全 文 ：第 wv卷 第 t期
u s s z年 t 月
林 业 科 学
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∂²¯1wv o‘²1t
¤±qou s s z
松树脂溃疡病菌的分子检测 3
廖太林t ou 李百胜u 叶建仁t 纪 睿u 吴翠萍v 安榆林v 陈建东v
kt1 南京林业大学 南京 utssvz ~ u1 江苏昆山出入境检验检疫局 昆山 utxvst ~ v1江苏出入境检验检疫局 南京 utsss|l
关键词 } 松树脂溃疡病菌 ~分子检测 ~巢式 °≤•
中图分类号 }≥zyv1tx 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszlst p sttt p sx
收稿日期 }ussy p sv p s| ∀
基金项目 }国家质检总局立项课题/松树脂溃疡病随木材传入中国的风险分析及检疫鉴定技术研究0的一部分kusswŒŽszxl ∀
3 感谢南京农业大学王克荣教授 !陈利锋教授提供了部分试验所需的对照菌株 ∀
Μολεχυλαρ ∆ετεχτιον οφ Φυσαριυµ χιρχινατυµ oτηε Χαυσαλ Αγεντ
οφ Πινε Πιτχη Χανκερ
¬¤² פ¬¯¬±tou ¬…¤¬¶«¨ ±ªu ≠¨¬¤±µ¨±t ¬•∏¬u • ∏≤∏¬³¬±ªv „± ≠∏¯¬±v ≤«¨ ± ¬¤±§²±ªv
kt1 Νανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγ utssvz ~u1 Κυνσηαν Εξιτ2ΕντρψΙνσπεχτιον ανδ Θυαραντινε Βυρεαυ
οφ ϑιανγσυ Προϖινχε Κυνσηαν utxvst ~v1 ϑιανγσυ Εξιτ2ΕντρψΙνσπεχτιον ανδ Θυαραντινε Βυρεαυ οφ Χηινα Νανϕινγ utsss|l
Αβστραχτ } Φυσαριυµ χιρχινατυµ o·«¨ ¦¤∏¶¤¯ ¤ª¨ ±·²© ³¬·¦«¦¤±®¨µ§¬¶¨¤¶¨ o¦¤∏¶¨¶¶¨√¨ µ¤¯ ¶¨µ¬²∏¶§¬¶¨¤¶¨¶²© ³¬±¨ ¶q ׫¨
³¤·«²ª¨±¬±©¨¦·¶¤√¤µ¬¨·¼ ²©√¨ ª¨·¤·¬√¨ ¤±§µ¨³µ²§∏¦·¬√¨ ³¬±¨ ¶·µ∏¦·∏µ¨¶¤·§¬©©¨µ¨±·¶·¤ª¨¶²©°¤·∏µ¬·¼¤±§³µ²§∏¦¨¶¤§¬√¨ µ¶¬·¼ ²©
¶¼°³·²°¶q²±ª§¬¶·¤±¦¨ ¶³µ¨¤§²©·«¨ §¬¶¨¤¶¨ ²¦¦∏µ¶º«¨ ± °¤·¨µ¬¤¯¶¬±©¨¦·¨§º¬·«·«¨ ³¬·¦«¦¤±®¨µ©∏±ª∏¶¤µ¨·µ¤±¶³²µ·¨§·²³¨¶·
©µ¨ p¨¤µ¨¤q°µ¨√¨ ±·¬±ª§¬¶¨¤¶¨ ¶³µ¨¤§¬¶¬°³²µ·¤±·¥¨¦¤∏¶¨ ²±¦¨ ³¬·¦«¦¤±®¨µ¥¨¦²°¨ ¶ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨§¬± ¤µ¨¤·«¨µ¨ ¬¶±² º¤¼·²¶·²³
¬·©µ²°¬±©¨¦·¬±ª¤±§®¬¯¯¬±ª·µ¨ ¶¨q׫¨ ²¥­¨¦·¬√¨ ¶²©²∏µ¶·∏§¼ º¤¶·² ¶¨·¤¥¯¬¶«¤©¤¶·¤±§µ¨ ¬¯¤¥¯¨§¬¤ª±²¶·¬¦·¨¶·©²µ·«¨ ³µ¨¶¨±¦¨
