全 文 ：第 ww卷 第 tu期
u s s {年 tu 月
林 业 科 学
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⁄¨ ¦qou s s {
油茶种子水通道蛋白 ≤²°Œ°t2t的鉴定与分析 3
胡孝义 谭晓风 田晓明 刘 巧 罗 茜 陈鸿鹏 胡芳名
k中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 长沙 wtssswl
摘 要 } 以构建的油茶 ¦⁄‘„文库为基础 o采用交错延伸 °≤• 技术 o分离克隆到一个水通道蛋白基因的编码序列
k¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨ ±¦¨ o ≤⁄≥l o它编码一个 u{z ¤¤的跨膜蛋白kŠ¨ ±…¤±®蛋白质 ¬§} „≤ƒv||stl ∀该蛋白可能由 u条基因
kŠ¨ ±…¤±®登录号 }∞˜{xs{ts !∞˜{xs{ttl编码 o这 u个基因具有相同的 ≤⁄≥和 vχ2˜×• o但 xχ2˜×• 不同 o其中之一多了
u个小的插入片段 ∀经对该蛋白的同源性比对和特征性基序分析 o推测这个水通道蛋白属于质膜内在蛋白成员 o定
名为 ≤²°Œ°t2t ∀通过同源建模 o论证 ≤²°Œ°t2t的水通道活性与通道口的k去l覆盖有关 ∀ ‘端与 ⁄环 !…环的静电势
作用导致了对通道口的k去l覆盖 o并受磷酸化Π质子化门控机制调控 o质子化抑制通道活性 o磷酸化则解除抑制 ∀从
同源建模的结果和细胞内的氧化状态推测该蛋白为组成型的低活性 o这可能是油茶种子近成熟期脱水的成因之
一 ∀
关键词 } 油茶 ~水通道蛋白基因 ~¦⁄‘„文库 ~水通道活性 ~生物信息学 ~同源建模
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u 文献标识码 } „ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{ltu p ssw{ p s|
收稿日期 }ussz p tu p uw ∀
基金项目 }中南林业科技大学研究生创新基金kussy¥¬stl o湖南省教育厅研究生创新基金 o国家/十一五0科技支撑项目kussy…„⁄t{…susw o
ussy…„⁄st„tzsyl ∀
3 谭晓风为通讯作者 ∀
Ιδεντιφιχατιον ανδ Αναλψσισ οφ αν Αθυαποριν(ΧοΠΙΠ121) ιν τηε Σεεδσ οφ Χαµελλια ολειφερα
‹∏÷¬¤²¼¬ פ± ÷¬¤²©¨ ±ª ׬¤± ÷¬¤²°¬±ª ¬∏±¬¤² ∏² ±¬¤± ≤«¨ ± ‹²±ª³¨ ±ª ‹∏ƒ¤±ª°¬±ª
k ΚεψΛαβ οφ Νον2Ωοοδ Φορεστ Προδυχτ οφ Στατε Φορεστρψ Αδµινιστρατιον Χεντραλ2Σουτη Υνιϖερσιτψοφ Φορεστρψ ανδ Τεχηνολογψ Χηανγσηα wtssswl
Αβστραχτ} …¤¶¨§ ²± ¤ ¦²±¶·µ∏¦·¨§ ¦⁄‘„ ¬¯¥µ¤µ¼ ²© Χαµελλια ολειφεραo ¤ ¦²°³¯ ·¨¨ ¦²§¬±ª ¶¨ ∏´¨±¦¨ k≤⁄≥l ±¨¦²§¬±ª ¤
·µ¤±¶°¨ °¥µ¤±¨ ¤´ ∏¤³²µ¬±k„±°lkŠ¨ ±…¤±®³µ²·¨¬±¬§}„≤ƒv||stl oº«¬¦«¦²±·¤¬±¶u{z ¤°¬±²¤¦¬§¶oº¤¶¶¨³¤µ¤·¨§¤±§¦¯²±¨ §
©µ²° ±¨ ¤µ¯¼ °¤·∏µ¨§¶¨ §¨¶²© Χq ολειφεραo¥¼ ²√¨ µ¯¤³³¬±ª ¬¨·¨±¶¬²± °≤• ·¨¦«±¬´∏¨ q׫¬¶¤´ ∏¤³²µ¬± °¤¼ ¥¨ ·µ¤±¶¯¤·¨§©µ²°·º²
„±° ª¨ ±¨ ¶kŠ¨ ±…¤±®¤¦¦¨¶¶¬²± ‘²}∞˜{xs{ts o∞˜{xs{ttl oº«¬¦«¦²±·¤¬±·«¨ ¶¤°¨ ≤⁄≥ ¤±§vχ2˜×• oº«¨µ¨¤¶·«¨¬µxχ2˜×•¶
¤µ¨ §¬©©¨µ¨±·q’±¨ ²©·«¨ ° «¤¶·º²¤§§¬·¬²±¤¯ ¶°¤¯¯¬±¶¨µ·¬²±¶¨ª°¨ ±·¶¦²°³¤µ¨§º¬·«·«¨ ²·«¨µª¨ ±¨ q…¼ «²°²¯²ª¼ ¤¯¬ª±°¨ ±·¤±§
¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¶¨ ∏´¨±¦¨ ¤±¤¯¼¶¬¶o¬·¬¶¶³¨¦∏¯¤·¨§·«¤··«¬¶¤´ ∏¤³²µ¬± ¥¨ ²¯±ª¶·²³¯¤¶°¤ °¨ °¥µ¤±¨ ¬±·µ¬±¶¬¦³µ²·¨¬±o§¨¶¬ª±¤·¨§¤¶
≤²°Œ°t2t1…¼ «²°²¯²ª¼ °²§¨ ¬¯±ªo¬·¶º¤·¨µ¦«¤±±¨ ¯ ¤¦·¬√¬·¼¬¶§¨ °²±¶·µ¤·¨§·² ¥¨ ¤©©¨¦·¨§¥¼·«¨ k©µ¨ l¨ ¦²√¨ µ¬±ª²©¦«¤±±¨ ¯
°²∏·«¦¤∏¶¨§¥¼ ¨¯ ¦¨·µ²¶·¤·¬¦³²·¨±·¬¤¯ ¬±·¨µ¤¦·¬²± ¥¨·º¨ ±¨·«¨ ‘·¨µ°¬±∏¶¤±§⁄ ²¯²³²µ… ²¯²³q׫¬¶¬±·¨µ¤¦·¬²±¬¶µ¨ª∏¯¤·¨§¥¼
·«¨ ³µ²·²±¬½¤·¬²± ¤±§³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²± ª¤·¬±ª °¨ ¦«¤±¬¶°o³µ²·²±¬½¤·¬²± µ¨³µ¨¶¶¬±ª·«¨ ¦«¤±±¨ ¯ ¤¦·¬√¬·¼ ¥¼ ¦²√¨ µ¤ª¨ ²©¦«¤±±¨ ¯
°²∏·«oº«¨µ¨¤¶³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²± §¨µ¨³µ¨¶¶¬±ª·«¨ ¦²√¨ µ¤ª¨ q׫¨ µ¨¶∏¯·¶²©«²°²¯²ª¼ °²§¨ ¬¯±ª¤±§¬±·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ²¬¬§¤·¬√¨ ¶·¤ª¨ ²©
