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Rapid Method for the Extraction of Abscisic Acid from Strawberry and Analysis by Ultra-high Performance Liquid Chromatography

草莓ABA 的快速提取方法及超高效液相色谱分析



全 文 :园 艺 学 报 2014,41(3):577–584 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期:2013–09–16;修回日期:2014–03–04
基金项目:国家自然科学基金项目(31101534);福建省农业科学院科技创新团队重点科研项目(CXTD2011-20)
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:zhs0246@163.com;fjvrc@163.com)
草莓 ABA 的快速提取方法及超高效液相色谱分

马宏棋,陈敏氡,朱海生*,温庆放*
(福建省农业科学院作物研究所,福建省农业科学院蔬菜研究中心,福建省蔬菜工程技术研究中心,福州 350013)
摘 要:采用甲醇︰乙酸乙酯︰甲酸 = 50︰50︰1 的混合液作为提取溶剂,可快速从草莓中提取 ABA,
整个提取过程可在 0.5 h 内完成,大大提高了 ABA 提取效率。建立了一套适合 ABA 分析的超高效液相色
谱分析体系,其流动相为甲醇︰乙腈︰0.1%甲酸 = 20︰10︰70,流速 0.3 mL · min-1,检测波长 265 nm,
柱温 30 ℃,进样 10 μL。利用建立的快速提取法及超高效液相色谱分析方法,测定了不同发育阶段草莓
果实(青果、白果、粉红果和红果)的 ABA 含量,发现其呈上升趋势,至红果期 ABA 含量达到最高。
关键词:草莓;脱落酸;超高效液相色谱;提取
中图分类号:S 668.4 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2014)03-0577-08

Rapid Method for the Extraction of Abscisic Acid from Strawberry and
Analysis by Ultra-high Performance Liquid Chromatography
MA Hong-qi,CHEN Min-dong,ZHU Hai-sheng*,and WEN Qing-fang*
(Crops Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences;Vegetable Research Center,Fujian Academy of
Agricultural Sciences;Fujian Engineering Research Center for Vegetables,Fuzhou 350013,China)
Abstract:This study was carried out to look for an optimized method for extraction of endogenous
abscisic acid(ABA)from strawberry and for ultra performance liquid chromatography(UPLC)analysis.
A rapid extracting method that using Methanol-ethyl acetate-formic acid(50︰50︰1,v/v)as extracting
liquid was found out,which can extract ABA from strawberry in half an hour. An efficient UPLC analysis
method for ABA was also established,Chromatographic separation was carried out by reversed Phase
ACQUITY UPLC BEH C18 column and with Methanol︰acetonitrile︰0.1% formic acid(20︰10︰70)
isocratic elution program,at column temperature of 30 ℃,injection volume of 10 μL,flowrate of
0.3 mL · min-1,and wavelength at 265 nm. Applying the extracting and UPLC analysis method,we
evaluated the content of ABA in strawberry fruit at different developments and ripening stages. The result
showed that with developing and ripening,content of ABA in strawberry was increasing,and reached the
highest level at the red ripening stage.
Key words:strawberry;ABA;UPLC;extraction