²© Φq χιρχινατυµ q׫¨ ²¯¬ª²±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ³µ¬°¨ µ¶ŠtЊu kxχ2Š≤ŠŠ×Š×≤ŠŠ×Š×Š≤×׊ׄ2vχΠxχ2„≤×≤„≤ŠŠ≤≤„≤≤„„„≤≤„≤2
vχl o§¨µ¬√¨ §©µ²°·«¨ §¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± ²©¬±·¨µª¨±¬¦¶³¤¦¨µkŒŠ≥l µ¨ª¬²±¶º¬·«¬± ©∏±ª¬o¤°³¯¬©¬¨§¤¶¬±ª¯¨{zv ¥³³µ²§∏¦·©µ²°
Φυσαριυµ ¶³³qq׫¨ ŒŠ≥ ⁄‘„ ¶¨ ∏´¨±¦¨¶²© Φυσαριυµ ¶³³q º¨ µ¨ ª¤¬±¨ §©µ²° Š¨ ±…¤±®q ’¯¬ª²±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ³µ¬°¨ µ¶≥tΠ≥u kxχ2
≤×ׄ≤≤×׊Š≤×≤Š„Š„„ŠŠ2vχΠxχ2≤≤ׄ≤≤≤ׄ≤„≤≤×≤×≤„≤×2vχl o§¨µ¬√¨ §©µ²° ŒŠ≥ ⁄‘„ o¤°³¯¬©¬¨§¤³µ²§∏¦·²©vyw ¥³
º«¬¦«º¤¶∏±¬´∏¨ ·² Φq χιρχινατυµ q ׫¨ ±¨ ¶·¨§2°≤• ∏¶¬±ª ³µ¬°¨ µ¶ŠtЊu ¤±§ ≥tΠ≥u ¬§¨±·¬©¬¨§ Φq χιρχινατυµ ©µ²° ²·«¨µ
Φυσαριυµ ¶³³qq׫¬¶°≤• ¤¶¶¤¼ º¤¶³µ²√¨ §·²¥¨ «¬ª«¯¼ ¶¨±¶¬·¬√¨ º¬·«·«¨ §¨·¨¦·¬²± ¬¯°¬·²©x ≅ tsp v ³ª#ˏpt ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ ²µ
ts ¶³²µ¨¶#ktss ˏlpt ‹u ’ q׫¨ µ¨¶∏¯·¬±§¬¦¤·¨¶·«¤··«¨ ±¨ ¶·¨§2°≤• ¦²∏¯§¶∏¦¦¨¶¶©∏¯¯ ¼ ∏¶¨§·² §¨·¨¦··«¨ ³µ¨¶¨±¦¨ ²© Φq
χιρχινατυµ §¬µ¨¦·¯¼©µ²°¬±©¨¦·¨§³¯¤±··¬¶¶∏¨ q
Κεψ ωορδσ} Φυσαριυµ χιρχινατυµ ~°²¯ ¦¨∏¯¤µ§¨·¨¦·¬²±~±¨ ¶·¨§2°≤•
松树脂溃疡病k Φυσαριυµ χιρχινατυµl为美国 !南非等国外针叶树上发生的一种危险性林木病害k≥·²µ¨µετ
αλqot||w ~∂¬¯­²¨ ± ετ αλqot||wl ∀该病害常引起寄主树干流脂溃疡 !雌花和球果坏死 !种子变质以及苗木枯
死 ∀其病原菌可随种子 !苗木 !病木木材 !媒介生物以及黏附土壤进行远距离传播 ∀日本 t|{|年kŽ²¥¤¼¤¶«¬
ετ αλqot|{|l !墨西哥 t||t年kŠ∏¨µµ¤ ετ αλqot||tl !南非 t||w年k∂¬¯­²¨ ± ετ αλqot||wl !智利 usst年k •¬±ª©¬¨ §¯
ετ αλqousstl等地相继发现有松树脂溃疡病为害 o该病害在世界各地呈现出迅速蔓延之势 ∀
松树脂溃疡病菌分类上被认为是李瑟组镰刀菌k Φυσαριυµ ¶¨¦·¬²± Λισεολαl的 t 个种 o其有性阶段为
Γιββερελλα φυϕικυροι k¶¤º¤§¤l Œ·² i Ž¬°∏µ¤中的交配群 ‹k≥·¨¨ ±®¤°³ ετ αλqo t|||l ∀除上述交配群外 oΓ q