·«¨ Χq ολειφερα ¶¨ §¨¶¶∏ªª¨¶··«¤··«¨ º¤·¨µ·µ¤±¶³²µ·¤¦·¬√¬·¼ ²©≤²°Œ°t2t °¤¼ ¥¨ ¦²±¶·¬·∏·¬√¨ ¼¯ ²¯º¨ µoº«¬¦«°¤¼ ¥¨ ·«¨ µ¨¤¶²±
©²µ·«¨ ¶¨ §¨§¨¶¬¦¦¤·¬²± §∏µ¬±ªµ¬³¨ ±¬±ªq
Κεψ ωορδσ} Χαµελλια ολειφερα~¤´ ∏¤³²µ¬±~¦⁄‘„ ¬¯¥µ¤µ¼~º¤·¨µ¦«¤±±¨ ¯¤¦·¬√¬·¼~¥¬²¬±©²µ°¤·¬¦¶~«²°²¯²ª¼ °²§¨ ¬¯±ª
细胞间的水分转运需要跨越质膜和液泡膜 o而水通道蛋白k¤´ ∏¤³²µ¬±o„±°l形成跨脂双层的水扩散特异
孔道 o有利于这种跨膜的水分运动 o也有利于渗透作用的调节kŽ­¨ ¥¯²° ετ αλqot|||l ∀植物 „±°广泛调控着
从根到叶的随蒸腾流的水分运输 o也调节其他一些生理过程 o如 o韧皮部吸收物的转运 !叶片气孔的开启与关
闭 !叶片运动 !胞质的动态平衡 ∀此外 o部分动物和植物水通道蛋白可以介导甘油运输 o植物 „±°按序列同
源性和亚细胞定位可分为 w个主要的亚族k∏∏ ετ αλqoussxl }tl质膜内在蛋白k³¯¤¶°¤ °¨ °¥µ¤±¨ ¬±·µ¬±¶¬¦
³µ²·¨¬±o°Œ°l o分布于细胞质膜上 ~ul液泡膜内在蛋白k·²±²³¯¤¶·°¨ °¥µ¤±¨ ¬±·µ¬±¶¬¦³µ²·¨¬±o׌°l o主要分布于液
泡膜上 ~vl结瘤蛋白样主要内在蛋白k±²§∏¯¬± uy ¬¯®¨ °¤­²µ¬±·µ¬±¶¬¦³µ²·¨¬±o‘Œ°l o如根瘤蛋白k±²§∏¯¬±l分布于
豆科根瘤的共生膜上及内质网上 ~wl在玉米k Ζεα µαψσl中发现的小分子碱性内在蛋白k¶°¤¯¯ ¥¤¶¬¦¬±·µ¬±¶¬¦
³µ²·¨¬±o≥Œ°l o定位于内质网与质膜上 o该类 „±°大部分成员如≥Œ°t ~t !≥Œ°t ~u有水转运活性k¤¨¶«¬°¤ ετ αλqo
usszl ∀植物根系细胞的 °Œ°在控制自由水的吸收方面发挥关键的作用 o而 ׌°则在胞质中缓冲渗透波动
k¤∏µ¨¯ ετ αλqoussul ∀有证据显示 °Œ°在转录水平上受到脱水胁迫的调节k¤µ¬¤∏¬ ετ αλqot||{l ∀目前认
为 o在干旱胁迫下 o在大多数细胞和组织中 o„±°丰度或水转运活性的提高是有害的k„«¤µ²± ετ αλqoussvl o细
胞和组织的合理水分状态的维持既需某些 „±°的水通道活性的提高 o也需要在另一些细胞和组织中 „±°水
分转运活性的下降k≤²°³¤µ²·ετ αλqousss ~¤±ª ετ αλqousszl ∀
油茶k Χαµελλια ολειφεραl种子在成熟过程中水分含量急剧下降 o处于脱水状态 o而通常情况下 o植物的脱水
胁迫会诱导活性氧分子kµ¨¤¦·¬√¨ ²¬¼ª¨ ±¶³¨¦¬¨¶o• ’≥l的迸发 ∀从油茶近成熟种子¦⁄‘„文库中发现超氧化物
歧化酶k≥’⁄l !过氧化物酶k°’⁄l !过氧化氢酶k≤„×l为中高丰度表达k谭晓风等 oussyl o还发现有产生活性
氧的 ‘„⁄°‹氧化酶 o以及谷胱甘肽硫转移酶kŠ≥×l !脂氢过氧化物裂解酶k‹°l !脱水素等多种保护蛋白与
解毒蛋白 o暗示近成熟的油茶种子中有较多 • ’≥的积累 ∀为探讨油茶种子内脱水胁迫k或氧化胁迫l与油脂
合成的关系 o以揭示油茶油脂生物合成的影响因素 o有必要研究油茶种子脱水胁迫的成因 ∀在油茶 ¦⁄‘„文
库中还发现了 uy条 ׌°及 t条 °Œ°的 ∞≥×序列 o在完成这个 °Œ°的 ¦⁄‘„序列的全长克隆后 o通过三维同源
建模等生物信息学手段分析了其定位与活性调控机制 o发现它是一个组成型低活性的 °Œ°类水通道蛋白 o抑
制胞外水分的进入 o因此推测油茶种子细胞的质膜水通道蛋白的表达低丰度及组成型低活性是油茶种子近
成熟期脱水的成因之一 ∀
t 材料与方法
111 材料
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室构建的油茶近成熟种子 ¦⁄‘„文库 o所有
单克隆保存于 p {s ε 冰箱中 ~提取 • ‘„的植物材料为油茶优良无性系湘林 t号和湘林 w号的近成熟种子 o
采自于湖南省林业科学研究院油茶采穗圃 ∀
112 方法
t1u1t 质粒 ⁄‘„提取 ≥⁄≥碱裂解法的小量制备k≥¤°¥µ²²® ετ αλqoussul ∀
t1u1u 质粒中目的片段大小的 °≤• 检测 °≤• 反应体系kus ˏl }פ´ kx ˜#ˏptls1u ˏots ≅ °≤• ¥∏©©¨µu1s
ˏoª≤¯ ukux °°²¯ #ptlt1u ˏo§‘×°¶kts °°²¯ #ptls1w ˏo×vkxχ p „×ׄ„≤≤≤×≤„≤ׄ„„ŠŠŠ„ p vχl !×z
kxχ p ׄ„ׄ≤Š„≤×≤„≤ׄׄŠŠŠ p vχl引物各 s1{ ˏo质粒模板 s1u ˏo§§‹u ’ tw1w ˏ∀°≤• 扩增条件 }|w ε
预变性 x °¬±~|w ε 变性 vs ¶ox{ ε 退火 vs ¶ozu ε 延伸 |s ¶ovx个循环 ~zu ε 继续延伸 x °¬±~w ε 保存 ∀取
u ˏ扩增产物于 t1s h琼脂糖凝胶上电泳检测 ∀
t1u1v 双向测序 ×v !×z双向测序 o采用 ∂ ¦¨·²µ‘׌k„§√¤±¦¨× |l软件进行校正和拼接从而得到该克隆的全
部 ⁄‘„序列信息 ~利用 ‘≤…Œ网页上的 …¯¤¶·程序对该序列进行同源性分析 ∀
t1u1w 总 • ‘„提取 采用 Œ±√¬·µ²ª¨±公司的 • ‘„提取试剂盒 }°∏µ¨¬±®× ¬¦µ²2·²2¬§¬×²·¤¯ • ‘„ °∏µ¬©¬¦¤·¬²±
≥¼¶·¨° k≤¤·¤¯²ª‘²qtut{v2st{l o按照说明指南进行 ∀
t1u1x • ×2°≤• 与 xχ2• „≤∞ 采用 ≤¯ ²±·¨¦«公司的 ≥„• ×א • „≤∞ ¦⁄‘„ „°³¯¬©¬¦¤·¬²± 试剂盒 k≤¤·q‘²q
yvw|twl o按其使用说明合成 ¦⁄‘„第一链 ∀利用 ³µ¬°¨ µ³µ¨°¬¨µx软件设计基因特异的 xχ2• „≤∞引物 Š≥°与
‘Š≥°∀