草莓(Fragaria × ananassa Duch.)属典型的非呼吸跃变型果实(Coombe,1976),其成熟调

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控以及采后保鲜困难一直是生产、运输及销售过程中的一个难题。脱落酸(Abscisic acid,ABA)对
草莓成熟及采后保鲜作用一直是研究者关注的重要方面,早期通过外加激素胁迫的方法,认为 ABA
和 IAA 比例的相互转换可能是草莓由生长到成熟转换的原因,而 ABA 可能加速蔗糖的吸收以及促
进色泽的转变,或者限制草莓果实中糖的流出(Archbold & Dennis,1984;Archbold,1988;John &
Yamaki,1994)。吴有梅等(1992)研究草莓采后激素的变化及相互关系,认为 ABA 可能是草莓
成熟衰老并导致其腐烂的内在因素。通过 ABA 相关基因的克隆及其表达量的变化规律研究也发现
ABA 可能在草莓成熟过程起着关键调控作用(贾海锋 等,2011;朱海生 等,2012a,2012b)。因
此,准确测定草莓中 ABA 的含量,对研究其在草莓生长成熟过程及采后期间变化规律,探索果实
成熟及贮藏保鲜具有重要意义。
从植物组织中提取 ABA 目前主要的方法是用 80%甲醇溶液过夜浸提(彭运生和凌祖铭,1992;
吴姗和骆耀平,2000),但存在浸提时间长(一般需 18 ~ 23 h),提取步骤复杂,过多的操作影响
了 ABA 的回收率等缺点(吴伯千 等,1992)。因此改进提取方法是对 ABA 进行精细分析的重要
研究内容。测定植物内源激素的方法众多,近些年比较常用的是高效液相色谱法(HPLC)分析(方
能虎 等,1998;陈昆松 等,2003;黄靖 等,2011;朱海生 等,2012a)。超高效液相色谱(Ultra
performance liquid chromatography,UPLC)是在 HPLC 基础上推出的一种新的液相色谱技术,具有
比 HPLC 更高的分离速度和灵敏度,目前主要应用在蛋白组学、药物分析、环境监测等众多高端领
域(Nguyen et al.,2006;Nováková et al.,2006)。近来也有一些将 UPLC 技术应用于植物内源激
素分析的报道,如 van Meulebroek 等(2012)使用超高效液相色谱—质谱法(UPLC–MS)分析测
定了西红柿中的 GA、IAA、ABA、JA、SA、ZT、6-BA、BR,蒋艳芳等(2012)也用 UPLC 的方
法测定了柑橘中的 ZT、GA、IAA、ABA。本文介绍了一种可以快速从草莓中提取 ABA 的方法,建
立了一套 UPLC 分析体系,并利用 UPLC 法对不同发育及成熟阶段草莓果实 ABA 的含量进行了测
定,为今后进一步研究草莓果实 ABA 积累规律及对果实成熟的调控提供技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
分别采摘‘福莓 1 号’草莓的青果、白果、粉红果和红果,置于–70 ℃冰箱冷冻保存待用。
试验用仪器为美国 Waters 超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC H-Class),光电二极管矩阵检
测器(eλPDA,WATERS,USA),2.1 mm × 100 mm,1.7 μm ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱
(WATERS,USA),旋转蒸发器(RV10,IKA,Germany)。
ABA标准品购自Sigma公司(USA);UPLC流动相甲醇和乙腈为色谱纯,购自Fisher公司(USA);
其余有机溶剂甲醇、乙酸乙酯、甲酸(98%)等均为国产分析纯,购自上海国药集团。ABA 标准品
的制备方法如下:将购买的盛于安瓿瓶中 25 mg ABA 标准品低速离心甩至瓶底,砂轮开口后直接向
安瓿瓶中加入 10 mL 色谱纯甲醇溶液溶解,制成 2.5 mg · mL-1 标准品母液保存于–20 ℃待用。
1.2 ABA 提取方法
方法一:ABA 的提取过程参照 Hubick 和 Reid(1980)并作修改后进行:样品用液氮快速研磨
成粉末后准确称取 5 g,加入 200 mL 提取溶剂(甲醇︰乙酸乙酯︰甲酸 = 50︰50︰1)剧烈振荡 5 min,
抽滤弃去残渣,滤液在 35 ℃下减压旋蒸至干,加入 2 mL UPLC 流动相溶解,收集溶液,过 0.2 μm
滤膜后上 UPLC 分析。
3 期 马宏棋等:草莓 ABA 的快速提取方法及超高效液相色谱分析 579

