l o模板 ⁄‘„约 ys ±ª∀扩增
参数为 }|w ε 预变性 x °¬±~|w ε 变性 t °¬±oxu ε 退火 t °¬±ozu ε 延伸 u °¬±ovx个循环 ~zu ε 延伸 ts °¬±∀
vl⁄‘„片段重组入质粒载体 °≤• 产物在 t h的琼脂糖凝胶上电泳 o用 …¬²¶³¬± Š¨ ¯ ∞¬·µ¤¦·¬²± Ž¬·从凝胶上回
收 !纯化目的条带 ∀将回收产物连接到 ³⁄t{2×载体上 o连接产物转化大肠杆菌 ׊t菌株感受态细胞 o通过
蓝白斑筛选 !°≤• 验证 !质粒长度对比和酶切鉴定获得重组质粒k萨母布鲁克等 oussul ∀wl⁄‘„序列测定与
分析 委托捷瑞生物工程k上海l有限公司测序 o用 Š¨ ±…¤±® …„≥×和 ≤˜≥ׄ• kt1{vl分别进行相似性搜
索和同源性分析 ∀
2 结果与分析
u1t °≤• 产物的获得和克隆 利用自行设计的一对引物 o通过 °≤• 扩增 o从无核黄皮叶片基因组 ⁄‘„中扩
增出 t条约 u vss ¥³的 ⁄‘„片段 ∀将该片段纯化后 o连接至 ³⁄t{2×载体 o转化大肠杆菌 ׊t菌株 ∀通过
°≤• 和双酶切k Εχο• ´和 Ηιν§¶l鉴定 o获得重组质粒 o命名为 ³⁄t{2≤¯ ƒ≠k图 tl ∀
图 t 凝胶电泳图
ƒ¬ªqt Š¨ ¯ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶°¤³
 qŠ¨ ±¨ • ∏¯ µ¨× tss ¥³ ⁄‘„ ¤¯§§¨µ³¯∏¶~
t q质粒 ³⁄t{2≤ ¯ƒ≠ 酶切产物 ³⁄t{2
≤¯ ƒ≠ §¬ª¨¶·¨§¥¼ Εχο• ´ ¤±§ Ηιν§¶ ~
u q°≤• 产 物 °≤• ³µ²§∏¦·~ v q质 粒
³⁄t{2≤ ¯ƒ≠ °¯ ¤¶°¬§ ³⁄t{2≤ ¯ƒ≠ ~
w q°˜≤t{ q
u1u 基因序列与同源性分析 重组质粒 ³⁄t{2≤¯ ƒ≠ 的 ⁄‘„序列分析结
果表明 o分离克隆的 ⁄‘„ 片段长度为 u vwy ¥³o通过 Š¨ ±…¤±® …„≥× 和
≤˜≥ׄ• kt1{vl序列同源性分析 o发现该序列与 Š¨ ±…¤±®中同科k芸香科l
的甜橙k„≠vv{|zyl !枳壳k„≠|zs{uv !„≠|zs{uwl的 ΛΦΨ全长基因核苷酸序列
同源性分别为 |v h !|v h和 |u h ~进一步分析发现 o该 ⁄‘„片段含有 ΛΦΨ基
因完整的编码区序列 o由 v个外显子组成 o其完整的开放阅读框长 t t|t ¥³o
编码 v|z个氨基酸k表 tl o与甜橙和枳壳 ƒ≠ 同源基因的氨基酸序列同源性
均为 |x h ∀由于该 ⁄‘„片段是根据 Š¨ ±…¤±®上已知的甜橙和枳壳 ΛΦΨ全长
基因设计的 t对引物扩增出来 o而且与已知甜橙和枳壳 ΛΦΨ全长基因的核
苷酸和氨基酸同源性分别高达 |u h以上和 |x h o因此推测该 ⁄‘„片段包含
有无核黄皮的 ΛΦΨ全长基因k简写为 ΧλΛΦΨl o该基因的核苷酸序列及推测的
氨基酸序列如图 u ∀
u1v 亲缘关系分析 无核黄皮 ΛΦΨ同源基因与 Š¨ ±…¤±®上已知的几种木本
果树和林木 ΛΦΨ同源基因的氨基酸序列关系见图 v ∀从图 v可以看出 o无核
黄皮 !甜橙和枳壳 ΛΦΨ基因编码的氨基酸序列聚类在一起 o说明本文克隆的
无核黄皮 ΛΦΨ基因和甜橙及枳壳 ΛΦΨ基因亲缘关系最近 ∀
表 1 无核黄皮与甜橙和枳壳的 ΛΦΨ同源基因比较
Ταβ .1 Χοµ παρισον οφ ΛΦΨ ηοµ ολογουσ γενεσ αµ ονγ Χ .λανσιυµ , Χ . σινενσισ ανδ Π . τριφολιατα
种
≥³¨¦¬¨¶
基因全长
≥¬½¨ ²©ª¨ ±¨ Π¥³
开放阅读框长
≥¬½¨ ²© ’• ƒΠ¥³
氨基酸长度
≥¬½¨ ²©¤°¬±²¤¦¬§k¤¤l
内含子 tΠ内含子 u
