全 文 ：第 wu卷 第 ts期
u s s y年 ts 月
林 业 科 学
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无菌松材线虫对 ts年生黑松致病性的研究
池树友t ou 韩正敏u 何月秋u
kt1 宁波市森林病虫防治检疫站 宁波 vtxsts ~u1南京林业大学森林资源与环境学院 南京 utssvzl
摘 要 } usst年 |月 o用无菌的松材线虫对 ts年生黑松进行接种 ∀ussu年 {月 o检查黑松发病情况 o并对接种的
松树进行线虫和细菌的再分离 ∀试验发现 }接种的 {株黑松 tt个月后仍有 x株表现正常 o没有出现任何症状 o而从
其木质部却能分离到数量较多的无菌松材线虫 ∀结果说明 }无菌的松材线虫虽然能侵入松树木质部 o但在不携带
细菌的情况下对松树是没有致病力的 ∀
关键词 } 无菌 ~松材线虫 ~黑松 ~接种 ~致病性
中图分类号 }≥zyv1tt 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylts p sszt p sv
收稿日期 }ussx p sv p sv ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目kv||zsytw ovssvsttsl ∀
Στυδιεσ ον τηε Πατηογενιχιτψ οφ 10 Ψεαρσ Ολδ Βλαχκ ΠινεΙνοχυλατεδ
ωιτη Ασεπτιχ Πινε Ωοοδ Νεµατοδε
≤«¬≥«∏¼²∏tou ‹¤± «¨ ±ª°¬±u ‹¨≠∏¨ ¬´∏u
kt1 Φορεστ Πεστ Χοντρολανδ Θυαραντινε Στατιον οφ Νινγβο Νινγβο vtxsts ~
u1 Χολλεγε οφ Φορεστ Ρεσουρχεσ ανδ Ενϖιρονµεντo Νανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγ utssvzl
Αβστραχτ} ts2¼¨ ¤µ2²¯§ …¯¤¦® °¬±¨ ¶ º¨ µ¨ ¬±²¦∏¯¤·¨§ º¬·« ¤¶¨³·¬¦³¬±¨ º²²§ ±¨ °¤·²§¨¶ k Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσl ¬±
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Κεψ ωορδσ} ¤¶¨³·¬¦~ Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ~ Πινυστηυνβεργιι ~¬±²¦∏¯¤·¬²±~³¤·«²ª¨±¬¦¬·¼
自从 ’®∏kt|{sl首次提出细菌在松材线虫病中的致病作用以来 o很多学者对松材线虫病的真正致病原
因进行了大量的试验 ∀曹越等kt||yl首先提出了松材线虫不能产生致萎毒性物质 ∀随后 o赵博光等kusssl !
谈家金等kusstl !洪英娣等kussvl和 ‹¤±等kussvl进行了大量的接种试验 o证明了无菌松材线虫对黑松
k Πινυστηυνβεργιιl愈伤组织及无菌苗并没有致病作用 o只有当无菌松材线虫与致病细菌混合接种时 o才能对
愈伤组织及无菌苗产生致病力 ∀据此 o提出了松材线虫病真正的病原是松材线虫携带的致病细菌 ∀虽然利
用愈伤组织和尚未完全木质化的松树幼苗在一定程度上可以反映松材线虫的致病性 o但在自然界松材线虫
病危害的均是完全木质化的多年生大树 o所以要真正反映无菌松材线虫的致病性 o必须要在完全木质化的大
树上进行检验 ∀本次试验在野外采用相对无菌的接种方法 o测定了无菌松材线虫对 ts年生黑松的致病性 ∀
t 材料与方法
111 松材线虫的分离 !无菌化处理与培养
松材线虫来源于南京市铁心桥镇自然感病死亡的 tx ∗ us年生的马尾松k Πινυσ µασσονιαναl ∀分离到的
松材线虫经纯化以后 o先经体积比为 v h的 ‹u ’u 处理 x °¬±o无菌水换洗 v次 o再用体积比为 s1sx h的硫酸链
霉素和硫酸庆大霉素k南京制药厂l混合液处理 x ∗ y次 o每次处理 x °¬±o不断振荡 o避免线虫沉入离心管底
部 o使抗菌素与线虫充分混合 ∀每次处理后均用无菌水换洗 v次 o处理后的线虫经 ‘…培养基平板检验确系
无菌后 o在超净工作台上于解剖镜下挑取雌 !雄成虫各 ts条 o放在黑松愈伤组织上 oux ε 黑暗培养 o后一直
在黑松愈伤组织上继代培养 ∀接种时用无菌水将线虫洗下 o调节线虫浓度直接使用 ∀
112 野外接种
试验对象为南京伊刘苗圃的 ts年生黑松 o采用树干打孔注射法接种 ∀先用 zs h的酒精棉擦拭接种部