表 1 用于 UPLC 方法开发的流动相比例
Table 1 Solvent systems used to Optimizing
for the UPLC analysis
甲醇/%
Methanol
乙腈/%
Acetonitrile
2%乙酸/%
2% Acetic acid
0.1%甲酸/%
0.1% Formic acid
30 – 70 –
25 – 75 –
20 10 70 –
30 – – 70
25 – – 75
20 10 – 70
方法二:样品用液氮快速研磨成粉末后准确称取 5 g,加入 50 mL 预冷 80%甲醇提取液于 4 ℃
浸提 18 h,抽滤后滤渣分别再用 50 mL 预冷 80%甲醇重复浸提两次,浸提时间为 3 h 和 1 h,合并 3
次滤液,用石油醚脱色后,滤液在 35 ℃下减压旋蒸至水相,调 pH 至 2.8,然后用等体积乙酸乙酯
萃取 3 次,收集有机相,合并 3 次有机相于 35 ℃下减压旋蒸至干,加入 2 mL UPLC 流动相溶解,
收集溶液,过 0.2 μm 滤膜后上 UPLC 分析(彭运生和凌祖铭,1992)。
1.3 UPLC 体系的建立
选用Waters公司 2.1 mm × 100 mm,1.7 μm
ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱。色谱条件
采用等度洗脱方法,进样量为 10 μL,流速 0.3
mL · min-1,柱温 30 ℃,吸收波长 265 nm。为
了更好地得到 ABA 分离效果,根据 HPLC 分
析植物内源激素时常使用的流动相,设计不同
流动相(表 1)作为 UPLC 方法开发筛选。
用流动相将 ABA 标准品母液分别稀释至
0.1、0.25、0.5、0.75、1、2.5 和 5 μg · mL-1,
进行 UPLC 分析后做标准曲线。
用稀释至 1 μg · mL-1 的 ABA 标准品,重复进样 5 次,分别计算保留时间和峰面积的平均值、
标准差和变异系数,测定仪器的重复性以及方法的精密性。
取已知浓度的供试品溶液(0.636 μg · mL-1)1 mL,精密加入不同量(0.2、0.3、0.4、0.5 μg)
的标准品,分别按优化后的色谱条件进行测定,计算加样回收率。
1.4 不同发育阶段草莓果实 ABA 含量的测定
利用方法一建立的 ABA 提取方法及优化后的 UPLC 分析体系,测定草莓青果、白果、粉红果、
红果 4 个发育阶段果实的 ABA 含量,各阶段果实重复测定 5 次(每重复取果实不少于 3 个混合磨
样),取平均值,计算每克果实中 ABA 含量。
2 结果与分析
2.1 草莓 ABA 快速提取方法的建立
方法一中利用甲醇︰乙酸乙酯︰甲酸 = 50︰50︰1 的混合液作为提取溶剂,仅需剧烈振荡 5 min
即可提取草莓果实中的 ABA 成分,除去滤渣经减压浓缩后用流动相直接溶解可达到 UPLC 分析要
求,整个提取过程可以在 0.5 h 内完成。比方法二中利用 80%甲醇浸提法大大缩短了提取时间,提
高了提取效率。为了估测方法一快速提取时 ABA 的得率,分别用 2 种方法提取了 5 g 草莓红果粉末,
测定其 ABA 含量,方法一提取的 ABA 的量为 7.30 μg,方法二提取的量为 7.34 μg。从数据可以看
出,两种方法在 ABA 得率上相当,表明快速提取方法可以将组织中的 ABA 完全提取。
2.2 UPLC 体系的建立
2.2.1 色谱条件的确立
色谱条件进样量 10 μL,流速 0.3 mL · min-1,柱温 30 ℃,吸收波长 265 nm(朱海生 等,2012a),
这些参数条件在 UPLC 分析时表现稳定。为了得到更好地得到分离峰谱,对流动相进行了优化,设
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计了几种流动相混合比例分别进行等度洗脱。部分流动相混合比例的色谱图如图 1 所示。

图 1 不同流动相对草莓果实 ABA 色谱分离图
Fig. 1 The UPLC Chromatogram of ABA
3 期 马宏棋等:草莓 ABA 的快速提取方法及超高效液相色谱分析 581