φυϕικυροι至少还包括另外 z个在遗传上完全不同的交配群 o分别以 „ !… !≤ !⁄!∞ !ƒ !Š命名k…µ¬·½ ετ αλqo
t|||l ∀不同交配群具有定殖于特定寄主的倾向k∞¯ °¨ µot||xl ∀开展松树脂溃疡病菌检疫鉴定常常需要同
时进行致病性测定或与已知标准菌株进行有性杂交 o常规检疫鉴定方法费时费力 o有时结果还不准确 ∀
∂¬¯­²¨ ±等kt||zl o≥·¨¨ ±®¤°³等kt|||l以及 ≥¦«º¨ ¬ª®²©¯ µ¨等kusswl曾试着从基因角度揭示松树脂溃疡病菌与其
他近缘种间的差异 o相继建立了 • „°⁄!°≤• p • ƒ°以及实时 °≤• 检测方法 ∀然而综观以上方法 o有的实验
重复性不强 o有的难以直接应用于样品检测 o有的仪器要求和检测成本较高 o口岸实际应用难度极大 ∀本研
究的目的是建立一种经济 !快速 !简便且准确地检测方法 o为各口岸开展进境种子 !苗木 !木材检疫 o防止松树
脂溃疡病菌传入提供可靠的技术手段 ∀
1 材料和方法
t1t 供试菌株 供试菌株及相关特性见表 t ∀
表 1 供试菌株及来源
Ταβ .1 Στραινστεστεδ ανδ τηειρ οριγινσ
交配群类型
¤·¬±ª·¼³¨
菌 种
’µª¤±¬¶°
菌种编号
‘²q²©¶·µ¤¬±¶
寄 主
‹²¶·
来 源 ≠
• ¶¨²∏µ¦¨
‹ Φq χιρχινατυµ ‘ƒ˜‹ p t 加勒比松 Πινυσ χαριβαεα ‘≤„˜• k‘²µ·« ≤¤µ²¯¬±¤o˜≥„l
‹ Φq χιρχινατυµ ‘ƒ˜‹ p u 琉球松 Πqλυχηυεενσισ ‘≤„˜• k¤³¤±l
‹ Φq χιρχινατυµ ‘ƒ˜‹ p v 辐射松 Πq ραδιατα ‘≤„˜• kŠ¨ ²µª¬¤o˜≥„l
‹ Φq χιρχινατυµ ‘ƒ˜‹ p w 展叶松 Πq πατυλα ‘≤„˜• k≥²∏·« „©µ¬¦¤l
„ Φq µονιλιφορµε ‘„˜„ p t ‘„˜
„ Φq µονιλιφορµε ‘„˜„ p u ‘„˜
… Φq συβγλυτινανσ ‘„˜…p t ‘„˜
≤ Φq µονιλιφορµε ‘„˜≤ p t ‘„˜
≤ Φq µονιλιφορµε ‘„˜≤ p u ‘„˜
⁄ Φq προλιφερατυµ ‘„˜⁄p t ‘„˜
⁄ Φq προλιφερατυµ ‘„˜⁄p u ‘„˜
∞ Φq συβγλυτινανσ ‘„˜∞p t ‘„˜
∞ Φq συβγλυτινανσ ‘„˜∞p u ‘„˜
∞ Φq συβγλυτινανσ ‘„˜∞p v ‘„˜
ƒ Φq µονιλιφορµε ‘„˜ƒ p t ‘„˜
) Φq γραµινεαρυµ ‘„˜Š ‘„˜
) Φq σολανι ‘„˜≥ ‘„˜
) Πηψτοπητηορᶳ³q ≥±°
) Τιλλετιᶳ³q ≥±×
≠ ‘≤„˜• }美国应用农业研究中心 ‘¤·¬²±¤¯ ≤ ±¨·¨µ©²µ„ªµ¬¦∏¯·∏µ¤¯ ˜·¬¯¬½¤·¬²± • ¶¨¨¤µ¦«k˜≥„l ~‘„˜ }南京农业大学 ‘¤±­¬±ª„ªµ¬¦∏¯·∏µ¨ ˜±¬√ µ¨¶¬·¼q
t1u 菌株培养和菌丝体收集 将菌株接于 °⁄„培养基上 ous ∗ ux ε 黑暗培养 ts §o用接种针将菌丝体轻轻
刮下 o置于塑料管中 o冷冻干燥 o加少许石英砂研磨至细粉 op us ε 下保存 ∀
t1v 基因组 ⁄‘„的抽提 菌丝体基因组 ⁄‘„的抽提参照颜子颖等kt||{l的 ≤ׄ…法 ∀孢子基因组 ⁄‘„的