反向引物 Š≥° }xχ p „Š×„Š≤„Š≤≤≤„„„׊×≤„≤≤Š≤≤ p vχ kuw ¥³ots Λ°²¯#ptl ~
反向巢式引物 ‘Š≥° }xχ p „׊×≤≤≤≤≤׊„Š„׊≤≤„Š≤ŠŠ× p vχ kuw ¥³ots Λ°²¯#ptl ∀
Š≥°与 ‘Š≥°反向引物分别与 ∞≥×序列的 tv{ ∗ tyt ¥³!tsy ∗ tu| ¥³互补 ∀
xχ2• „≤∞ °≤• 反应体系kxs ˏl及降落 °≤• k退火温度依次为 zu ε !zs ε !y{ ε l的扩增程序参照试剂盒
的说明进行设置 o但电泳检测结果无任何条带 ~保存 • „≤∞的反应产物 o增加 ts次 y{ ε 退火的热循环 o再次
电泳检测 o有弱的条带和拖带 ~接着用巢式 °≤• 特异扩增该目的条带 o其反应体系kxs ˏl为 }„ פ´ kx ˜#
ˏptls1y ˏots ≅ „ °≤• ¥∏©©¨µµx1s ˏoª≤¯ ukux °°²¯#ptlx ˏo§‘×°¶kts °°²¯#ptlt ˏo‘˜°kts Λ°²¯#
ptl !‘Š≥°kts Λ°²¯#ptl引物各 t ˏo• „≤∞产物模板 t ˏo§§‹u ’ vw1| ˏ∀热循环程序k降落 °≤• l }|w ε
x °¬±~|w ε vs ¶oy{ ε vs ¶ozu ε |s ¶ox个循环 ~|w ε vs ¶oyy ε vs ¶ozu ε |s ¶ox个循环 ~|w ε vs ¶o
ys ε vs ¶ozu ε |s ¶oux个循环 ~zu ε x °¬±~w ε 保存 ∀
|w 第 tu期 胡孝义等 }油茶种子水通道蛋白 ≤²°Œ°t2t的鉴定与分析
t1u1y 目的条带的回收 !连接与转化 用安比奥公司k长沙l的 ⁄‘„回收试剂盒和 פŽ¤•¤公司的 ³⁄t{2×
载体连接试剂盒 o按照各自的说明进行 ⁄‘„目的片段的回收及与含有氨苄青霉素抗性基因的 ³⁄t{2×载体
的连接 o转化 ⁄‹xΑ大肠杆菌 o在含有 Œ°×Škwss Λª#°ptl及 ÷2ª¤¯ktys Λª#°ptl的固体 …平板上进行蓝白
斑筛选 o挑取白色的单菌落培养 o抽提重组质粒进行 °≤• 检测 o反应体系kus ˏl为 }µ×¤´ ku1x ˜#ˏptls1u
ˏots ≅ °≤• ¥∏©©¨µu1s ˏoª≤¯ ukux °°²¯#ptlt1u ˏo§‘×°¶kts °°²¯#ptls1v ˏo‘˜° !‘Š≥°引物各 s1x
ˏo重组质粒模板 s1v ˏo§§‹u ’ tw1w ˏ∀循环参数与上述巢式 °≤• 相同 ∀挑选阳性克隆送北京博尚生物
科技公司测序 ∀
t1u1z 交错延伸 °≤• 获得完整的目的基因全长 ¦⁄‘„ 首先以 u对引物k„±°ƒ²与 ‘Š≥° o„±°ƒ¬与 „±°•²l
分别扩增含有起始密码子和终止密码子的 u个交错模板k图 vl o且在引物设计时引入酶切位点 o以便插入到
原核表达载体 ³∞×2vs ¤上 ∀
正向引物 „±°ƒ²}xχ p ≤ŠŠ ≤„ׄ׊ Š„„ŠŠŠ„„„Š„„Š„„ p vχ o相应的反向引物为 ‘Š≥° o序列见 t1u1x ~
正向引物 „±°ƒ¬}xχ p ×׊„≤ŠŠ×Š„׊ŠŠŠŠ×׊×ׄŠ p vχk与两模板重叠区序列的 xχ互补l ~
反向引物 „±°•²}xχ p ≤ŠŠ Š„„××≤×≤„×≤„≤×׊Š„≤×× p vχ k×≤„与终止密码子 ׊„反向互补l ∀
上述涂灰的部分分别为 Νδε ´及 Εχο• ´的识别序列 o≤ŠŠ为保护碱基 o采用高保真 ³©∏酶 o反应体系
kxs ˏl为 }³©∏ku1x ˜#ˏptlt1s ˏots ≅ ³©∏°≤• ¥∏©©¨µx1s ˏo§‘×°¶kts °°²¯#ptlt ˏo引物k„±°ƒ²!‘Š≥°
或 „±°ƒ¬!„±°•²l各 t1u ˏo文库质粒模板 s1{ ˏo§§‹u ’ v|1{ ˏ∀热循环程序采用降落 °≤• }|w ε x °¬±~
|w ε vs ¶ozs ε vs ¶ozu ε |s ¶ox个循环 ~|w ε vs ¶oy{ ε vs ¶ozu ε |s ¶ox个循环 ~|w ε vs¶oyy ε vs¶o
zu ε |s ¶ox个循环 ~|w ε vs ¶oys ε vs ¶ozu ε |s ¶ovs个循环 ~zu ε x °¬±~w ε 保存 ∀电泳检测目的条
带 o然后使用安比奥公司k长沙l的 ⁄‘„回收试剂盒切胶回收 ∀
交错延伸 °≤• 的反应体系kxw ˏl }§§‹u ’ ux1y ˏots ≅ ³©∏°≤• ¥∏©©¨µy1s ˏou个交错模板各 ts1s ˏo
§‘×°¶kts °°²¯#ptlt1u ˏo³©∏ku1x ˜#ˏptlt1u ˏ∀热循环程序 }|w ε x °¬±~|w ε wx ¶oxy ε ys ¶ozu ε
zs ¶ox个循环 ~zu ε x °¬±~w ε 保存 ∀热循环完毕后立即加入 „±°ƒ²kts Λ°²¯#ptl !„±°•²kts Λ°²¯#ptl各
v1s ˏo继续进行热循环 o程序为 }|w ε x °¬±~|w ε vs ¶oys ε wx ¶ozu ε |s ¶ovx个循环 ~zu ε x °¬±~w ε
保存 ∀取 v ˏ进行电泳检测 ∀
t1u1{ 生物信息学分析与水通道活性的预测 利用 ‘≤…Œk«·³}ΠΠººº q±¦¥¬q±¯ ° q±¬«qª²√Πl的 …¯¤¶·在线软件
进行同源性分析 o采用 ∂ ¦¨·²µ‘׌k„§√¤±¦¨× |l软件进行比对和保守基序的识别 o蛋白质理化性质的预测及同
源建模则是利用 «·³}ΠΠººº q¨¬³¤¶¼q²µªΠ·²²¯¶网页上提示的相关网站的在线软件进行 ∀
u 结果与分析
211 目的 ΕΣΤ序列长度的 ΠΧΡ 检测及双向测序结果
油茶 ¦⁄‘„文库中 yt{y号克隆的 ∞≥×序列经 ‘≤…Œ的 √¨ ¦¶¦µ¨ ±¨分析后去除载体序列 o其长度远小于电
泳检测到的 t sss ∗ t xss ¥³k图略l o进行双向测序后发现 o该克隆的目的序列长 t sxu ¥³o其中含有 zs个寡
聚 „ ∀ ‘≤…Œ的 ¥¯¤¶·¬程序得到的序列的基因注释全部为水通道蛋白k„±°l o其中 o即使最低的 ≥¦²µ¨值也高达