位 o再用灭菌刀片削去树皮 o然后用灭菌的打孔器k 5s1x ¦°l对露出的木质部打出深度约为 t ¦° !开口斜向
上方的圆孔 o用灭菌的滴管吸取无菌松材线虫悬浮液 xss ˏk含线虫 ts sss条l滴加到圆孔中 o用无菌的棉花
球封住孔口 o在孔口边缘处涂抹抗菌素 o然后用胶带缠绕接种部位 o胶带外边再加涂一层抗菌素 o防止细菌侵
入 ∀操作过程中 o用经 zs h酒精浸泡过的塑料薄膜在树冠下部围一空间 o并在接种区域摆放 u盏燃烧的酒
精灯 o以减轻操作过程中的污染 ∀整个操作过程要求动作迅速 o尽量减轻因接种部位暴露时间过长而造成细
菌污染 ∀无菌松材线虫共接种 {棵松树 o以未经处理的自然松材线虫为对照 o接种 v棵松树 ∀
113 接种后的再分离
t1v1t 木质部的线虫分离及细菌检验 等到接种未经处理的自然松材线虫的松树k对照株l枯死时 o对所有
接种的松树进行取样 ∀未发病的松树采集任意枝条 o已经发病的松树采集其发病枝条进行分离检验 ∀采样
时用灭菌的剪刀迅速剪下枝条 o在切口处涂抹抗菌素 o并用胶带缠绕 o防止细菌侵入 ∀采回的枝条做如下 u
种处理 }一部分用于线虫分离 o将枝条的皮剥去 o劈成小木片后 o用浅盘法分离松材线虫并计算每克木材中的
线虫数 ~一部分用于细菌检验 o剥去树皮 o在超净工作台上用 zs h的酒精棉擦拭消毒 o然后用灭菌的解剖刀
削去边材 o取木质部 o削成 us °° ≅ ts °°的薄片放在 ‘…培养基平板上 ou{ ε 下黑暗培养 ou ∗ v §后观察细
菌分离结果 ∀
t1v1u 线虫的无菌检验 为进一步确定松枝条内的线虫是否携带细菌 o进行线虫的无菌检验 ∀剥去树皮 o
在超净工作台上用 zs h的酒精进行表面消毒 o将木质部削成薄片 o直接放在长满灰葡萄孢k Βοτρψσ χινερεαl的
°⁄„平板上 ∀为使其内部的线虫易于爬出 o在木片上滴加少许无菌水 oux ε 下培养 ∀待线虫从木片中爬出
并取食灰葡萄一段时间后 o挑取线虫连同 °⁄„培养基直接放在 ‘…培养基平板上检验 ou{ ε 黑暗培养 ou ∗ v
§后观察是否有细菌菌落长出 ∀
u 结果与分析
211 发病情况
usst年 |月进行野外接种 oussu年 {月检查发病情况k表 tl ∀无菌松材线虫接种的 {株黑松中 ot株完
全枯死 ou株部分枝条表现枯萎症状 ox株完全健康 ~作为对照的接种未经处理的自然松材线虫的 v株松树全
部枯死 ∀
表 1 松材线虫野外接种 10 年生黑松的发病情况和再分离结果 ≠
Ταβ .1 ∆εατη ανδ ρεχοϖερψ οφ τηε νεµατοδεσ ανδ βαχτεριυµ φροµ 102ψεαρ2ολδ Π . τηυνβεργιι ινοχυλατεδ ωιτη Β . ξψλοπηιλυσ
处理
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松树状况
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线虫数
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树体内细菌
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线虫带菌
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接种无菌松材线虫
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t 正常 ‹ ¤¨¯·«¼ ws p p
u 正常 ‹ ¤¨¯·«¼ yu p p
v tΠw枝条枯死 ’±¨ ©²∏µ·«§¨¤§ xv n n
w 整株枯死 ⁄¨ ¤§ ±¨·¬µ¨ ¼¯ u ysy n n
x 正常 ‹ ¤¨¯·«¼ tz p p
y 正常 ‹ ¤¨¯·«¼ s p
z tΠv枝条枯死 ’±¨ ·«¬µ§§¨¤§ vvs n n
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接种自然线虫
• ¬¯§³¬±¨ º²²§
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| 整株枯死 ⁄¨ ¤§ ±¨·¬µ¨ ¼¯ u wxs n n
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tt 整株枯死 ⁄¨ ¤§ ±¨·¬µ¨ ¼¯ u sw{ n n
≠ n }分离到 ≥ ³¨¤µ¤·¨§~p }未分离到 ‘²·¶¨³¤µ¤·¨§q
212 再分离结果
对所有接种株的再分离结果显示k表 tl o只有 t株健康松树体内未分离到松材线虫 ∀接种无菌松材线
虫的 {株松树中 o发病的 v株松树体内均分离到线虫和细菌 o线虫经检验体表携带大量细菌 ~另外 x株表现