抽提参照 ≤∏¯¯¨ ±等kt||{l的冻融法 ∀
t1w 样品中病原菌基因组 ⁄‘„的抽提 tl种子中病原菌基因组 ⁄‘„的抽提 取 us ª松树种子于三角瓶
中 o加入灭菌水 o充分振荡洗涤 x °¬±o取洗涤液于 w sss µ#°¬±pt o离心 x °¬±o收集沉淀 o冻融法提取病菌
⁄‘„ o同 t1v1u ∀ul土壤中基因组 ⁄‘„的抽提 取 s1v ª土壤 o烘干 o充分碾碎 o加入 s qw h脱脂奶粉 o采用冻
融法提取病菌 ⁄‘„ o同 t1v1u ∀vl木屑中基因组 ⁄‘„的抽提 取 s1x ª锯木屑 o采用冻融法提取病菌 ⁄‘„ o同
t1v1u ∀
t1x 引物设计与合成 根据 Š¨ ±…¤±®中登录 Φυσαριυµ 属 vt种µ• ‘„基因内间隔区 ŒŠ≥序列 o利用引物设计
软件 k °µ¬°¨ x1tl o设计一对镰刀菌通用引物 ŠtЊu o序列为 }xχ2Š≤ŠŠ×Š×≤ŠŠ×Š×Š≤×׊ׄ2vχΠxχ2
„≤×≤„≤ŠŠ≤≤„≤≤„„„≤≤„≤2vχ o一 对 针 对 松 树 脂 溃 疡 病 菌 的 特 异 引 物 ≥tΠ≥u o序 列 为 } xχ2
≤×ׄ≤≤×׊Š≤×≤Š„Š„„ ŠŠ2vχΠxχ2≤≤ׄ≤≤≤ׄ≤„≤≤×≤×≤„≤×2vχ ∀引物合成委托上海基康生物技术有限公司
公司完成 ∀
t1y 分子检测体系的建立 第 t轮 °≤• 扩增的反应体系为 ux ˏo反应组分为 }ts ≅ µ¨¤¦·¬²± ¥∏©©¨µu1x ˏo
u1x °°²¯#pt ª≤¯ u t1x ˏots ³°²¯ #pt上下游引物各 s1x ˏots °°²¯ #pt §‘×° u ˏox ˜#ˏpt פ´ 酶
s1ux ˏo模板 ⁄‘„提取液 t ˏo灭菌水补足 ux ˏ∀以灭菌水代替模板 ⁄‘„作为阴性对照 ∀混合液在 °×≤
p uss °≤• 仪上进行扩增 o反应程序为 }|x ε 变性 x °¬±o进入循环 o|w ε 变性 vs ¶oxy ε 退火 wx ¶ozu ε 延伸
t °¬±ous个循环后 zu ε 延伸 ts °¬±∀
将第 t轮 °≤• 扩增产物稀释 tss倍 o取 t ˏ稀释液作为第 u轮扩增的模板 ∀第 u轮 °≤• 扩增的反应体
系体积为 ux ˏo反应组分为 }ts ≅ µ¨¤¦·¬²± ¥∏©©¨µu1x ˏou1x °°²¯#pt ª≤¯ u t1x ˏots ³°²¯#pt上下游引物各
s1x ˏots °°²¯#pt §‘×° u ˏox ˜#ˏpt פ´ 酶 s1ux ˏo灭菌水补足 ux ˏ∀以灭菌水代替模板 ⁄‘„作为阴
utt 林 业 科 学 wv卷
性对照 ∀混合液在 °×≤ p uss °≤• 仪上进行扩增 o反应程序为 }|w ε 变性 v °¬±o进入循环 o|w ε 变性 vx ¶o
yy ε 退火 xx ¶ozu ε 延伸 xs ¶ows个循环后 zu ε 延伸 tu °¬±∀取 ts ˏ扩增产物于 t1u h琼脂糖凝胶中电
泳 o∞…染色后 o于紫外灯下观察 o并于凝胶成像系统上检测并拍照 ∀
t1z 灵敏度的测定 将 ‘ƒ˜‹ p v的基因组 ⁄‘„稀释成 x ≅ tsx !x ≅ tsw !x ≅ tsv !x ≅ tsu !xs !x !x ≅ tsp t !x ≅
tsp u !x ≅ tsp v !x ≅ tspw !x ≅ tspx ³ª#ˏpt等 tt个浓度梯度 o按巢式 °≤• 程序扩增 ∀
