全 文 ：第 ww卷 第 ts期
u s s {年 ts 月
林 业 科 学
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∂²¯1ww o‘²1ts
’¦·qou s s {
t个油茶 ≠u≥Žu 型脱水素的全长 ¦⁄‘„
克隆及生理功能的预测 3
胡孝义 谭晓风 张党权 曾艳铃 陈鸿鹏 田晓明 刘 巧
k中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 长沙 wtssswl
摘 要 } 以构建的油茶 ∞≥×文库为基础 o采用电子克隆技术 o分离克隆一个脱水素基因的全长 ¦⁄‘„序列 o该基因
的 ¦⁄‘„全长 t wsy ¥³o含一个 yss ¥³的 ≤⁄≥ o编码 uss ¤¤的小分子蛋白 ∀推测该基因编码蛋白的分子质量为 ut ®∏o
等电点 z o暂命名为 ≤²⁄‹‘Œ∀同源性分析发现该基因的编码蛋白具有 u 个 ≠ p 片段k⁄∞≠Š‘°l ot 个 ≥ p 片段
k≥Š≥≥≥≥≥≥l ou个 Žp片段kŽŒŽ∞Ž°Šl o属于典型的 ≠u≥Žu 型脱水素 ∀经 …¯¤¶·比对 o发现富含苏氨酸的 ׫µp区在各
物种间变异显著 o推测该区为油茶所特有 o有利于在被保护的大分子表面形成水合层 ~同时还发现一个十分保守的
基序 }∞⁄⁄Š±ŠŠ• • ŽŽo可能有利于脱水素的磷酸化和亚细胞定位 ∀通过与柑桔和拟南芥的脱水素比较 o提出
≤²⁄‹‘Œ有可能缓冲种子脱水胁迫响应时钙离子的瞬时增高 o并可结合重金属离子 o以减轻活性氧的危害 ∀
关键词 } 油茶 ~脱水素基因 ~¦⁄‘„文库 ~ • „≤∞~生理功能 ~生物信息学
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u 文献标识码 } „ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lts p ssxx p s{
收稿日期 }ussz p tt p tx ∀
基金项目 }国家/十一五0科技支撑项目kussy…„⁄t{…susw oussy…„⁄st„tzsyl o国家自然科学基金项目kvsvztt{wl o湖南省科学技术厅科技
计划项目ksyƒwtttl ∀
3 谭晓风为通讯作者 ∀
Α Φυλλ2Λενγτη χ∆ΝΑ Χλονε οφ Τψπιχαλ ΨuΣΚu ∆εηψδριν ανδ Ιτσ Σπεχυλατεδ
Πηψσιολογιχαλ Ρολειν τηε Σεεδσ οφ Χαµελλια ολειφερα
‹∏÷¬¤²¼¬ פ± ÷¬¤²©¨ ±ª «¤±ª⁄¤±ª´ ∏¤±  ±¨ª ≠¤±¯¬±ª ≤«¨ ± ‹²±ª³¨ ±ª ׬¤± ÷¬¤²°¬±ª ¬∏±¬¤²
k ΚεψΛαβορατορψοφ Νον2Ωοοδ Φορεστ Προδυχτσ οφ Στατε Φορεστρψ Αδµινιστρατριον ΧεντραλΣουτη Υνιϖερσιτψοφ Φορεστρψ ανδ Τεχηνολογψ Χηανγσηα wtssswl
Αβστραχτ} …¤¶¨§²± ¤¦²±¶·µ∏¦·¨§∞≥× ¬¯¥µ¤µ¼ ²© Χαµελλια ολειφεραo¤©∏¯¯ 2¯ ±¨ª·«¦⁄‘„ ±¨¦²§¬±ª¤§¨«¼§µ¬± º¤¶¦¯²±¨ §©µ²°
¬·¶¶¨ §¨¥¼·«¨ ¨¯ ¦¨·µ²±¬¦°≤• ·¨¦«±¬´∏¨ q׫¨ ¦⁄‘„ o·¨±·¤·¬√¨ ¼¯ §¨¶¬ª±¤·¨§¤¶≤²⁄‹‘t oº¤¶t wsy ¥³ ²¯±ª¦²±·¤¬±¬±ª¤±²³¨ ±
µ¨¤§¬±ª©µ¤°¨ ²©yss ¥³q׫¨ §¨§∏¦¨§≤²⁄‹‘t ³µ²·¨¬± «¤§uss ¤°¬±²¤¦¬§µ¨¶¬§∏¨¶oº«¬¦«©²µ°¨ §¤ut ®∏³²¯¼³¨ ³·¬§¨ º¬·«¤
³µ¨§¬¦·¨§¬¶²¨ ¯¨ ¦·µ¬¦³²¬±·k³Œl ²©z1 ׫¨ ≤²⁄‹‘t ³µ²·¨¬± «¤§·º² ≠2¶¨ª°¨ ±·¶o¤± ≥2¶¨ª°¨ ±·¤±§·º² Ž2¶¨ª°¨ ±·¶q ‹²°²¯²ª¼
¤±¤¯¼¶¬¶¬±§¬¦¤·¨§·«¤··«¨ ≠2¶¨ª°¨ ±·o ≥2¶¨ª°¨ ±·¤±§ Ž2¶¨ª°¨ ±·²© ≤²⁄‹‘t ¶«¤µ¨§¬§¨±·¬·¼ º¬·«·«²¶¨ ²© ²·«¨µµ¨³²µ·¨§