在有机相和水相比例上,当有机相仅为甲醇时(占 30%或 25%),出现样品中其它物质与 ABA
有峰重叠现象,分离效果不佳(图 1,A1、A2),而当机相甲醇占 20%,乙腈占 10%时,各物质分
离效果清楚(图 1,B1、B2、C1、C2)。比较 2%乙酸和 0.1%甲酸作为缓冲液对色谱分析的影响,
使用 2%乙酸时分离色谱峰展较宽,有时会有拖尾现象(图 1,B1,B2),用 0.1%甲酸峰形尖锐,对
称性好(图 1,C1、C2)。
综上,确定甲醇︰乙腈︰0.1%甲酸 = 20︰
10︰70 是最为理想的洗脱流动相。
2.2.2 线性关系
以 ABA 进样标准品浓度(x)为横坐标,
峰面积(y)为纵坐标,绘制标准曲线(图 2)。
得直线回归方程:y = 98 200x–2 160,R2 =
0.9987。结果表明 ABA 在 0.1 ~ 5.0 μg · mL-1
范围内具有良好的线性关系。
2.2.3 精密度测试
用 1 μg · mL-1 的 ABA 标准品,重复进样 5
次后,经测定其保留时间平均值为 9.503 min,
变异系数为 0.13%;峰面积平均值为 96 040.03,变异系数为 0.36%,表明仪器的精密度良好。
2.2.4 加样回收率测试
在加样回收率测试中,样品本底含量及添加量和测定量如表 3 所示,计算其平均加样回收率为
102.2%,变异系数为 4.87%,数据表明测定结果可靠,符合分析要求。

表 3 ABA 回收率试验表
Table 3 ABA recovery test form
本底含量/μg
Background content
添加量/μg
Addition amount
测定量/μg
Measured content
回收率/%
Recovery rate
0.636 0.2 0.845 104.5
0.636 0.3 0.934 99.3
0.636 0.4 1.024 97.0
0.636 0.5 1.176 108.0

2.3 不同发育阶段草莓果实 ABA 含量的测定
利用建立的 ABA 快速提方法及 UPLC 分
析体系测定了草莓青果、白果、粉红果、红果
果实的 ABA 含量,结果分别为 0.23、0.28、0.42
和 1.46 μg · g-1。
可见,随着果实的成熟,ABA 含量表现出
上升的趋势,在成熟红果期显著上升达到 1.46
μg · g-1(图 3)。