将 tss ˏ‹u ’ 中的 ‘ƒ˜‹ p v孢子数量分别调成 t ≅ tsz !t ≅ tsy !t ≅ tsx !t ≅ tsw !t ≅ tsv !t ≅ tsu !ts !t个 o
离心 o提取 ⁄‘„ o按巢式 °≤• 程序扩增 ∀
t ouu1⁄usss ¤µ®¨µ~u1 阴性对照 ‹u ’ ‘¨ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯ ‹u ’ ~
v1‘ƒ˜‹ p t ~w1‘ƒ˜‹ p u ~x1‘ƒ˜‹ p v ~y1‘ƒ˜‹ p w ~z1‘„˜„
p t ~{1‘„˜„ p u ~|1‘„˜… p t ~ts1‘„˜≤ p t ~tt1‘„˜≤ p u ~
tu1‘„˜⁄p t ~ tv1‘„˜⁄ p u ~ tw1‘„˜∞ p t ~ tx1‘„˜∞ p u ~
ty1‘„˜∞ p v ~ tz1‘„˜ƒ p t ~ t{1‘„˜Š ~ t|1‘„˜≥ ~ us1≥±° ~
ut1≥±× q下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨ ¥¨ ²¯º q
图 t 巢式 °≤• 第 t轮扩增结果
ƒ¬ªqt ׫¨ µ¨¶∏¯·²©±¨ ¶·¨§2°≤• ©¬µ¶·µ²∏±§¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±
分别在 us ª湿地松k Πινυσελλιοττιιl种子 !s1v ª土壤以及
s1x ª木屑中按 t ≅ tsy !t ≅ tsx !t ≅ tsw !t ≅ tsv !t ≅ tsu !ts个
等 y个梯度加入 ‘ƒ˜‹ p v孢子液 o提取 ⁄‘„ o按巢式 °≤•
程序扩增 ∀
取 ts ˏ上述扩增产物于 t1u h琼脂糖凝胶中电泳 o∞…
染色后 o于紫外灯下观察 o并于凝胶成像系统上检测并
拍照 ∀
2 结果与分析
u1t 松树脂溃疡病菌及其相关种的巢式 °≤• 扩增 巢式
°≤• 第 t轮扩增结果表明 o供试的 tz种镰刀菌均可扩增出
一条 {zv ¥³大小的条带 o而阴性对照和其他镰刀属以外的
种没有扩增出此条带k图 tl ∀以第 t轮扩增产物为模板 o进
行巢式第 u轮 °≤• 扩增 o结果表明 o只从松树脂溃疡病菌的
w个菌株中扩增出 vyw ¥³大小特异性条带 o而阴性对照和
其他菌株没有扩增出特异条带k图 ul ∀
u1u °≤• 扩增松树脂溃疡病菌的灵敏度 将 ‘ƒ˜‹ p v的
基因组 ⁄‘„以及 tss ˏ‹u ’ 中的孢子稀释成不同浓度梯
度 o进行巢式°≤•扩增 o结果显示巢式°≤•扩增最低可检测
图 u 松树脂溃疡病菌及其相关种的巢式 °≤• 扩增
ƒ¬ªqu ‘¨¶·¨§2°≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²© Φq χιρχινατυµ
到病原菌⁄‘„浓度为 x ≅ tsp v ³ª#ˏptk图 vl o而分生孢子检
测的限量为 ts个#ktss ˏlpt ‹u ’k图 wl ∀
u1v 带菌种子中病菌的检测 利用巢式 °≤• 对带菌种子
进行检测 o结果 us ª种子中加入 t ≅ tsy !t ≅ tsx !t ≅ tsw !t ≅
tsv !t ≅ tsu 个孢子的样品均能检测出特异条带 o而加入 ts
个孢子的种子没有特异条带k图 xl ∀
u1w 带菌土壤中病菌的检测 利用巢式 °≤• 对带菌土壤
进行检测 o结果 s1v ª细土中加入 t ≅ tsy !t ≅ tsx !t ≅ tsw !