§¨«¼§µ¬±¶o¬±§¬¦¤·¬±ª·«¤·≤²⁄‹‘¥¨ ²¯±ª¨§·² §¨«¼§µ¬±¶∏³¨µ©¤°¬¯¼q׫¨µ¨ º¤¶¤º¬§¨ µ¤±ª¨ ²©√¤µ¬¤·¬²±©²µ×«µ2µ¨ª¬²± ¬¨¬¶·¨§
¤°²±ª §¨«¼§µ¬±¶ ©µ²° √¤µ¬²∏¶ ¶³¨¦¬¨¶o ¤±§ ·«¨ ≤²⁄‹‘t ׫µ2µ¨ª¬²± º¤¶ Χαµελλια ολειφερα ¶³¨¦¬©¬¦o ³µ²·¨¦·¬±ª ¶²°¨
°¤¦µ²°²¯ ¦¨∏¯ ¶¨¥¼©²µ°¬±ª«¼§µ¤·¨§ ¤¯¼¨ µ²∏·¶¬§¨ ²©·«¨ °q„ √¨ µ¼ ¦²±¶¨µ√¨ §°²·¬©²©∞⁄⁄Š±ŠŠ• • ŽŽº¤¶©²∏±§¬± ≤²⁄‹‘t o
¤±§¬·°¬ª«·¦²±·µ¬¥∏·¨·² §¨«¼§µ¬±. ¶³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²±¤±§¶∏¥¦¨¯¯∏¯¤µ¯²¦¤¯¬½¤·¬²±q…¼¦²°³¤µ¬¶²± º¬·«§¨«¼§µ¬±¶©µ²° ¦¬·µ∏¶¤±§
Αραβιδοπσι󵨶³¨¦·¬√¨ ¼¯ o¬·º¤¶³µ²³²¶¨§·«¤·≤²⁄‹‘t °¬ª«·¶¨µ√¨ ¤¶¤¥∏©©¨µ©²µ·µ¤±¶¬¨±·¯¼¬±¦µ¨¤¶¨§≤¤un º«¨ ±·«¨ °¤·∏µ¨§
¶¨ §¨¶º¤¶∏±§¨µ·«¨ ¦²±§¬·¬²±²©§¨¶¬¦¦¤·¬²±¶·µ¨¶¶·²¶²°¨ ¬¨·¨±·o¤±§·«¤·≤²⁄‹‘t °¬ª«·¥¬±§«¨¤√¼ °¨ ·¤¯ ¬²±¶¶∏¦«¤¶≤∏un o
‘¬un o±un o≤²un oƒ v¨ n ¤±§«¨ ±¦¨ ¶¦¤√¨ ±ª¨ µ¨¤¦·¬√¨ ²¬¼ª¨ ±¶³¨¦¬¨¶·²¤¯¯¨ √¬¤·¨·²¬¬±¦¤∏¶¨§¥¼·«¨ °q
Κεψ ωορδσ} Χαµελλια ολειφερα~§¨«¼§µ¬±~¦⁄‘„ ¬¯¥µ¤µ¼~• „≤∞~³«¼¶¬²¯²ª¬¦¤¯ µ²¯¨~¥¬²¬±©²µ°¤·¬¦¶
晚期胚胎发育丰富蛋白k¯ ¤·¨ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶¤¥∏±§¤±·o∞„l是在植物种子发育过程中形成的一类低分子质
量蛋白 o受发育阶段 !„…„和脱水信号等调节k…µ¤¼ot||z ~≥«¬±²½¤®¬ετ αλqot||yl ∀∞„蛋白含有大量的极性
氨基酸和无规则结构 o具有很高的亲水性和热稳定性 k≤¯ ²¶¨ ετ αλqot||vl ∀根据氨基酸序列的同源性和基
序 o把 ∞„蛋白分为 y组k张木清等 oussxl o其中第 u组的脱水素不仅存在于高等植物 o也存在于藻类 !酵母
和盐细菌中k≥√¨ ±¶¶²± ετ αλqoussul o分子质量为 | ∗ uss ®∏k≥¤µ«¤± ετ αλqot||zl o在 ≤端或其附近具有一个或
多个富含赖氨酸的基序 o约 tx个氨基酸残基k∞ŽŽŠŒ⁄ŽŒŽ∞Ž°Šl组成 o其中 ŽŒŽ∞Ž°Š在不同物种间极为
保守 o称为 Žp片段 ~通常 ‘端有一保守基序k≠ p片段l oŽp片段与 ≠ p片段之间还有一可被磷酸化的约 y
个丝氨酸串联的 ≥ p片段 o称/ ≠≥Ž速记0k≤¯ ²¶¨ ot||yl ∀所有的脱水素不一定含有 ≠ p和 ≥ p片段 o但都含有
Žp片段 o它是第 u组 ∞„区别于其他组的特征k„¯ ¤¯ª∏¯²√¤ ετ αλqoussvl ∀ Žp片段可形成两性的 Αp螺旋结
构 o可分别与一些生物膜的脂质体表面暴露的疏水区结合及部分变性蛋白质结合kŒ¶°¤¬¯ ετ αλqot|||l ∀脱
水素的作用主要为 }tl作为渗透调节物 o在干旱 !冷 !盐分等胁迫时与糖醇类等协同增加蛋白质 !生物膜表面
的水化程度 o可部分代替水分子 o并降低溶质势 o保持胞质的溶解状态 o稳定细胞结构 !尤其是膜结构 ~ul作
为分子伴侣 o在脱水胁迫时防止高浓度盐引起蛋白复合体解离成亚基 o稳定和保护蛋白质的结构和功能 ~vl
因富含组氨酸 o可结合铜 !锌 !镍等重金属离子 o从而清除活性氧组分 o保护膜结构免受活性氧的伤害k‹¤µ¤ ετ
αλqoussxl ∀近成熟期油茶种子的水分含量快速下降 o为确保其生理活动的正常进行 o应有大量的脱水素来
维持其适宜的胞内微环境 ∀作者构建的油茶近成熟种子 ¦⁄‘„文库中含有 uv条脱水素 ∞≥× o为高丰度表达