wyx o相应的 ∞值为 u¨p tu| o相似性较高 o为 {v h k氨基酸l o因此该克隆可能代表一个 „±°基因 o为叙述方
便 o暂命名为 ΧοΑΘΠ~结合水通道蛋白的一般性结构特点分析其开放阅读框k²³¨ ± µ¨¤§¬±ª©µ¤°¨ o ’• ƒl o发现
该克隆代表的基因序列缺少 ‘端部分编码序列和 xχ2˜×• ∀
212 5χ2ΡΑΧΕ产物 !巢式 ΠΧΡ 产物及重组质粒的 ΠΧΡ 检测
• „≤∞产物的电泳检测发现在约 xss ¥³以下有轻微的拖带 o暗示其中可能有目的条带k图 t左l ∀继续
以 • „≤∞产物为模板进行巢式 °≤• o其产物的电泳检测清晰表明 o确实存在一略小于 xss ¥³的明亮条带k图 t
右l ∀将该条带纯化后 o进行 ׄ克隆 o挑取 x个白色的单菌落培养 o其重组质粒的 °≤• 检测结果k图 ul显示 }
x个条带大小都与图 tk右l的条带吻合 o其中 u !v !w号条带一致 o但 t号略小 ox号略大 ∀选送 t !v !x号的菌
液测序 ∀
sx 林 业 科 学 ww卷
图 t xχ2• „≤∞产物k左l及巢式 °≤• 产物k右l
的电泳检测
ƒ¬ªqt ׫¨ ¨¯¦·µ²³«²µ¨¶¬¶·¨¶·¬±ª²©³µ²§∏¦·¶©µ²°
xχ2• „≤∞k¯ ©¨·l ¤±§±¨ ¶·¨§°≤• kµ¬ª«·l
图 u 重组质粒阳性克隆的 °≤• 检测
ƒ¬ªqu ׫¨ √ µ¨¬©¼¬±ª²©³²¶¬·¬√¨µ¨¦²°¥¬±¤±·¦¯²±¨ ¶¥¼ °≤•
213 ∆ΝΑ序列分析
对已测序的这 v个重组子的目的序列进行比对发现 ot !v号重组子的目的条带序列完全一致 o而 x号重
组子目的序列内相对于前者多了 u个小片段 o一个是简单重复序列内的 w个 Š„ o另一个是位于更前面的
≤×××≤„≤× o其余部分则完全一致k图 vl ∀将这 u个不同的序列与原 ∞≥×序列采用 ∂ ¦¨·²µ‘׌软件分别拼接 o
并比较二者的 ’• ƒ o发现二者的编码序列 ≤⁄≥k¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨±¦¨l完全一致 o长 {yt ¥³o起始密码子 „׊ o终止密
码子 ׊„ku个l o编码 u{z个氨基酸 oxχ2˜×• 长 |t ¥³或 tsz ¥³ovχ2˜×• 长 vsu ¥³o后接 zs ¥³的寡聚 „尾 o完
整的基因序列见图 v ∀
图 v 油茶水通道蛋白的基因序列
ƒ¬ªqv ׫¨ ¦²°³¯ ·¨¨ ⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©·«¨ ª¨ ±¨ k ΧοΑΘΠl ©²µΧq ολειφερα ¤´ ∏¤³²µ¬±
深色 }起始密码子k„׊l与终止密码子k׊„l ~下划线 }xχ2˜×• 与 vχ2˜×• ~方框 }终止信号k„„ׄ„l ~着重号 }另一个 ΧοΑΘΠ
的 xχ2˜×• 内多出的 u个片段 ~灰色 }xχ2• „≤∞获得的序列与原 ∞≥×序列的重叠部分 o以引物 „±°ƒ²及 ‘Š≥°扩增 ≤⁄≥的前半部
分 o以引物 „±°ƒ¬及 „±°•²扩增 ≤⁄≥的后半部分 o然后再以灰色部分的片段为交错模板通过交错延伸 °≤• 将 u部分连起来 ∀
ƒ∏¶¦²∏¶}Œ±¬·¬¤·¬²± ¦²§²±k„׊l ¤±§≥·²³¦²±§²±k׊„l q˜±§¨µ¯¬±¨ }xχ2˜×• ¤±§vχ2˜×• q°¤±¨ }≥·²³¶¬ª±¤¯k„„ׄ„l q∞°³«¤·¬¦§²·}׫¨
·º² °²µ¨ ¶¨ª°¨ ±·¶²©¤±²·«¨µΧοΑΘΠqŠµ¤¼¬¶«}׫¨ ²√¨ µ¯¤³³¬±ª¶¨ª° ±¨·¥¨·º¨¨ ±·«¨ ²µ¬ª¬±¤¯ ∞≥× ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤±§·«¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²¥·¤¬±¨ §·«µ²∏ª«
xχ2• „≤∞~׺²¦²∏³¯ ¶¨²©³µ¬° µ¨o„±°ƒ²¤±§‘Š≥° o„±°ƒ¬¤±§„±°•²oº µ¨¨ ∏¶¨§·²¤°³¯¬©¼·«¨ ©²µº¤µ§¤±§¶∏¥¶¨ ∏´¨±·¶¨ª°¨ ±·²©·«¨ ≤⁄≥
©²µΧοΑΘΠo µ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ o ¥¨©²µ¨ ·«¨ ·º² ¶¨ª°¨ ±·²©·«¨ ≤⁄≥ º µ¨¨ ¬¯±®¨ § ¥¼ ∏¶¬±ª·«¨ ªµ¤¼¬¶« ¶¨ª° ±¨·¤¶²√¨ µ¯¤³³¬±ª ·¨°³¯¤·¨ √¬¤·«¨
²√ µ¨¯¤³³¬±ª ¬¨·¨±¶¬²± °≤• q
tx 第 tu期 胡孝义等 }油茶种子水通道蛋白 ≤²°Œ°t2t的鉴定与分析
214 交错延伸 ΠΧΡ 获得油茶 ΑΘΠ基因的 Χ∆Σ
图 w ΧοΑΘΠ完整 ≤⁄≥的交错 °≤• 扩增
ƒ¬ªqw „°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²©¦²°³¯ ·¨¨ ≤⁄≥ ©²µ
ΧοΑΘΠ¥¼ ²√ µ¨¯¤³³¬±ª ¬¨·¨±¶¬²± °≤•
交错延伸 °≤• 的原理是分别以两片段的 vχk尾l及 xχk头l的相同
序列k即重叠部分l自身互为引物进行初次 °≤• o从而将 u个片段连
接 ~再迅速加入另一对引物将已连接的片段进行 °≤• 扩增 ∀对同一
个基因的分别仅含有起始与终止密码子的 u个片段进行交错延伸
°≤• o以获得完整的基因 ≤⁄≥ o可用于各类表达研究 o从而为基因的功
能研究奠定基础 ∀本研究的 u个目的交错片段的理论值分别为 }经巢
式 °≤• 获得的片段长 vwx ¥³!原 ∞≥×序列长 y|x ¥³o二者分别含有引
入的 Νδε ´与 Εχο• ´酶切位点 o但不含非编码区 o电泳检测结果与之
一致k图 wl ∀经交错延伸 °≤• 获得的编码区序列k含酶切位点l理论
值为 |ts ¥³o为参照方便 o与两交错片段一起电泳 o其结果与理论值也
吻合k图 wl ∀至此 o可以确认已获得油茶 „±°基因的一个完整编码序
列 ∀
v 生物信息学分析
311 ΧοΑΘΠ的跨膜螺旋及特征环的确定