t ≅ tsv 个孢子的样品均能检测出特异条带 o而加入 tss个
和 ts个孢子土样中没有特异条带k图 yl ∀
u1x 带菌木屑中病菌的检测 利用巢式 °≤• 对带菌木屑
进行检测 o结果显示 s1x ª木屑中加入 t ≅ tsy !t ≅ tsx !t ≅
tsw !t ≅ tsv !t ≅ tsu 个孢子的样品均能检测出特异条带 o而
加入 ts个孢子的木屑中没有特异条带k图 zl ∀
3 结论与讨论
目前 o松树脂溃疡病只在美国 !墨西哥 !日本 !南非 !西班牙 !智利 !海地等地有发现 o中国尚未有该病害发
生的报道 o国内应切实加强进境苗木 !种子 !木材以及木质包装的检疫 ∀为此 o建立松树脂溃疡病菌经济 !快
速地检测技术势在必行 ∀
vtt 第 t期 廖太林等 }松树脂溃疡病菌的分子检测
t1⁄usss ¤µ®¨µ~u q阴性对照 ‘¨ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯ }‹u ’ ~v p tv q以
‘ƒ˜‹ p v ⁄‘„为模板的浓度 ≤²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²©‘ƒ˜‹ p v ⁄‘„ }x ≅
tsx ox ≅ tsw ox ≅ tsv ox ≅ tsu oxs ox ox ≅ tsp t ox ≅ tsp u ox ≅ tsp v ox ≅
tsp w ox ≅ tsp x ³ª#ˏpt
图 v °≤• 扩增松树脂溃疡病菌的灵敏度k ´l
ƒ¬ªqv ‘¨¶·¨§2°≤• ∏¶¬±ª§¬¯∏·¨§ª⁄‘„ ²© Φq χιρχινατυµ k ´l
t q⁄usss ¤µ®¨µ~u q阴性对照 ‘¨ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯ }‹u ’ ~v q阳性
对照 °²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~ ‘ƒ˜‹ p v ⁄‘„ 模板浓度 ≤²±¦¨±·µ¤·¬²±}x
±ª#ˏpt ~w p tt q孢子数量 °²µ¨ ±∏°¥¨µ}t ≅ tsz ot ≅ tsy ot ≅
tsx ot ≅ tsw ot ≅ tsv ot ≅ tsu ots ot
图 w °≤• 扩增松树脂溃疡病菌的灵敏度k µl
ƒ¬ªqw ‘¨¶·¨§2°≤• ∏¶¬±ª§¬¯∏·¨§¦²±¬§¬¤²© Φq χιρχινατυµ k µl
t q⁄usss ¤µ®¨µ~u q阴性对照 ‘¨ª¤·¬√¨ ¦²±·µ²¯ }‹u ’ ~v q阳性
对照 °²¶¬·¬√¨¦²±·µ²¯ ~ ‘ƒ˜‹ p v ⁄‘„ 模板浓度 ≤²±¦¨±·µ¤·¬²±}x
±ª#ˏpt ~w p | q孢子数量 °²µ¨ ±∏°¥¨µ}t ≅ tsy !t ≅ tsx !t ≅ tsw !