k谭晓风等 oussyl ∀不同物种脱水素成员的 ≠ p片段是一个变数 o油茶脱水素成员 ∞≥×的 ‘端有 t ∗ u个≠ p
片段 o因目前没有油茶脱水素序列的报道 o不能确定其完整的 ≤⁄≥k¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨±¦¨l中 ≠ p片段的具体数目 ∀
本文对其中的一个单克隆进行 xχ2• „≤∞o以期获得 ∞≥×序列中 xχ端可能缺少的 ⁄‘„序列信息 o方便 • ‘„干
扰的功能分析等试验 o并根据推导的氨基酸序列对该脱水素的部分性质与功能进行了预测 ∀
t 材料与方法
111 材料
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室构建的油茶近成熟种子 ¦⁄‘„文库 o所有
单克隆保存于 p zs ε 冰箱中 o油茶优良无性系湘林 t号和湘林 w号的近成熟种子采自湖南省林业科学研究
院油茶采穗圃 ∀
112 方法
t1u1t 质粒 ⁄‘„提取 ≥⁄≥碱裂解法的小量制备k萨姆布鲁克等 oussul ∀
t1u1u 文库中 tzwv号克隆的 ∞≥× 序列长度的 °≤• 检测 °≤• 反应体系kus ˏl }פ´ kx ˜#ˏptls1u ˏo
ts ≅ °≤• ¥∏©©¨µu1s ˏoª≤¯ ukux °°²¯#ptlt1u ˏo§‘×°¶kts °°²¯#ptls1w ˏo×v !×z引物各 s1{ ˏo质粒模
板 s1u ˏo§§‹u ’tw1w ˏ∀°≤• 扩增条件 }|w ε 预变性 x °¬±~|w ε 变性 vs ¶ox{ ε 退火 vs¶ozu ε 延伸 |s¶o
vx个循环 ~zu ε 继续延伸 x °¬±~w ε 保存 ∀取 u ˏ扩增产物于 t1s h琼脂糖凝胶上电泳检测 ∀
t1u1v 测序 由上海英俊生物技术有限公司进行 ×v和 ×z双向测序 o应用 ∂ ¦¨·²µ‘׌软件进行校正和拼接以
得到该克隆的 ∞≥×全序列 ∀利用在线的 Š¨ ±…¤±®资源 o采用 …¯¤¶·方法对该序列进行比对分析 ∀
t1u1w 总 • ‘„提取 采用 Œ±√¬·µ²ª¨±公司的 • ‘„提取试剂盒 }°∏µ¨¬±®× ¬¦µ²2·²2¬§¬×²·¤¯ • ‘„ °∏µ¬©¬¦¤·¬²±
≥¼¶·¨° k≤¤·¤¯²ª‘²qtut{v2st{l o按照说明指南进行 ∀
t1u1x • ×2°≤• 与 xχ2• „≤∞ 用 ≤¯ ²±·¨¦«公司的 ≥„• ×א • „≤∞ ¦⁄‘„ 扩增试剂盒k≤¤·q‘²qyvw|twl o按其说
明合成 ¦⁄‘„第一链 ∀基因特异的 xχ2• „≤∞引物设计如下 }
反向引物 Š≥° xχ2ׄ≤≤„Š×„׊Š×Š„„≤≤ŠŠŠ×××≤≤Š2vχ kuy ¥³ots Λ°²¯#ptl ~
反向巢式引物 ‘Š≥° xχ2Š„„≤׊ŠŠ×≤„≤≤„„„××≤Š×≤ŠŠ××2vχkuy ¥³ots Λ°²¯#ptl ∀
xχ2• „≤∞ °≤• 反应体系kxs ˏl及降落 °≤• k退火温度的降落为 zu ε !zs ε !y{ ε l扩增程序参照试剂盒
的说明进行配制和设置 ∀电泳检测结果为多条非目的条带 o保存 • „≤∞的反应产物 o作为巢式 °≤• 的模板 ∀
对巢式 °≤• 优化的扩增程序为 }|w ε 预变性 x °¬±~|w ε 变性 vs ¶ozu ε 退火 !延伸 xs ¶~zu ε 继续延伸 u
°¬±oxs个循环 ~改用 פŽ¤•¤公司的 „ פ´ ∀巢式 °≤• 反应体系kxs ˏl }„ פ´ kx ˜#ˏptls1y ˏots ≅ „
°≤• ¥∏©©¨µµx1s ˏoª≤¯ ukux °°²¯#ptlx ˏo§‘×°¶kts °°²¯#ptlt ˏo‘˜° !‘Š≥°引物各 t ˏo• „≤∞产物模
板 t ˏo§§‹u ’vw1| ˏ∀
t1u1y 目的条带的回收 !×载体连接 !转化 ⁄‹xΑ!°≤• 检测及测序 使用安比奥公司k长沙l的 ⁄‘„回收试
剂盒和 פŽ¤•¤公司的 ³⁄t{2×载体连接试剂盒 o按照各自的说明进行 ⁄‘„目的片段的回收及与含有氨苄
青霉素抗性基因的 ³⁄t{2×载体的连接 o转化 ⁄‹xΑ大肠杆菌进行蓝白斑筛选 o挑取白色的单菌落培养 o抽提
质粒进行 °≤• 检测 o反应体系kus ˏl为 }µ×¤´ kx ˜#ˏptls1t ˏots ≅ °≤• ¥∏©©¨µu1s ˏoª≤¯ ukux °°²¯#ptl