Œ±·µ²± tЌ±·µ²± u
无核黄皮 Χqλανσιυµ u vwy t t|t v|z wutΠwzw
甜橙 Χq σινενσισ u yut t t|w v|{ ws{Πwzy
枳壳 Πq τριφολιατα u vyv t t|w v|{ ws|Πwzz
枳壳 Πq τριφολιατα u vyw t t|w v|{ ws{Πwz|
黄皮 !甜橙 !枳壳是芸香科中不同属的植物 o但黄皮与甜橙和枳壳的 ΛΦΨ
同源基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在 |u h以上和 |x h o说明 ΛΦΨ基因序列及其编码的氨基酸序列
tvt 第 ts期 郭永泽等 }黄皮 ΛΕΑΦΨ同源基因的克隆与序列分析
图 u 无核黄皮 ΛΦΨ基因k ΧλΛΦΨl的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
ƒ¬ªqu ׫¨ ±∏¦¯ ²¨·¬§¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤±§·«¨ §¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨ ²© ΛΦΨ k ΧλΛΦΨl ©µ²° Χqλανσιυµ
小写字母为内含子 ~ ΧλΛΦΨ基因的起始密码子和终止密码子为黑体阴影部分 ∀Œ±·µ²± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶¤µ¨ ª¬√¨ ±¬±·«¨ ¶°¤¯¯
¯¨ ·¨µ¶~·«¨ ¥¯¤¦®¯¨·¨µ¶¤±§¶«¤§²º ³¤µ·¶¤µ¨ ·«¨ ¶·¤µ·¦²§²± ¤±§·¨µ°¬±¤·¬²± ¦²§²± ²© ΧλΛΦΨq
在同科不同属植物中相当保守 o本研究正是利用 ΛΦΨ基因的保守性 o根据已知甜橙和枳壳的 ΛΦΨ全长基因
设计引物克隆出黄皮的 ΛΦΨ全长基因 ∀从研究结果来看 o无核黄皮 ΛΦΨ全长基因编码区的核苷酸序列比甜
橙和枳壳少 v个核苷酸 o氨基酸序列比甜橙和枳壳少 t个氨基酸 o而无核黄皮 ΛΦΨ全长基因第 t个内含子比
甜橙多 tv个核苷酸 o比枳壳多 tu ∗ tv个核苷酸 o第 u个内含子的大小差异不大 o这一结果是否与无核黄皮
uvt 林 业 科 学 wv卷
图 v 几种木本植物 ΛΦΨ同源基因编码的氨基酸序列系统树
ƒ¬ªqv °«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³²©¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨±¦¨¶§¨§∏¦¨§©µ²° ΛΦΨ
«²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ¶¤°²±ª¶¨√ µ¨¤¯ ®¬±§¶²© º²²§¼ ³¯¤±·¶
„ƒt o„ƒu } 苹果 Μαλυσ ≅ δοµεστιχα k ⁄±xvx{{x o ⁄±xvx{{yl ~ ≤¯ ƒ≠ }无核黄皮 Χq λανσιυµ
k⁄±w|zssyl ~ ≤¶ƒ≠ }甜橙 Χιτρυσ σινενσισk„≠vv{|zyl ~ ≤ו ≥ƒ≠ o ≤ו ≥ƒ≠u }枳壳 Πονχιρυσ τριφολιατα
k„≠|zs{uv o„≠|zs{uwl ~∞­ƒ≠ }枇杷 Εριοβοτρψαϕαπονιχα k„≠xxtt{vl ~∞Šƒ≠ }巨桉 Ευχαλψπτυσ γρανδισ
k„≠ywsvtwl ~∞ƒt }蓝桉 Ευχαλψπτυσ γλοβυλυσ¶∏¥¶³q γλοβυλυσk„ƒsvw{syl ~Š¬±ƒ≠ oŠ¬±‘§¯¼ o‘⁄≠ }银