一个 „±°分子由 y个跨膜的长 Αp螺旋构成基本骨架 o围绕成水分子通道 o‘端 !≤ 端均在胞质侧 ∀跨
膜的骨架由 „ !… !≤ !⁄和 ∞x个环连接 o… !⁄环在胞质侧 o„ !≤及 ∞环为胞外环k∏∏ ετ αλqoussxl ∀ …和 ∞环
的疏水部分是嵌入但不贯穿膜的短 Αp螺旋 o两者几乎顶对顶地相对 o在 u个短螺旋相对的顶端各拥有一个
十分保守的 „¶±2°µ²2„¯ ¤k‘°„l基序 k隋海心等 ousswl ∀从这 u个短螺旋的顶端分别延生出一条松散链回
绕 o走向各自的膜面 ∀使用∂ ¦¨·²µ‘׌软件将上述油茶 „±°的核酸序列翻译成蛋白质序列 o提交到 «·³}ΠΠ
¶º¬¶¶°²§¨¯q¨¬³¤¶¼q²µªΠº²µ®¶³¤¦¨Π¬±§¨¬q³«³‚©∏±¦€ °²§¨¯¯¬±ª2¶¬°³¯¨ o用 ¶³§¥√ ∂v1z软件对返回的结果观察 !绘
图并与建模的模板 ) ) ) 菠菜k Σπιναχια ολεραχεαl„±°k≥’°Œ°u ~tl的一个同源四聚体k«²°²·¨·µ¤°¨ µ¬¦l亚基 t½|{„
进行比较 o•¤°¤¦«¤±§µ¤±图显示仅 v个残基的构型角位于最大容忍范围之外 o说明二者的结构一致性良好 ∀
从不同侧面观察带型彩图 o发现 …环 !∞环 !≤环及 y个跨膜螺旋都参与了水通道的形成 o…环 !∞环构成水分
子通道的狭口 ~≤环在胞外覆盖在狭口上形成水通道的口缘k图 x !yl ∀经 «·³}ΠΠººº q³µ¨§¬¦·³µ²·¨¬±q²µªΠ等相
关在线软件分析 o得知该蛋白质无糖基化位点 o也无信号肽 ~结合 °• ’ƒ ³µ¨§¬¦·¬²± 的预测结果与
×µ¤±¶°¨ °¥µ¤±¨ ·¨±§¨±¦¼标度的疏水性分析k图略l o得到 y个跨膜的螺旋区kאt p אy o图 zl !u个胞内环 …与
⁄!v个胞外环 „ !≤ !∞的序列位置k图 xl o‘端 !≤端都位于胞内 o…环与 ∞环各含有一个水通道蛋白特有的
保守基序 ‘°„k≤«µ¬¶³¨ ¨¯¶ ετ αλqot||wl o形成顶对顶结构k图 yl o与隋海心等kusswl的描述完全一致 ∀
图 x 同源建模得到的跨膜螺旋及部分特征环
ƒ¬ªqx ׫¨ ·µ¤±¶° °¨¥µ¤±¨ «¨ ¬¯¦¨¶¤±§³¤µ·¬¤¯
¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦ ²¯²³¶¥¼ «²°²¯²ª¼ °²§¨ ¬¯±ª
图 y ≤²„±°的顶对顶结构示意图
ƒ¬ªqy ׫¨ ¶¦«¨ °¤·¬¦µ¨³µ¨¶¨±·¤·¬²± ²©·²³·²·²³
¦²±¶·µ∏¦·¬²±©²µ≤²„±°
ux 林 业 科 学 ww卷
312 与同源蛋白的比对以及保守或可变区序列的分析
图 z ≤²„±°与部分同源蛋白的比对
ƒ¬ªqz ׫¨ ¤¯¬ª±° ±¨·²© ≤²„±° º¬·«¬·¶¶¨√ µ¨¤¯ «²°²¯²ª²∏¶³µ²·¨¬±
图中各序号代表的蛋白序列号及所属物种 ׫¨ ³µ²·¨¬± ¤¦¦¨¶¶¬²± ‘²q¤±§¦²µµ¨¶³²±§¬±ª³¯¤±·¶³¨¦¬¨¶µ¨³µ¨¶¨±·§¥¼·«¨ ±∏° µ¨¬¦¦²§¨
¬±·«¨ ©¬ª∏µ¨ ss } ≤²„±° ~st } ≤„∞xv{{uk蓖麻 Ριχινυσ χοµ µυνισl ~su } °uxz|wk豌豆 Πισυµ σατιϖυµ l ~ sv } „„…zutw|k菜豆
Πηασεολυσϖυλγαρισl ~sw }≤„‹yszt{k欧洲山杨 Ποπυλυσ τρεµυλαl ~sx } ≤„„yw{|xk油菜 Βρασσιχα ολεραχεαl ~sy } „…Šxzt{wk柽柳
Ταµαριξ ¶³ql ~sz }≤„…xyutzk菠菜 Σπιναχια ολεραχεαl q
方框 }磷酸化位点 ~长矩形 } ‘°„ 基序 ~ א }跨膜螺旋 ∀ ≥°¤¯¯ ¥²¬} °«²¶³«²µ¼¯¤·¬²± ¶¬·¨~ ²±ª µ¨¦·¤±ª¯¨} ‘°„ °²·¬©~ א }
×µ¤±¶° °¨¥µ¤±¨ «¨ ¬¯¬¨¶q
用 ≤²„±°的 ≤⁄≥序列在 ‘≤…Œk«·³}ΠΠººº q±¦¥¬q±¯ ° q±¬«qª²√Πl上运行 ¥¯¤¶·¬程序搜寻蛋白质数据库 o相
似性搜索共得到 tss条序列 o涉及到 w{个物种 o¶¦²µ¨值大于 wyx o∞值小于 u¨p tu| o相似性都很高 o所有的比
对序列都覆盖了目的序列的全部k比对序列分布图略l o说明该基因在不同的物种间十分保守 ∀tss条序列
中有明确基因注释的多为 ´类质膜 „±° o即 °Œ°t o提示 ≤²„±°可能是质膜内在蛋白 °Œ°t ∀为便于区分保守
区和可变区 o将这 tss条序列按照相似性大小排序 o每隔约 tx条挑取 t条与目的 ≤²„±°一道进行比对 o结果
如图 z o涂色的部分为保守区域 o其余为非保守区域 o这反映出油茶 ≤²„±°及其他物种的同源基因至少存在 x
vx 第 tu期 胡孝义等 }油茶种子水通道蛋白 ≤²°Œ°t2t的鉴定与分析
个可变区 }‘端 t p vs ¤¤!≤端最后 v个 ¤¤!位于 „环的 ∂≥≥Ž×Ž≤≥×kzy p {x ¤¤l !位于 ≤ 环的 ∞Š××±≠⁄ŠŠ
ktxx p tyx ¤¤l !位于 ∞环的 ∂ƒ‘Ž⁄• Š• ⁄kuwz p uxx ¤¤l oy个跨膜螺旋中相对保守 o仅有少数几个残基不同 o
אv中涉及氧化门控机制的 twt ¤¤与 twy ¤¤的半胱氨酸k≤l也很保守 ~…环与 ∞环含有保守的 ‘°„基序 o且
在 ‘°„邻近部分也十分保守 ∀
313 ΧοΑΘΠ的类型 !定位
所有植物质膜 „±°k³¯¤¶°¤ °¨ °¥µ¤±¨ ¬±·µ¬±¶¬¦³µ²·¨¬±o°Œ°l都有 u个保守区域 o一个位于 ≤ 环的 Š2Š2Š2„2
‘2÷2÷2÷2÷2Š2≠k≤²„±°为 ŠŠŠ„‘≥∂‘‹Š≠ o相符l o另一个位于 ∞环的 ×2Š2ŒΠ×2‘2°2„2•2≥2Πƒ2Š2„2„2ŒΠ∂2ŒΠ∂2
ƒΠ≠2‘k≤²„±°为 ׊Œ‘°„• ≥Š„„Œ∂ƒ‘o也相符l o这些基序是液泡膜 „±°k׌°l家族中所没有的k…¤µ²±¨ ετ αλqo