yx 林 业 科 学 ww卷
t1u ˏo§‘×°¶kts °°²¯#ptls1v ˏo‘˜° !‘Š≥°引物各 s1x ˏo重组质粒模板 s1{ ˏo§§‹u ’ tx1t ˏ∀循环
参数与上述巢式 °≤• 的相同 ∀挑选阳性克隆测序 ∀
图 t tzwv号克隆 ∞≥×
序列长度的 °≤• 检测
ƒ¬ªqt ≤²±©²µ°¤·¬²±©²µ·«¨
∞≥× ¯¨ ±ª·«²©·«¨ tzwv ¦¯²±¨
¬±·«¨ ¦⁄‘„ ¬¯¥µ¤µ¼ ¥¼ °≤•
t1u1z 生物信息学分析与理化性质的预测 利用 ‘≤…Œ的 …¯¤¶·在线软件和 ∂ ¦¨·²µ
‘׌软件进行比对和保守基序的识别 o蛋白质理化性质的预测软件为 „‘׋∞°• ’×
∂w1v ∀
u 结果与分析
211 目的 ΕΣΤ序列长度的 ΠΧΡ 检测及双向测序结果
油茶 ¦⁄‘„文库中 otzwv号克隆的 ∞≥×序列经 …„≥×软件 √¨ ¦¶¦µ¨ ±¨去除载体污
染后 o确认其大小仅为 xvz ¥³o而电泳检测为 t sss ∗ t xss ¥³k图 tl o除去载体序列后
仍大于 xvz ¥³o因此已知的这段 ∞≥×序列未反映该克隆的全部信息 ∀双向测序得到
该克隆的全部序列信息表明 o该序列长 t svw ¥³o含 zu个多聚腺苷酸 ∀ ’• ƒ分析显
示 o它有一个最长的 ’• ƒ o长度为 yss ¥³o编码 uss个氨基酸 o含有 u个 ≠ p片段 !t个
≥ p片段及 u个 Žp片段k分析见下l ∀但是 o有 u类脱水素在 ‘端可能含有多个 ≠ p
片段k≤¯ ²¶¨ ot||yl o而该油茶脱水素到底有多少个尚不清楚 ~即使该最长 ’• ƒ就是
完整的 ≤⁄≥ o但通过 xχ2• „≤∞o也可得到其缺失 xχ2˜×• 部分 o获得更多的序列信息 ∀
212 5χ2ΡΑΧΕ产物及转化子的 ΠΧΡ 检测
xχ2• „≤∞的结果有 w条带k电泳图未示出l o尚不能判定目的条带 ∀以 • „≤∞产物
为模板进行的巢式 °≤• 电泳结果显示有一条带十分明亮 o约 uss ¥³k图 ul ∀挑取 ts
个白色的单菌落进行 °≤• 鉴定 o结果除第 w和 ts个克隆的产物外 o其余 {个产物大小一致k图 vl o选择其中
t个克隆测序 ∀
图 u xχ2• „≤∞产物的巢式 °≤•
ƒ¬ªqu ׫¨ ±¨ ¶·¨§°≤• ²©
xχ2• „≤∞ ³µ²§∏¦·¶
图 v 阳性克隆的 °≤• 检测
ƒ¬ªqv ׫¨ √ µ¨¬©¼¬±ª²©³²¶¬·¬√¨¦¯²±¨ ¥¼ °≤•
213 ∆ΝΑ及其推导的氨基酸序列分析
原 tzwv号的 ∞≥×序列经测序拼接后 xχ2˜×• 新增 tv ¥³o并未改变 ’• ƒ的个数 o表明 tzwv号克隆的 ∞≥×
中就含有 ≤⁄≥序列 o至此 o就获得了 t个油茶脱水素基因的较完整¦⁄‘„序列k图 wl o该序列长 t swy ¥³o其中
≤⁄≥长 yss ¥³o编码 uss个氨基酸 o推导的氨基酸序列见图 x ∀xχ2˜×• 的 „与 ×的含量很高 o达 yy1yy h o油茶
∞≥×文库中脱水素家族的其他成员普遍如此k数据未示出l o这可能有利于转录时的解链和对胁迫信号的快
速应答 ∀
≤¯ ²¶¨kt||yl采用 ≠≥Ž的速记形式将脱水素分为 x种类型 } ≠±≥Žu !Ž± !≥Ž± !Ž±≥及 ≠uŽ±∀该油茶脱水素
氨基酸序列有如下特征 } ‘端有 u 个 ≠ p 片段 o在 xx ¤¤处有 t 个富含苏氨酸k׫µl的区域k׫µp 区l o
×׊×≠Š×Š在该区位内有 t次重复 ~在 tty ¤¤处有 y个串联的丝氨酸残基k≥ p片段l o在 tvs ¤¤处有 t个富
zx 第 ts期 胡孝义等 }t个油茶 ≠u≥Žu 型脱水素的全长 ¦⁄‘„克隆及生理功能的预测
图 w 油茶脱水素基因的全长 ¦⁄‘„序列
ƒ¬ªqw ƒ∏¯¯ 2¯ ±¨ª·«¦⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© Χqολειφερα ⁄‹‘t
方框 }起始密码子与终止密码子 ~下划线 }xχ2˜×• 与 vχ2˜×• ~双下划线 }终止信号 ~粗线 }通过 xχ2• „≤∞新增的 xχ2˜×• 序列 ∀
°¤±¨ }Œ±¬·¬¤·¬²± ¦²§²± ¤±§≥·²³¦²±§²±~˜±§¨µ¯¬±¨ }xχ2˜×• ¤±§vχ2˜×• ~