图 2 ABA 标准曲线图
Fig. 2 The ABA standard curve of UPLC
图 3 不同发育阶段草莓果实的 ABA 含量变化
Fig. 3 Changes in ABA content during strawberry fruit
developments and ripening strages
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3 讨论
随着对植物激素在调节植物生长、抗逆、果实成熟及不同信号转导中的作用不断被发现,对植
物内源激素的精确分析显得越来越重要(Boursiac et al.,2013)。从植物组织中提取植物内源激素是
对其进行精确分析的首要步骤。
植物内源激素的提取方法通常根据相似相溶原理,利用适当溶剂将激素从植物组织中提取出
来。目前绝大部分使用的提取方法是 80%冷甲醇浸提过夜(彭运生和凌祖铭,1992;吴姗和骆耀
平,2000;黄靖 等,2011)。也有对提取溶剂作过部分改变的,刘同祥和张艳平(2010)用 100%
乙腈提取了辣椒苗中的 ABA,郑春霞和王强(2000)用 0.5 mol · L-1 NaOH 溶液提取了香梨中的 3
种植物激素(IAA、ABA、GA)。钟晓红等(2004)用甲醇︰氯仿︰甲酸混合溶液(12︰5︰3)浸提
后再用甲醇︰甲酸︰水(60︰40︰1)混合液重复浸提提取草莓的 IAA、ABA、GA。曾成鸣等(1992)
用乙醚滴加盐酸的方法提取香蕉、广柑、柠檬等果皮的 ABA。但这些提取方法都需要通过长时间
的浸提才能提取得到植物内源激素,一般至少需要十几小时以上。本研究中通过不断改进,利用
甲醇︰乙酸乙酯︰甲酸(50︰50︰1)作溶剂,通过振荡几分钟即可提取到草莓果实中的 ABA,这
可能是因为 ABA 在酸性条件下以分子状态形式存在,而能更快速地溶解于乙酸乙酯中的特点(黄
靖 等,2011),同时由于 ABA 的极性较弱,乙酸乙酯极性较甲醇弱,所以能更容易地溶解在乙酸
乙酯中。通过与 80%甲醇过夜浸提法对比试验验证,两种提取方法的 ABA 得率相当,表明这种振
荡快速提取的方法能够把草莓中的 ABA 完全提取。通过方法的改进,这大大缩短了 ABA 提取的
时间,提高了工作效率,同时由于步骤的简化,减少了的提取过程中 ABA 的损失,提高了 ABA
定量测定的准确性。本提取方法的建立也为其它植物组织中 ABA 以及其他内源激素的快速提取提
供了参考。
目前对植物内源激素的检测主要有生物鉴定法、气相色谱法、酶联免疫法、放射免疫法和高效
液相色谱法等。相对其它分析方法而言,高效液相色谱法具有灵敏度高、专一性强和重复性好等特
点,是当今最为常用的分析方法之一(黄靖 等,2011)。而 UPLC 使用杂化颗粒技术合成的 1.7 μm
填料,并使用严格的筛分技术使填料粒径分布更窄,同时使用全新的筛板和其它色谱柱硬件,使整
个色谱条件在更高的压力下进行,较传统 HPLC 具有更快的分离速度、更高的灵敏度和分离度,据
估计其分离速度、灵敏度及分离度分别是传统 HPLC 的 9 倍、3 倍及 1.7 倍(Nováková et al.,2006;
Unger et al.,2008)。由于植物内源激素在植物组织内属痕量分布,随着对其分析精度要求的不断提
高,UPLC 应用于植物激素的分析显得越来越重要,本研究中在前期已建立的 HPLC 分析草莓 ABA
基础上(朱海生 等,2012a),利用不同混合比例的流动相对 ABA 分析的 UPLC 体系进行了优化。
为了避免使用无机盐对色谱柱的损伤,分析过程中选择以 0.1%甲酸和 2%乙酸作为 pH 缓冲液,并
比较了两者对 UPLC 分析的影响。据曾成鸣等(1992)报道,当流动相为甲醇︰2%乙酸 = 30︰70
时能有效分离 ABA,但本研究中发现,UPLC 分析时甲醇与缓冲液比例为 30︰70 时,缓冲液无论是
2%乙酸还是 0.1%甲酸,均未能达到理想的分离效果,改变甲醇比例为 25%时,同样分离效果不理
想,当流动相中加入 10%乙腈时 ABA 的分离效果明显。这表明在 HPLC 与 UPLC 方法转换时流动
相方案存在一定差异。比较 0.1%甲酸和 2%乙酸作为缓冲液对 ABA 的 UPLC 分离效果时,发现使
用 2%乙酸作缓冲液时分离色谱峰展较宽,有时会有拖尾现象,用 0.1%甲酸时峰形尖锐,对称性好,
稳定性强。
利用建立的 ABA 快速提取方法及 UPLC 分析体系,测定了草莓果实不同发育阶段(青果、白
果、粉红果和红果)ABA 的含量变化,发现在草莓果实整个发育成熟过程中 ABA 含量总体呈上
3 期 马宏棋等:草莓 ABA 的快速提取方法及超高效液相色谱分析 583

升趋势,青果至粉红果期间变化较缓慢,至红果期其含量迅速增加并达到最高值。这与钟晓红等
(2004),贾海锋等(2011)和朱海生等(2012a)研究结果基本一致,这也为 ABA 在草莓生长成
熟阶段的调控作用研究提供了一定的数据依据。
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