t||zl o因而推测 ≤²„±°属于分布于质膜上的 „±° o即 °Œ°类型 ∀植物的 °Œ°t与 °Œ°u相比 o其 ‘端长 o而 ≤端
短k≤«¤∏°²±·ετ αλqousssl o而 ≤²„±°的 ‘端kxx个残基l明显也长于 ≤端ktt个残基l o进而暗示本 ≤²„±°可
能属于 °Œ°t型通道蛋白 ~从 …¯¤¶·比对结果来看 o搜索到的 tss个同源基因中有明确亚细胞定位信息的基因
个数为 xu个 o且全部为 °Œ°t类型 o因此结合上述保守区域与 ‘端长度的分析 o可以认为 ≤²„±°属于 °Œ°t类
型 ∀由于是首次克隆到该基因 o故定名为 ΧοΠΙΠ121k Χαµελλια ολειφερα °Œ°l ∀根据 °Œ°的定义 o推测 ≤²°Œ°t2t分
布于油茶种子细胞质膜上 ∀
314 ΧοΠΙΠ121的水通道活性调节分析
v1w1t ≤²°Œ°t2t的磷酸化位点及其对水通道活性的调节 有充分的试验证据表明植物 „±°的磷酸化上调
水通道的活性k≤«¤∏°²±·ετ αλqoussxl o植物 „±°的磷酸化可能直接就近参与原位的快速且可逆的门控
k²«¤±¶¶²± ετ αλqousssl ∀对 ≤²°Œ°t2t采用 °µ²¶¬·¨程序共搜索到 y个可能的磷酸化位点k图 z !图 {l o它们的
激酶种类及其位点分别是 }¦„°依赖的蛋白激酶k胞内 …环的 • Ž≥l !蛋白激酶 ≤k胞外 „环的 ≥≥Žl !酪蛋
白激酶 µk胞外 ≤环的 ×±≠⁄!׎Š⁄o胞内 ⁄环的 ≥„×⁄!≥„• ⁄l ∀ …环 tuy位的 • Ž≥靠近第一个 ‘°„基序的
胞质一侧的环内k图 {中以黑色显示l o其丝氨酸k≥l可能是磷酸化的靶位点k²«¤±¶¶²± ετ αλqot||{l o它在所
有的 °Œ°和几个 ׌°中都是保守的 o位于共有的磷酸化识别序列k„µªΠ÷2¼¶2÷2≥¨ µ2÷2÷2„µªl的内部 o可被包括
≤⁄°Žk¦¤¯¦¬∏° §¨ ³¨ ±§¨±·³µ²·¨¬± ®¬±¤¶¨l在内的几个蛋白激酶识别k²«¤±¶¶²± ετ αλqousssl o磷酸化激酶活性可
能依赖于¦„°与¦Š°∀在 ≥²°Œ°u ~t或 °√׌°v ~t的这个丝氨酸如被丙氨酸取代 o那么这 u个蛋白质在卵母
细胞中表达时水通道活性都降低k¤∏µ¨¯ ετ αλqot||x ~²«¤±¶¶²± ετ αλqot||{l ∀因此 o这个丝氨酸的高度保
守性提示其在结构和功能上的重要性 ∀油茶¦⁄‘„文库中发现有酪蛋白激酶 µk¦¤¶¨¬± ®¬±¤¶¨ µl的一个催化
亚基 o但尚未发现蛋白激酶 ≤与 ¦„°依赖的蛋白激酶 ∀
图 { 胞内几个位点的磷酸化协同作用解除组氨酸
质子化造成的通道口覆盖
ƒ¬ªq{ ׫¨ ³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²± ²©¬±·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ
¶¬·¨¶¦²²µ³¨µ¤·¬√¨ ¼¯ §¨µ¨³µ¨¶¶·«¨ ¦²√¨ µ¤ª¨ ¦¤∏¶¨§¥¼
·«¨ ³µ²·²±¬½¤·¬²± ²©«¬¶·¬§¬±¨
v1w1u ≤²°Œ°t2t的质子化与磷酸化共同调节水通道活性的
机制 在 «·³}ΠΠººº q¨¬³¤¶¼q²µªΠ·²²¯¶Π³¬p·²²¯ q«·°¯ 进行多肽
的理论等电点k³Œl的计算 o得到 ≤²°Œ°t2t的理论 ³Œ为 z1z o
但其 ‘端 ³Œ为 w1wt o因而在生理中性下 o胞内 ‘端带负电
荷 o而胞内 ⁄环k磷酸化位点 ≥„• ⁄与 ≥„×⁄所在的环 o图 {l
的 ³Œ为 {1w| o在生理中性下 o带正电荷 o则 ‘端和 ⁄环可能
发生静电作用 ∀有研究表明质膜 „±°的活性可能受胞质
³‹值的影响 o胞内 ⁄环的组氨酸残基k‹l似乎控制着这种
效应 o该残基被丙氨酸取代时胞质的酸化效应减弱
kײ∏µ±¤¬µ¨2•²∏¬ ετ αλqoussvl o考虑到能量的稳态 o⁄环容易
内向折叠k≤«¤∏°²±·ετ αλqoussxl ∀ ≤²°Œ°t2t含有这样的一
个组氨酸k‹¬¶us{ o⁄环上紧邻磷酸化位点 ≥„• ⁄后l o可感
受 ³‹值的变化 ∀ ⁄环 Ž•≥„• kust p usx ¤¤l中含有空间上
紧邻的 v个带正电荷的残基kt个 Ž!u个 • l o强化了局部的
荷电性 o紧邻的 us{位组氨酸如被质子化k即胞内 ³‹下降l o则正电势更强 o从而与带负电荷的 ‘端发生静
电作用的可能性增强 o导致 ⁄环内向折叠而覆盖了水通道孔口 o因而 ≤²°Œ°t2t可能为组成型的低活性 ∀但
就在 ⁄环的 Ž•≥„• kust p usx ¤¤l的两侧各有 u个磷酸化位点k图 {以黑色标出l }≥„• ⁄kusv p usy ¤¤l !≥„×⁄
kt|y p t|| ¤¤l o因而在某些激酶作用下引起磷酸化级联反应 o该位点的磷酸化基团所带的负电荷及空间位置
wx 林 业 科 学 ww卷
效应可能减弱了 ⁄环与 ‘端的静电作用 o最终解除了水通道孔口的覆盖 o使 ≤²°Œ°t2t行使水通道功能 ∀同
理 o胞内 …环上带正电荷的 • Ž≥ktuy p tu| ¤¤l的磷酸化 o消弱了自身的正电荷 o从而减弱了 • Ž≥与 ‘端的
静电吸引 o并可能同 ≥„• ⁄与 ≥„×⁄两位点的磷酸化协同而最终解除通道口的覆盖 ∀作者认为 o≤²°Œ°t2t的
活性可受磷酸化和质子化的共同调节 o其实质是 ⁄环与 ‘端的静电作用导致通道口的覆盖与去覆盖 o质子
化增强 ⁄环的覆盖倾向 o而磷酸化则是去覆盖从而增强水通道活性 ∀
w 结论与讨论
411 5χ2ΡΑΧΕ产物的序列与原 ΕΣΤ的正确拼接
xχ2• „≤∞产物的序列与原 ∞≥×拼接的正确性取决于交错模板的特异性 ∀如果目的基因是属于一个多基
因家族 o而两重叠模板的相似性高会导致其两端的引物设计特异性降低 o因此通过 xχ2• „≤∞就可能得到多个
缺失的序列信息 o导致错误的序列拼接 ∀本试验采用的 u个引物 ‘Š≥°和 „±°ƒ¬间的核酸序列k图 v中的重
叠区l较长ktu| ¥³l o其间的氨基酸序列对应于 „±°同源蛋白的 אt !„环的可变区和全部的 אu及部分 …