≤µ¨º¨¯ }≥·²³¶¬ª±¤¯ ~ ‹ ¤¨√¼ ¬¯±¨ } ‘¨ º¯ ¼ ¤§§¨§¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©xχ2˜×• ¥¼ • „≤∞q
图 x 油茶脱水素氨基酸的序列及其特征
ƒ¬ªqx „°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤±§¬·¶¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¶²© Χqολειφερα ⁄‹‘t
下划线 } ≠ p片段 ~双下划线 }≥ p片段 ~虚线 }Žp片段 ~方框 }富组氨酸区 ~
粗线 }׫µp区k富苏氨酸区l ~涂灰 n斜体 }׫µp区内重复 ∀
˜±§¨µ¯¬±¨ } ≠2¶¨ª°¨ ±·~≤µ¨º¨¯ }≥2¶¨ª°¨ ±·~⁄¤¶«¨ §∏±§¨µ¯¬±¨ }Ž2¶¨ª°¨ ±·~°¤±¨ } ‹¬¶·¬§¬±¨ 2µ¬¦«µ¨ª¬²±~
‹ ¤¨√¼ ¬¯±¨ }׫µ2µ¨ª¬²±k׫µ¨²±¬±¨ 2µ¬¦«µ¨ª¬²±l ~Šµ¨¼ n Œ·¤¯¬¦}׫¨ µ¨³¨ ¤·¬± ׫µ2µ¨ª¬²±q
含赖氨酸的区段kŽp片段l o其中的 ŽŒŽ∞Ž°Š在 ≤端重复 t次 ∀ ≤⁄≥内编码 ≠ p片段的 ttx ∗ tvu ¥³与 tzx
∗ t|u ¥³中有 v处碱基不同 o编码 Žp片段的 w{t ∗ xsw ¥³与 yu{ ∗ yxt ¥³中也有 v处碱基不同 ~编码 ׫µp
区的 uyz ∗ u|s ¥³序列紧挨着自身重复 o有一处碱基变化 o这段序列在油茶的另一些低丰度表达的同源物中
缺失 o可能反映了脱水素家族成员的某些进化关系 ∀作者所在实验室油茶 ¦⁄‘„文库中还有大量的脱水素
∞≥× o该脱水素首先得到全长克隆 o故暂命名为 ≤²⁄‹‘t ∀根据各特征片段的分布及数量 o按 ≤¯ ²¶¨kt||yl的分
类方法 o≤²⁄‹‘t的速记形式为 ≠u≥Žu 型 o属于典型的脱水素类型 ∀有学者提出脱水素所含有的串联丝氨酸
残基可被磷酸化 o这可能有利于脱水素在核定位方面起作用k¨±¶¨± ετ αλqot||{ ~ Š²§¤¼ ετ αλqot||w ~
≤¤°³¥¨¯¯ ετ αλqot||zl o对金属离子的结合也依赖于磷酸化k∏¤·« ετ αλqoussvl ∀ Žp片段形成两亲性的 Αp
螺旋kŒ¶°¤¬¯ ετ αλqot|||l o因而使脱水素同时具有亲水性和疏水性k≤ ¦¨¦¤µ§¬ετ αλqot||wl ∀关于 ≠ p片段与
׫µp区的功能目前尚不清楚 ∀
214 Χο∆ΗΝ1同源性及保守基序的分析
…¯¤¶·¬相似性比较时共搜索到 ts|条序列 o其中 ∞p值在 s1st以下的有 xx条 o涉及到 t{个物种 ∀为便
于同源性比较 o对于相同物种的多条序列 o只取 ≥¦²µ¨值最高的一条 ∀结果表明 o≥¦²µ¨值最高的 u个物种是
山茱萸k Χορνυσσεριχεαl和欧洲山毛榉k Φαγυσσψλϖατιχαl o都为木本 o此外 o木本植物还有桃k Πρυνυσ περσιχαl !沙棘
k Ηιπποπηαε ρηαµνοιδεσ¶∏¥¶³qσινενσισl和绒毛白桦k Βετυλα πυβεσχενσl o这也许反映了一个趋势 }油茶 ≤²⁄‹‘t与
其他木本植物脱水素的同源性要高于草本 ∀对 t{条序列中的前 tu条进行多重比对k图 yl o发现 ≤²⁄‹‘t与
{x 林 业 科 学 ww卷
图 y ≤²⁄‹‘t的特征序列和保守基序的分析
ƒ¬ªqy „±¤¯¼¶¬¶©²µ¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¤¯ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶¤±§¦²±¶¨µ√ §¨ °²·¬©
²© ≤²⁄‹‘t ¥¼ ¤¯¬ª±° ±¨·º¬·«§¨«¼§µ¬±¶©µ²° ²·«¨µ¶³¨¦¬¨¶
´ } ≠ p片段k⁄∞≠Š‘°l ≠2¶¨ª°¨ ±·~ µ }≥ p片段k≥Š≥≥≥≥≥≥l ≥2¶¨ª°¨ ±·~ · }Žp片段kŽŒŽ∞Ž°Šl Ž2¶¨ª° ±¨·~ ¶ }激酶位点及核定位
基序k∞⁄⁄Š±ŠŠ• • ŽŽl Ž¬±¤¶¨ ¶¬·¨ ¤±§±∏¦¯ ¤¨µ¯ ²¦¤¯¬½¤·¬²± °²·¬©q略去了大部分不保守的区域 o括号内的数字为其后的残基的序号 ∀