t ≅ tsv !t ≅ tsu !ts ∀下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
图 x 带菌种子中病菌的检测
ƒ¬ªqx „µ·¬©¬¦¬¤¯ ¼¯ ¦²±·¤°¬±¤·¨§¶¨ §¨·¨¶·
基因内间隔区kŒŠ≥l是指位于 u{≥ µ• ‘„ 基因 vχ端与
t{≥ µ• ‘„基因 xχ端之间的序列 ∀通常认为 ŒŠ≥是高变区 o
为真菌属内种间比较和种内变种及其遗传多样性分析的重
要分子标记kŠµ¼·¤ ετ αλqot||z ~Š∏¬§²·ετ αλqot||| ~…∏±¼¤µ§
ετ αλqo t||y ~ ≥∏ª¬·¤ ετ αλqo usstl ∀张金霞等 kusswl以
• „°⁄和 ŒŠ≥ 为分子标记 o研究了中国栽培白灵侧耳
k Πλευροτυσ νεβροδενσισl菌株的遗传多态性 o对供试菌株的 ŒŠ≥
分析表明 oŒŠ≥u区域进化较快 o菌株间具有丰富的多态性 o
利用 ŒŠ≥ p • ƒ°可对白灵侧耳菌株进行鉴定 ∀≥¦«º¨ ¬ª®²©¯ µ¨
等kusswl建立的松树脂溃疡病菌实时 °≤• 检测方法也是以
ŒŠ≥为基础的 ∀
采用巢式 °≤• 可明显提高样品检测的灵敏度 o最低限
量病菌 ⁄‘„ 浓度为 x ≅ tsp v ³ª#ˏpt o分生孢子 ts 个#
ktss ˏlpt o该方法检测 ⁄‘„浓度的灵敏度为 ≥¦«º¨ ¬ª®²©¯ µ¨
等kusswl建立实时 °≤• 的 u sss倍 ∀试验中采用的 ‘ƒ˜‹ p t !‘ƒ˜‹ p u !‘ƒ˜‹ p v以及 ‘ƒ˜‹ p w分别为美国
北卡罗莱那州加勒比松k Πq χαριβαεαl !日本琉球松k Πq λυχηυενσισl !美国佐治亚州辐射松k Πq ραδιαταl !南非
展叶松k Πq πατυλαl上的分离物 ow个松树脂溃疡病菌菌株地理来源广泛 ∀以引物 ≥t !≥u对松树脂溃疡病菌
及其他对照菌株的 ⁄‘„进行 °≤• 扩增 o电泳的结果只有目标菌的 w个菌株可扩增出特异条带 o说明引物
≥t !≥u具有较强的特异性 ∀
图 y 带菌土壤中病菌的检测
ƒ¬ªqy „µ·¬©¬¦¬¤¯ ¼¯ ¦²±·¤°¬±¤·¨§¶²¬¯ ·¨¶·
图 z 带菌木屑中病菌的检测
ƒ¬ªqz „µ·¬©¬¦¬¤¯ ¼¯ ¦²±·¤°¬±¤·¨§¶¤º§∏¶··¨¶·
⁄º¬±¨ ¯¯kussyl对松树种子携带松树脂溃疡病菌的研究表明 o松种主要以表面带菌为主 ∀因此 o本试验采
用人工污染种子模拟种子带菌与实际情况基本相吻合 ∀本试验采用冻融法直接从土壤 !木屑中提取病菌
⁄‘„ o可以大大降低病菌孢子过筛过程损耗 o避免研磨不充分 o最终提高实际检测灵敏度 ∀
wtt 林 业 科 学 wv卷
参 考 文 献
„∏¶∏¥¨¯ ƒ o…µ¨±·• oŽ¬±ª¶·²±¨ • ∞o ετ αλqt||{ q精编分子生物学实验指南 q颜子颖 o王海林 o译 q北京 }科学出版社
张金霞 o黄晨阳 o张瑞颖 o等 qussw q中国栽培白灵侧耳的 • „°⁄和 ŒŠ≥分析 q菌物学报 ouvkwl }xtw p xt|
…µ¬·½ ‹ × „ o≤²∏·¬±«²  o •¬±ª©¬¨ §¯ • ƒ ’ o ετ αλqt||| q Φυσαριυµ συβγλυτινανσ©q¶³q πινι µ¨³µ¨¶¨±·¶¤§¬¶·¬±¦·°¤·¬±ª³²³∏¯¤·¬²±¬±·«¨ Γιββερελλαφυϕικυροι
¶³¨¦¬¨¶¦²°³¯ ¬¨q „³³¯¬¨§¤±§∞±√¬µ²° ±¨·¤¯ ¬¦µ²¥¬²¯²ª¼oyx }tt|{ p tust
…∏±¼¤µ§… „ o≤«¤¬¦«∏¦«²·¨ ≥ o‘¬¦«²¯¶²±  ≥ o ετ αλqt||y q •¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„ ¤±¤¯¼¶¬¶©²µµ¨¶²¯∏·¬²± ²©ª¨ ±²·¼³¬¦¦¯¤¶¶¨¶²© Πλευροτυσq ¼¦²¯ • ¶¨otss }twv p
txs
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⁄º¬±¨ ¯¯ ⁄qussy q≤²±·¤°¬±¤·¬²± ²© Πινυσραδιατα ¶¨ §¨¶¬± ≤¤¯¬©²µ±¬¤¥¼ Φυσαριυµ χιρχινατυµ q«·³}ΠΠ°¥¤²q²µªΠt|||¤¬µ¦Π{w§º¬±¨ ¯q³§©
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k责任编辑 朱乾坤l
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