环 o因此具有基因特异性 o可确保得到的 u个 xχ2• „≤∞序列信息正确对应于油茶文库的 yt{y号克隆 ∞≥×序
列 ∀两者 xχ2˜×• 有差异 o这可能是因为 ≤²°Œ°t2t的表达调控存在不同的方式 o以应对不同的环境刺激或生
理状态的改变 ∀
412 ΧοΠΙΠ121的水通道活性调控机制与油茶种子的氧化胁迫状态
≤²°Œ°t2t胞内通道口的 …环 !⁄环 !‘端和 ≤端存在几个活性位点 ∀在正常生理 ³‹时 o≤²°Œ°t2t的 ‘端
带负电 o它与带正电荷的某些位点的静电作用导致通道口被 ⁄环与 ‘端覆盖 o质子化增强了这种覆盖倾向 o
而磷酸化的作用相反 o可上调 ≤²°Œ°t2t的水通道活性 ∀因此 o≤²°Œ°t2t的水转运活性在正常生理 ³‹下可能
不高 ∀根据经验统计 o°Œ°t !°Œ°u和 ׌°的 ‘端残基数依次递减 o但活性却有增强的趋势k≥¦«¡©©±¨ µot||{ ~
≤«¤∏°²±·ετ αλqousssl o究其原因 o可能是 ‘端越长 o与 … !⁄环的作用可能性越大 o⁄环与 ‘端越有可能覆盖
孔口k图 {l ∀如 ‘端足够长 o即使存在磷酸化的调节 o也可以阻塞通道口 ∀胞内的 v个磷酸化位点 o可被胞
内或膜偶联的激酶磷酸化 o这是可理解的 o但胞外也存在 v个磷酸化位点 o其激酶种类和来源又是什么呢 ‚
近年的研究表明 o钙调素k≤¤l可以分泌到胞外并与其受体结合 o并证明胞外 ≤¤ 存在多个受体k周华林等 o
usstl o现证明动物 „±°s上存在 ≤¤ 的结合位点并可与 ≤¤ 结合k•²¶¨ ετ αλqouss{l ∀那么 o由于 „±°在不
同物种间的保守性 o≤²°Œ°t2t的活性是否也通过 ≤¤ 在胞外与磷酸化位点相互作用而得到调节 ‚对该问题
的探讨可能有助于揭示油茶或其他植物种子成熟时的脱水机理 ∀
黄瓜k Χυχυµισσατιϖυσl k¨¨ ετ αλqousswl !番茄kΛψχοπερσιχον εσχυλεντυµlk…¯²²° ετ αλqousswl !菠菜kƒ ±¨±¨ ¯¯
ετ αλqot||{l与玉米k¨¯®²±¬¤± ετ αλqousswl的根置于寒冷下引起过氧化氢在质膜周围的释放 o并降低根水
通道蛋白的水力传导度k«¼§µ¤∏¯¬¦¦²±§∏¦·¬√¬·¼l ~直接应用外源的过氧化氢也可导致皮层细胞水力传导度的
降低 o认为这是 „±°的水转运活性受过氧化氢的影响而降低所致k¨¨ ετ αλqousswl ∀还发现活性氧种类
k• ’≥l抑制珊瑚轮藻k Χηαρα χοραλλινεl节间细胞水通道的活性k‹ ±¨½¯ µ¨ετ αλqousswl o可诱导细胞水压导度下
降 |s h o这比经典的汞盐抑制更有效 ∀推测羟自由基通过所谓的氧化门控机制作用 o直接氧化 „±°或间接
氧化脂质膜并形成次级自由基k‹ ±¨½¯ µ¨ετ αλqousswl o它们可能扳动一系列的级联效应最终导致 „±°的活性
下调 ∀在油茶 ¦⁄‘„ 文库中发现有多种与脱水胁迫或氧化胁迫有关的保护蛋白与解毒蛋白k谭晓风等 o
ussyl o还发现 t条活性氧来源之一的 ‘„⁄°‹氧化酶的 ∞≥× o暗示成熟或近成熟的油茶种子中 • ’≥有相当的
积累 ∀
综上 o认为 ≤²°Œ°t2t在油茶近成熟种子中是组成型低活性的水通道蛋白 o这有待试验进一步验证 ∀
413 ΧοΠΙΠ121在近成熟油茶种子中的表达丰度与水分调节
早期的研究指出一些物种的干燥种子中 °Œ°含量极低 o甚至检测不出k⁄¤±¬¨ ¶¯ ετ αλqot||w ~Š¤² ετ αλqo
t||| ~≥∏ª¤ ετ αλqousstl o其表达量的提高仅出现在胚生长的后期 o如 o在干燥的油菜k Βρασσιχα ναπυσl种子中
°Œ°u的 °• ‘„为低水平积累kŠ¤² ετ αλqot|||l ∀从与油茶 „±°比对的 tss个物种的 „±°同源蛋白数量来
看 o一般都为 t条 o提示不同物种的该同源基因属于低丰度表达 ∀实际上油茶 ¦⁄‘„文库中也仅有 t条 o本
研究克隆出 u条 ∀在油茶种子近成熟或成熟期 o贮藏性物质k酯酰甘油 !蛋白质 !淀粉l的积累达到高峰 o种子
内水分含量下降 o位于质膜上的 ≤²°Œ°t2t的编码基因表达的低丰度及蛋白的低活性暗示此时种子内胞外的
xx 第 tu期 胡孝义等 }油茶种子水通道蛋白 ≤²°Œ°t2t的鉴定与分析
水分进入胞内受到抑制 o这种趋势与油茶油脂合成的联系尚待研究 ∀
参 考 文 献
≥¤°¥µ²²®o •∏¶¶¨¯¯ ⁄ • qussu q分子克隆实验指南 q黄培堂 o等译 qv版 q北京 }科学出版社 ouy p uz q
隋海心 o任 罡 qussw q水分子通道蛋白的结构与功能 q化学进展 otykul }twy p txu q
谭晓风 o胡芳名 o谢禄山 o等 qussy1 油茶种子 ∞≥×文库构建及主要表达基因的分析 q林业科学 owuktl }wv p w{ q
周华林 o马力耕 o刘 曼 o等 qusst q转融合基因烟草中钙调素分泌特性的研究 q植物学报 owvktul }tvss p tvsu q
„«¤µ²± • o≥«¤«¤® ≠ o •¬±¬±ª¨µ≥ o ετ αλqussv1 ’√¨ µ¨¬³µ¨¶¶¬²± ²©¤ ³¯¤¶°¤ ° °¨¥µ¤±¨ ¤´ ∏¤³²µ¬±¶¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦²¬°³µ²√¨ ¶³¯¤±·√¬ª²∏µ∏±§¨µ©¤√²∏µ¤¥¯¨
ªµ²º·«¦²±§¬·¬²±¶¥∏·±²·∏±§¨µ§µ²∏ª«·²µ¶¤¯·¶·µ¨¶¶q°¯ ¤±·≤¨¯¯otx }wv| p wwz q
…¤µ²±¨ o≥«¬« ≤ o • ¤¶¶¨µ°¤± ° qt||z1  µ¨¦∏µ¼2¬±§∏¦¨§¦²±©²µ°¤·¬²±¤¯ ¦«¤±ª¨¶¤±§¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©¦²±¶¨µ√¨ §¶∏µ©¤¦¨ ²¯²³¶¬± ³¯¤¶°¤ ° °¨¥µ¤±¨ ¤´ ∏¤³²µ¬±¶
©µ²° «¬ª«¨µ³¯¤±·¶q…¬²¯ ≤«¨ ° ouzu }vsyzu p vsyzz q