²¶·²©∏±¦²±¶¨µ√¨ §µ¨ª¬²±¶¤µ¨ ²°¬·¨§o ¤¨¦« ±∏°¥¨µ¬± ¥µ¤¦®¨·µ¨³µ¨¶¨±·¶·«¨ µ¨¶¬§∏¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ±∏°¥¨µ²©·«¨ ³²¯¼³¨ ³·¬§¨ qs ∗ tu分别表示
≤²⁄‹‘t及另 tu个物种的脱水素 o其基因登录号及物种名为 s ∗ tu ¬±§¬¦¤·¨ ≤²⁄‹‘¤±§²·«¨µtu §¨«¼§µ¬±¶µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ o·«¨¬µ¤¦¦¨¶¶¬²±
±∏°¥¨µ¶¤±§¦²µµ¨¶³²±§¬±ª¶³¨¦¬¨¶±¤° ¶¨}t1 „„{vwuz o山茱萸 Χορνυσσεριχεα ~u1 …„⁄{yyww o胡萝卜 ∆αυχυσχαροτα ~v1 ≤„⁄{zzvv o绒毛白
桦 Βετυλα πυβεσχενσ~w1 ≤„∞xwx|s o欧洲山毛榉 Φαγυσσψλϖατιχα ~x1 ∞„≠zxxtx o水稻 Ορψζα σατιϖα~y1 „„±zwzy{ o油菜 Βρασσιχα ναπυσ~z1
≤„≤ssyvz o桃 Πρυνυσ περσιχα ~{1 „„°|wyuz o沙棘 Ηιπποπηαε ρηαµνοιδεσ¶∏¥¶³q σινενσισ~|1 …„⁄tvw|{ o普通烟草 Νιχοτιανα ταβαχυµ ~ts1
≤„≤usuv{ o普通太阳花 Ηελιαντηυσ αννυυσ~tt1 ≤„≤{sztz o肿柄菊 Τιτηονια ροτυνδιφολια ~tu1 „…≤xxyzt o咖啡 Χοφφεα χανεπηορα q
各比对序列的特征模块 ≠ 区 !≥区与 Ž区等区域都相对保守 o这显示了脱水素的基本特征 ∀保守模块 ¶
k∞⁄⁄Š±ŠŠ• • ŽŽl紧位于 ≥ p片段后 o它可能有着重要的生物学意义 ∀有学者认为 ∞⁄⁄是酪蛋白激酶 u的
底物序列k≥√¨ ±¶¶²±ousstl o油茶 ¦⁄‘„文库中也存在酪蛋白激酶 u亚基的 ∞≥×k谭晓风等 oussyl ~∞⁄⁄后的
• • ŽŽ是在哺乳动物核仁磷蛋白 ‘²³³tws及酵母 ‘≥• t中发现的核定位信号结合结构域k≤¤°³¥¨¯¯ ετ αλqo
t||zl ∀同样具有 • • ŽŽ基序的拟南芥kΑραβιδοπσιστηαλιαναl脱水素 • „…tz结合到含有 ≥∂ws抗体的核定位信
号的多肽上要依赖于 • „…tz的磷酸化k≤¤°³¥¨¯¯ ετ αλqot||zl ~还发现在转基因的拟南芥中 o• „…tz与 Š˜≥
报告基因的融合体引导 Š˜≥到核与细胞质的某些亚细胞器中 ∀酪蛋白激酶 u的识别序列中的一些突变结
构进一步表明 o≥ p片断的磷酸化是核定位的关键k¨±¶¨± ετ αλqot||{l ∀综上 o推测 ≤²⁄‹‘t这类脱水素中的
基序 ∞⁄⁄Š±ŠŠ• • ŽŽ同 ≥ p片段一齐可被磷酸化 o从而引导这类脱水素至核或某些亚细胞结构中以发挥其
生理功能 ∀
|x 第 ts期 胡孝义等 }t个油茶 ≠u≥Žu 型脱水素的全长 ¦⁄‘„克隆及生理功能的预测
215 Χο∆ΗΝ1理化性质 !二级结构和生理功能的预测
拟南芥脱水素分为酸性脱水素和中性Π碱性脱水素 o前者富含谷氨酸 o后者富含甘氨酸 o通常植物脱水素
不含或仅含少量的色氨酸与半胱氨酸k≤¯ ²¶¨ ετ αλqot|{| ~ ⁄¨ ±ª ετ αλqoussyl ∀预测 ≤²⁄‹‘t的分子量为 ut
®∏o等电点 z1s o为中性脱水素 o也富含甘氨酸kus1x h l o不含色氨酸与半胱氨酸 o极性氨基酸含量高k{v h l o
在非极性的氨基酸中 o仅脯氨酸较高kx h l ∀图 z显示该油茶脱水素和其他种类的脱水素一样 o是高度亲水
的 o而高含量的极性氨基酸是脱水素的主要特性 o也是其高度亲水的化学基础k≤¯ ²¶¨ ετ αλqot||vl ∀二级结
构预测采用 °⁄ 算法 o含螺旋 tt h !片层 w h !转角 vw h !卷曲 xt h ∀采用其他的算法 o卷曲更大 o螺旋结构
更少 o说明 ≤²⁄‹‘t同其他物种的脱水素结构一样为不规则k≥²∏¯¤ª¨¶ ετ αλqoussvl ∀对最长的螺旋kt{u ∗
t|v ¤¤l分析其螺旋轮结构k图 {l o发现在 • •  ∞ŽŒŽ∞Ž°tu个氨基酸中有 w个疏水性残基位于螺旋轮的同