杏 Γινκγο βιλοβα k„ƒts{uu{ o „ƒtsxttt o„≠yxyyzyl ~°¦ƒ≠t }加勒比松 Πινυσ χαριβαεα k„≠ywsvtxl ~
°• ƒo ‘∞∞⁄≠ }辐射松 Πινυσ ραδιατα k „ƒts|tw| o ˜zyzxzl ~ °×ƒ }毛果杨 Ποπυλυσ τριχηοχαρπα
k˜|vt|yl q
的开花特性有关 o原因尚不清楚 o有待进一步研究 ∀有关无核黄皮开花调控的分子机制尚未见报道 o无核黄
皮 ΛΦΨ全长基因的克隆为进一步研究和探讨黄皮开花的分子机制打下良好的基础 ∀
参 考 文 献
奥斯伯 ƒ  o金斯特 • ∞o塞德曼 Š o等 qussw1 精编分子生物学实验指南 qw版 q马学军 o舒跃龙 o颜子颖 o等译 q北京 }科学出版社 ous p uu
马月萍 o陈 凡 o戴思兰 qussx1 植物 ΛΕΑΦΨ同源基因的研究进展 q植物学通报 ouukxl }ysx p ytv
潘建平 o袁沛元 o曾 杨 o等 qussz1 华南地区黄皮良种 !生产现状与发展对策 q广东农业科学 oktl }tsv p tsx
萨母布鲁克 o拉塞尔 ⁄ • qussu1 分子克隆实验指南 qv版 q黄培堂 o等译 q北京 }科学出版社 ou p tvz
邵寒霜 o李继红 o郑学勤 o等 qt|||1 拟南芥 ΛΦΨ¦⁄‘„ 的克隆及转化菊花的研究 q植物学报 owtkvl }uy{ p uzt
王利琳 o梁海曼 o庞基良 o等 qussw1 拟南芥 ΛΕΑΦΨ基因在花发育中的网络调控及其生物学功能 q遗传 ouyktl }tvz p twu
„«¨ ¤µ± Ž° o²«±¶²± ‹ „ o • ¬¨ª¨¯ ⁄o ετ αλqusst1 ΝΦΛ1 o¤ Νιχοτιαναταβαχυµ ΛΦΨ2¯¬®¨ ª¨ ±¨ o¦²±·µ²¯¶° µ¨¬¶·¨°¬±¬·¬¤·¬²± ¤±§©¯²µ¤¯ ¶·µ∏¦·∏µ¨ q°¯¤±·¤±§≤¨¯¯
°«¼¶¬²¯²ª¼ owu }ttvs p ttv|
‹¨ ÷¬±«∏¤o¬≠¤±ªµ∏¬oŠ∏² ≠²±ª½¨ o ετ αλqussx1 Š¨ ±¨ ·¬¦¤±¤¯¼¶¬¶²©uv °¤±ª² ¦∏¯·¬√¤µ¦²¯¯¨ ¦·¬²± ¬± Š∏¤±ª¬¬°µ²√¬±¦¨ µ¨√ ¤¨¯ §¨ ¥¼ Œ≥≥• q ²¯ ¦¨∏¯¤µ°¯¤±·
…µ¨ §¨¬±ªovkyl }{u| p {vw
‹¨∏«∏¤o«∏ ±∏±o⁄¤¥¬× o ετ αλqusst1 ×µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²©µ¬¦¨ º¬·«·«¨ Αραβιδοπσισ ©¯²µ¤¯ µ¨ª∏¯¤·²µΛΦΨ¦¤∏¶¨¶ ¤¨µ¯¼ «¨ ¤§¬±ªq×µ¤±¶ª¨ ±¬¦• ¶¨¨¤µ¦«o| }uuv
p uuz
°¨ ±¤o ¤µ·¬±2×µ¬¯¯²  o∏¤µ¨½o ετ αλqusst1 ≤²±¶·¬·∏·¬√¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²© Αραβιδοπσισ ΛΦΨ²µΑΠΕΤΑΛΑ1 ª¨ ±¨ ¶¬± ¦¬·µ∏¶µ¨§∏¦¨¶·«¨¬µª¨ ±¨ µ¤·¬²±·¬°¨q‘¤·∏µ¨
…¬²·¨¦«±²¯²ª¼ot| }uyv p uyz
• ¬¨ª¨¯ ⁄o „¯ √¤µ¨½ ⁄o≥°¼·« ⁄ • o ετ αλqt||u1 ΛΦΨ¦²±·µ²¯¶©¯²µ¤¯ ° µ¨¬¶·¨°¬§¨±·¬·¼¬± Αραβιδοπσισq≤¨¯¯oy| }{wv p {x|
• ¬¨ª¨¯ ⁄o≤²∏³¯¤±§Š qt||x1 ΛΦΨ ¥¯²²°¶¬± ¤¶³¨ ± q‘¤·∏µ¨ ovzz }w{u p w{v
k责任编辑 徐 红l
vvt 第 ts期 郭永泽等 }黄皮 ΛΕΑΦΨ同源基因的克隆与序列分析