…¯²²° „ o º¬¨±¬¨¦®¬  „ o °¤¶¶²∏µ¤  …o ετ αλq ussw1 • ¤·¨µµ¨ ¤¯·¬²±¶∏±§¨µµ²²·¦«¬¯¯¬±ª¬± ¤ ¶¨±¶¬·¬√¨ ¤±§·²¯ µ¨¤±··²°¤·² ¶³¨¦¬¨¶q °¯¤±·o ≤¨¯¯ ¤±§
∞±√¬µ²±°¨ ±·ouz }|zt p |z| q
≤«¤∏°²±·ƒ o…¤µµ¬¨∏ƒ o∏±ª • o ετ αλqusss1 °¯ ¤¶°¤ °¨ °¥µ¤±¨ ¬±·µ¬±¶¬¦³µ²·¨¬±¶©µ²° °¤¬½¨ ¦¯∏¶·¨µ¬± ·º² ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¶∏¥ªµ²∏³¶º¬·« §¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ¤´ ∏¤³²µ¬±
¤¦·¬√¬·¼q°¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ otuu }tsux p tsvw q
≤«¤∏°²±·ƒ o ²¶«¨ ¬¯²±  o⁄¤±¬¨ ¶¯  qussx1 • ª¨∏¯¤·¬²± ²©³¯¤±·¤´ ∏¤³²µ¬± ¤¦·¬√¬·¼q…¬²¯ ≤¨¯¯o|z }zw| p zyw q
≤«µ¬¶³¨ ¨¯¶  o ¤∏µ¨¯ ≤ qt||w1 „ ∏´¤³²µ¬±¶}·«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¥¤¶¬¶²©©¤¦¬¯¬·¤·¨§º¤·¨µ°²√ °¨ ±¨··«µ²∏ª« ¬¯√¬±ª³¯¤±·¦¨¯¯¶‚°¯ ¤±·°«¼¶¬²¯ otsx }| p tv q
≤²°³¤µ²·≥ o ²µ¬¯²± • qusss1 • ¤·¨µ³¨µ°¨ ¤¥¬¯¬·¼ ¤±§µ¨√²¯√¬±ª °²√¨ °¨ ±·¬± Πηασεολυσϖυλγαρισq°¯¤±·≤¨¯¯ °«¼¶¬²¯ owt }ttw p tt{ q
⁄¤±¬¨ ¶¯  o ¬µ®²√ × ∞o≤«µ¬¶³¨ ¨¯¶ qt||w1 ׫¨ ³¯¤¶°¤ °¨ °¥µ¤±¨ ²© Αραβιδοπσιστηαλιανᦲ±·¤¬±¶¤ ° µ¨¦∏µ¼2¬±¶¨±¶¬·¬√¨¤´ ∏¤³²µ¬±·«¤·¬¶¤«²°²¯²ª²©·«¨
·²±²³¯¤¶·º¤·¨µ¦«¤±±¨ ¯ ³µ²·¨¬± ׌° q°¯¤±·°«¼¶¬²¯ otsy }tvux p tvvv q
ƒ ±¨±¨ ¯¯ „ o ¤µ®«¤µ·„ qt||{1 •¤³¬§¤¦¦¯¬°¤·¬²± ²©µ²²·«¼§µ¤∏¯¬¦¦²±§∏¦·¬√¬·¼·² ²¯º ·¨°³¨µ¤·∏µ¨ q²∏µ±¤¯ ²© ∞¬³¨µ¬° ±¨·¤¯ …²·¤±¼ow| }{z| p {{w q
Š¤² ≠ ° o ≠²∏±ªo…²±«¤° p ≥°¬·«° o ετ αλqt|||1 ≤«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²± ¤±§ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©³¯¤¶°¤¤±§·²±²³¯¤¶·°¨ °¥µ¤±¨ ¤´ ∏¤³²µ¬±¶¬± ³µ¬° §¨¶¨ §¨²© Βρασσιχα
ναπυσ§∏µ¬±ªª¨µ°¬±¤·¬²± ∏±§¨µ¶·µ¨¶¶¦²±§¬·¬²±¶q°¯ ¤±·²¯ …¬²¯ ows }yvx p yww q
‹ ±¨½¯ µ¨× o ≠¨ ± o≥·¨∏§¯¨∞qussw q’¬¬§¤·¬√¨ª¤·¬±ª²© º¤·¨µ¦«¤±±¨ ¶¯k¤´ ∏¤³²µ¬±¶l ¬± ≤«¤µ¤¥¼ «¼§µ²¬¼¯ µ¤§¬¦¤¯¶q °¯¤±·o ≤¨¯¯ ¤±§ ∞±√¬µ²±° ±¨·ouz }tt{w p
tt|x q
¤±ª≠ o¨¨≥ ‹ o• «¨ ¨≠ o ετ αλqussz1 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦Αραβιδοπσι󤱧·²¥¤¦¦²³¯¤±·¶²√ µ¨¨¬³µ¨¶¶¬±ª¤± ¤´ ∏¤³²µ¬±µ¨¶³²±§§¬©©¨µ¨±·¯¼·²√¤µ¬²∏¶¤¥¬²·¬¦¶·µ¨¶¶¨¶q
°¯ ¤±·²¯ …¬²¯ oyw }yut p yvu q
²«¤±¶¶²± ŒoŽ¤µ¯¶¶²±  o²«¤±¶²± ˜ o ετ αλqusss1 ׫¨ µ²¯¨²©¤´ ∏¤³²µ¬±¶¬± ¦¨¯¯∏¯¤µ¤±§º«²¯¨³¯¤±·º¤·¨µ¥¤¯¤±¦¨ q…¬²¦«¬° …¬²³«¼¶„¦·¤otwyx }vuw p vwu q
²«¤±¶¶²± ŒoŽ¤µ¯¶¶²±  o≥«∏®¯¤ ∂ o ετ αλqt||{1 • ¤·¨µ·µ¤±¶³²µ·¤¦·¬√¬·¼ ²©·«¨ ³¯¤¶°¤ °¨ °¥µ¤±¨ ¤´ ∏¤³²µ¬± °u{„ ¬¶µ¨ª∏¯¤·¨§¥¼ ³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²±q°¯¤±·≤¨¯¯
∞±√¬µ²±ots }wxt p wx| q
Ž­¨ ¥¯²° ° o¤µ¶¶²± ≤ o²«¤±¶¶²± Œo ετ αλqt|||1 „ ∏´¤³²µ¬±¶¤±§º¤·¨µ«²°¨ ²¶·¤¶¬¶¬± ³¯¤±·¶q×µ¨±§¶°¯¤±·≥¦¬ow }vs{ p vtw q
¨¨≥ ‹ o≥¬±ª« „ ° o ≤«∏±ª Š ≤ qussw1 •¤³¬§¤¦¦∏°∏¯¤·¬²± ²©«¼§µ²ª¨ ± ³¨µ²¬¬§¨ ¬± ¦∏¦∏°¥¨µµ²²·¶§∏¨ ·² ¬¨³²¶∏µ¨ ·² ²¯º ·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ¤³³¨¤µ¶·² ° §¨¬¤·¨
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k责任编辑 徐 红l
yx 林 业 科 学 ww卷