一侧k在 Αp螺旋的位置为 v p w p z p tt o符合¬!¬n v !¬n w原则l o其余亲水残基在螺旋轮上位于疏水性残基
的另一侧 o符合两亲性Αp螺旋的特征k≥¨ ªµ¨¶·ετ αλqot||sl ∀脱水素通过其疏水作用与生物膜的脂质成分作
图 z ≤²⁄‹‘t多肽的亲水性和可溶性分析
ƒ¬ªqz ‹¼§µ²³«¬¯¬¦¬·¼ ¤±§¶²¯√ ±¨·¤¦¦¨¶¶¬¥¬¯¬·¼
©²µ·«¨ ³²¯¼³¨ ³·¬§¨ ²© ≤²⁄‹‘t
用 k≤¯ ²¶¨ ot||y ~t||zl o这有助于脱水
时稳定细胞结构 ∀磷脂 !去垢剂 !脱水
等促进 Žp片段形成两亲性 Αp螺旋
k „¯ ¤¯ª∏¯²√¤ ετ αλqoussv ~ ≥²∏¯¤ª¨¶ ετ
αλqoussvl ∀从图 z可看出 ≤²⁄‹‘t的
易溶性与亲水性的曲线基本一致 o对
亲水性贡献最大的氨基酸残基分别位
于 tu ∗ v| ¤¤!ttw ∗ txv ¤¤!tzu ∗ t|w
¤¤o这些区域含有较多的赖氨酸或精
氨酸或天冬氨酸 o极性强 o暗示脱水素
可强烈结合水分子 o在脱水状态下抑
图 { ≤²⁄‹‘t的 Ž区保守序列的
Αp螺旋两亲性分析
ƒ¬ªq{ „°³«¬³«¤·¬¦Α2«¨ ¬¯¬¤±¤¯¼¶¬¶
©²µ·«¨ ¦²±¶¨µ√ §¨Ž2µ¨ª¬²± ²© ≤²⁄‹‘t
制水分的丧失 o提高细胞的耐脱水性 ~富含苏氨酸和甘氨酸的 v| ∗ ttw ¤¤区
域对亲水性贡献小 o在氨基酸序列中对应于 ׫µp区 o该片段的苏氨酸含量
极高 o且多数为 u个串联 o在油茶¦⁄‘„文库中 ≤²⁄‹‘t代表一类高丰度表达
的脱水素 o且 ×׊×≠Š×在 ׫µp片段中发生 t次重复 o׫µp区不同物种的脱
水素间变异大 o推测该 ׫µp区为油茶特有 o在油脂合成高峰期的水分亏缺
状态下 o其作用与多元醇等渗调物相似 o在其结合的生物膜或蛋白质的疏水
层周围形成水合层而保护生物大分子脆弱的疏水层 ∀
脱水素的 ≥ p片段的磷酸化已被多数研究者所认同 o某些脱水素依赖于
≥ p片段的磷酸化而增强对钙离子的吸收k∏¤·« ετ αλqoussvl ∀通常认为 o
脱水素的钙离子的结合域富含甘氨酸或脯氨酸以及酸性或水合残基k∏¤·«
ετ αλqoussvl o故同样富含甘氨酸的 ≤²⁄‹‘t也可能与钙离子结合 o同其他结
合钙离子的蛋白 o如钙网蛋白k¦¤¯µ¨·¬¦∏¯¬±l !集钙蛋白k¦¤¯¶¨ ∏´¨¶·µ¬±l !钙联结
蛋白k¦¤¯±¨ ¬¬±l等协同作用 o充当其缓冲液以缓解因响应胁迫条件而引起钙
离子过高带来的毒害k∏¤·« ετ αλqoussvl ∀
油茶 ¦⁄‘„文库中有超氧化物歧化酶k≥’⁄l !过氧化物酶k°’⁄l !过氧化
氢酶k≤„×l !谷胱甘肽硫转移酶kŠ≥×l的 ∞≥×分别为 v条 !tt条 !u条 !t条k谭晓风等 oussyl o间接反映了活性
氧种类k• ’≥l的积累是较多的 o并发现一条 ‘„⁄°‹氧化酶 o这是活性氧分子的来源之一 ∀ • ’≥会给油茶种
子细胞带来伤害 o那么成熟的油茶种子中肯定存在某些机制来清除 • ’≥ ∀某些金属离子参与了 • ’≥的形
成 o但高丰度表达的脱水素可结合这些金属离子 o从而清除或减轻 • ’≥产生的危害 ∀在蛋白质中通常参与
重金属离子结合的氨基酸主要是半胱氨酸和组氨酸 ∀由于脱水素缺少半胱氨酸 o则脱水素对金属离子的结
合能力取决于组氨酸残基的数量和可接触面 o而 ≤²⁄‹‘t中的组氨酸含量达 x1x h ∀有强烈的证据显示组氨
酸高水平地结合 ≤∏un !‘¬un !±un !≤²un !ƒ v¨ n等金属离子k‹¤µ¤ ετ αλqoussxl o且串联的组氨酸结合金属的能
力强于单个的组氨酸残基kŠ∏¶°¤± ετ αλqousstl o而 u个组氨酸如在一个卷曲的螺旋面上紧靠在一起 o这样
sy 林 业 科 学 ww卷
的螺旋基序 ‹¬¶2÷v2‹¬¶表现出更强的金属结合特性k≥∏½∏®¬ετ αλqot||{l ∀ ≤²⁄‹‘t含有 tt个组氨酸 o有 w个
形成 u个组氨酸 p组氨酸对 o其中 t个为 ‹‹±±‹k图 xl o属于 ‹¬¶2÷v2‹¬¶结构 o推测可强烈结合金属离子 ∀
此外 o在柑橘脱水素 ≤∏≤’• tx清除活性氧的过程中 o甘氨酸 !赖氨酸与组氨酸残基同时被显著降解 o暗示甘