正常的松树体内均未分离到任何细菌 o有 w株分离到松材线虫 o分离到的线虫经检验没有携带细菌 o均为无
菌线虫 ∀作为对照的接种自然松材线虫的 v株松树体内均分离到大量的线虫和细菌 o线虫经检验携带大量
细菌 ∀
uz 林 业 科 学 wu卷
接种无菌松材线虫的 { 株松树中 o完全枯死的 t 株其体内线虫量数最多 o木材样品含虫量为
u ysy条#ªpt ~部分枝条枯死的 u株松树中 ot株样品含虫量为 vvs条#ªpt o另 t株为 xv条#ªpt ~而树体内含有
线虫却没有表现症状的 w株松树中 o样品平均含虫量为 wz条#ªpt ∀接种自然松材线虫完全死亡的 v株松树
体内线虫平均含量为 u usy条#ªpt ∀
v 讨论
以前进行的无菌松材线虫接种试验 o均是在室内用无菌黑松幼苗作为接种对象的 o虽然试验取得了一致
结果 o证明了无菌松材线虫不能引起松苗萎蔫 o但因所采用的松苗没有完全木质化 o与自然界感病松树差异
较大 o所以不得不对试验结果的可靠性提出质疑 ∀本次试验将无菌松材线虫接种到野外 ts年生黑松上 o其
过程与自然界有很大的相似性 o能真实反映自然界的情况 ∀
从本次试验的再分离结果看 o凡是木质部有细菌存在的接种株 o均已表现了典型的枯萎症状 ~而木质部
没有细菌的植株 o尽管其内部有松材线虫存在 o植株也不表现症状 ∀这一结果与室内试验结果基本一致 o也
同样说明细菌的存在是松树发病的关键 ∀
פ°∏µ¤kt|{vl用无菌松材线虫接种 v年生黑松 o但接种结果和本试验几乎相反 o接种株大多发生了枯
萎 ∀ Ž¤º¤½∏等kt||z ~t||{l对 פ°∏µ¤的试验结果指出了异议 o认为 פ°∏µ¤试验所用的黑松苗并不是无菌苗 o
致病的细菌在树体表面普遍存在 o当无菌线虫侵入松苗时重新感染上这些细菌 o从而又获得致病性 ∀在进行
本试验时 o也考虑到了这方面因素 ∀在接种操作时 o尽量快速并进行了一些防护措施以避免污染 ∀但毕竟是
在野外操作 o接种对象又是 ts年生的大树 o不可避免地会造成一些污染 o这也可能是 v株接种无菌松材线虫
的松树发生枯萎的原因 ∀本次试验接种无菌松材线虫的处理中 o有 v株松树表现了枯萎症状 ∀从表面上看 o
似乎接种无菌松材线虫也同样能够致病 o但经检验这 v株松树的木质部均有大量细菌存在 o其体内的松材线
虫也都是携带细菌的线虫 ∀无菌的松材线虫 o如何变成了携带细菌的线虫 ‚可能正如 Ž¤º¤½¤等提出的 }这
种致病的细菌在自然界中普遍存在 o细菌可以在接种时或后来通过松树体上其他伤口进入松树体内 ∀
从线虫和细菌的再分离结果看 o凡是发病的植株 o其体内都有细菌存在 o并且线虫的数量较多 ~而健康植
株体内不存在细菌 o线虫数量也较少 ∀这一结果可能有截然不同的 u方面解释 }一是松树是否发病与其体内
的线虫数量有关 o没有发病的松树是由于线虫没有繁殖到一定数量 o待树体内的线虫达到一定量后 o松树就
会出现枯萎症状 ∀也就是说 o松树的枯萎与细菌无关 o而与线虫数量有关 ∀二是松材线虫的繁殖与细菌的存
在有关 o细菌和线虫具有一定的共生关系 o细菌的存在有利于线虫的繁殖 ∀所以 o存在细菌的枯萎植株内 o线
虫数量也多 ∀这 u方面的解释 o似乎均有一定的道理 o但笔者认为后者更有说服力 o原因有 v }其一 o凡是松
材线虫病致死的松树 o其木质部内均能分离到细菌k‹¤± ετ αλ1 oussvl ~其二 o作者在松材线虫培养过程中发
现 o凡携带细菌的松材线虫繁殖速度比无菌的松材线虫快得多 ~其三 o本研究中的 v号接种株 o树体内有细
菌存在 o但其木质部内线虫数量并不很多 o却已表现了枯萎症状 ∀
参 考 文 献
曹 越 o沈伯葵 qt||y q人工培养条件下松材线虫提取物的毒性研究 q南京林业大学学报 ous kwl }tv p ty
洪英娣 o赵博光 o曹 越 o等 qussv q松材线虫携带细菌的致病性 q南京林业大学学报 ouzkul }wx p w{
谈家金 o王新荣 o冯志新 qusst q松材线虫伴生细菌与松树萎蔫病关系的初步研究 q植物检疫 otxkxl }vux p vu{
赵博光 o郭道森 o高 蓉 o等 qusss q细菌分离物 …yt|与松材线虫病关系的初步研究 q南京林业大学学报 ouwkwl }zu p zw
‹¤±   o ‹²±ª ≠ ⁄o«¤² … Š qussv q„ ¶·∏§¼ ²± ³¤·«²ª¨ ±¬¦¬·¼ ²©¥¤¦·¨µ¬¤¦¤µµ¬¨§¥¼ ³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨¶q°«¼·²³¤·«²¯²ª¼otxt }t p z
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k责任编辑 朱乾坤l
vz 第 ts期 池树友等 }无菌松材线虫对 ts年生黑松致病性的研究