氨酸 !赖氨酸也可能参与活性氧的清除k‹¤µ¤ ετ αλqousswl ∀由此推测 o富含甘氨酸 !赖氨酸与组氨酸的
≤²⁄‹‘t还可能与结合重金属离子有关 o是油茶种子成熟期清除 • ’≥的机制之一 ∀
v 结论与讨论
采用 xχ2• „≤∞技术首次从油茶 ¦⁄‘„文库中克隆了 t条脱水素基因的全长 ¦⁄‘„ o该基因长度为 t swy
¥³o其中 xχ2˜×• 与 vχ2˜×• 分别长 y| ¥³!vsx ¥³o起始密码子 „׊ o终止密码子 ׄ„ o≤⁄≥长 yss ¥³o编码 uss
个氨基酸 o其内有多个序列的重复 o重复中有少量碱基变化 o但除了 ׫µ2区的部分区域外 o都未改变氨基酸的
编码序列 o这些重复可能具有重要的生物学意义 ∀ ≤²⁄‹‘t含有 u个 ⁄∞≠Š‘°k≠ p片段l !t个 ≥Š≥≥≥≥≥≥k≥ p
片段l及 u个 ŽŒŽ∞Ž°ŠkŽp片段l o为典型的 ≠u≥Žu 型脱水素k≤¯ ²¶¨ ot||yl o具有高度的亲水性 o在水溶液中
主要采取高度无规则的延伸构型k≥²∏¯¤ª¨¶ ετ αλqoussvl ∀最靠近 ≤端的 Žp片段具有两亲性 Αp螺旋 o使脱
水素同时与极性和非极性的大分子结合 o这种结构是其发挥生理功能基础 ∀ ≤²⁄‹‘t结合金属离子和亚细
胞定位依赖于 ≥ p片段的磷酸化 o其高度保守的序列 ∞⁄⁄Š±ŠŠ• • ŽŽ有助于脱水素的磷酸化和亚细胞定位 ∀
≠ p片段的功能尚不清楚 ∀ ≤²⁄‹‘t的 ≤端 u个 Žp片段是两亲性 Αp螺旋 o富含极性氨基酸 o在细胞脱水时
可强烈结合水分子 o而富含 ) ’‹但亲水性并不强的 ׋µp区可能是在水分亏缺时代替水分子而充当相容性
溶剂 o也有利于在生物膜或蛋白质的疏水表面形成水合层 o从而保护蛋白质的结构与功能 o因此 ≤²⁄‹‘t是
良好的渗透调节物 ~通过与柑桔k Χιτρυσ υνσηιυl及拟南芥k Αραβιδοπσιστηαλιαναl的脱水素进行比较 o预测其在
油脂合成高峰期时的脱水状态下可结合重金属离子 o如果螯合 ≤¤un o可缓冲因脱水胁迫造成的 ≤¤un的瞬时
增高 o维持钙稳态 ~如果结合 ≤∏un !±un 等 o则可清除氧自由基 o从而稳定 !保护细胞膜的结构和胞内环境
k‹¤µ¤ ετ αλqoussw ~ussxl ∀
油茶种子在油脂合成的高峰期 o细胞处于一定程度的渗透胁迫状态 ∀已在油茶 ¦⁄‘„文库中发现了与
渗透胁迫响应的信号转导途径相关的大 Š蛋白 !小 Š蛋白 !磷脂酰肌醇代谢途径的相关酶 !钙调素 !≤⁄°Ž及
其他蛋白激酶与磷酸酶 !tw2v2v蛋白k谭晓风等 oussyl o推测 ≤¤un !Œ°v 作为信号转导途径的第二信使在油脂
合成期发挥着重要的作用 ∀研究表明 o过量表达一些脂肪酸合成酶k如菠菜 Βp酮酯酰 p „≤°合酶 ¶ oŽ„≥
¶l的基因后 o脂肪酸的含量反而降低了k⁄¨ «¨¶« ετ αλqousst ~׫¨¯¨ ± ετ αλqoussul ∀因此 o从研究油茶优质
丰产的角度而言 o不能只关注脂肪酸合成途径及脱饱和酶的研究 o也要研究这些酶发挥作用的细胞内微环
境 o信号转导途径的相关酶基因的联系也许是探讨油茶丰产的限制因子的一条有效途径 o此外 o克隆具有自
主知识产权的脱水素抗旱基因无疑对缓解当前日益严峻的干旱形势也具有重要意义 ∀
参 考 文 献
q萨姆布鲁克k≥¤°¥µ²²®l o⁄q • q拉塞尔 qussu1 分子克隆实验指南 qv版 q黄培堂 o等译 q北京 }科学出版社 ouy p uz q
谭晓风 o胡芳名 o谢禄山 o等 qussy1 油茶种子 ∞≥×文库构建及主要表达基因的分析 q林业科学 owuktl }wv p w{ q
张木清 o陈如凯 qussx1 作物抗旱分子生理与遗传改良 q北京 }科学出版社 ouzw p uzz q
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≥√¨ ±¶¶²± oŒ¶°¤¬¯ „  o°¤¯√¤ ∞ × o ετ αλqussu1 ⁄¨ «¼§µ¬±¶¶¨±¶¬±ªo¶¬ª±¤¯¬±ª¤±§¦¨¯¯ ¤§¤³·¤·¬²±q „°¶·¨µ§¤° } ∞¯¶¨√¬¨µotxx p tzt q
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k责任编辑 徐 红l
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