全 文 ：园艺学报，2016，43 (2)：347–355.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0634；http：//www. ahs. ac. cn 347
收稿日期：2015–10–23；修回日期：2016–02–18
基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2014CM028）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：guoxf@sdau.edu.cn）
凤丹（Paeonia ostii）脂肪酸去饱和酶基因
PoFAD2的克隆及表达分析
宋淑香 1，郭先锋 1,2,*，马 燕 1，李俊杰 1，韩璐璐 1
（1 山东农业大学林学院，山东泰安 271018；2 山东省城乡风景园林工程技术研究中心，山东泰安 271018）
摘 要：以油用牡丹凤丹（Paeonia ostii T. Hong & J. X. Zhang）胚珠为试材，通过反转录 PCR（reverse
transcription PCR，RT-PCR）及 RACE 技术得到脂肪酸去饱和酶基因 FAD2 的 cDNA 全长，命名为 PoFAD2
（GenBank 注册号为 KT153989）。该基因全长为 1 695 bp，开放阅读框（open reading frame，ORF）为 1 152
bp，编码 383 个氨基酸。系统发育树结果表明 PoFAD2 与芍药（P. lactiflora）FAD2 具有最高的同源性，亲
缘关系最近。此外，PoFAD2 编码的氨基酸序列中存在 3 个高度保守的组氨酸簇及 4 个跨膜区，且含有
Delta12-FADs 的特异位点，这些结果表明，该基因属于脂肪酸去饱和酶家族。实时荧光定量 PCR（real-time
quantitative PCR，qRT-PCR）结果表明：PoFAD2 在凤丹各组织中的表达差异较大，在茎、萼片、雄蕊及
花瓣中几乎不表达，在叶片中极微弱表达，表达量仅为胚珠中的 1/73，在芽及雌蕊中低表达，表达量约
为胚珠中的 1/10 ~ 1/12，而在胚珠中高表达；种子发育进程中，PoFAD2 表达量呈现先急速上升之后迅速
下降再回升的趋势，且于花后 75 d 出现表达量的最高峰。
关键词：凤丹；FAD2基因；基因克隆；表达分析；种子
中图分类号：S 685.11 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）02-0347-09

Isolation and Expression Analysis of PoFAD2 Gene in Paeonia ostii
SONG Shu-xiang1，GUO Xian-feng1,2,*，MA Yan1，LI Jun-jie1，and HAN Lu-lu1
（1College of Forestry，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China；2Shandong Provincial
Research Center of Landscape Engineering Technology for Urban and Rural，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：A fatty acid desaturase2（FAD2）gene，designated as PoFAD2，was isolated from the ovule
of Paeonia ostii T. Hong & J. X. Zhang using reverse transcription PCR and RACE technology. The
full-length cDNA was 1 695 bp with an open reading frame of 1 152 bp，encoding a putative protein of 383
amino acids. The phylogenetic tree analysis indicated that PoFAD2 had the highest similarity with FAD2
from P. lactiflora. In addition，the amino acid sequences encoded by PoFAD2 contained three highly
conservative histidine clusters，four transmembrane domains and a specific hit of Delta12-FADs，which
peculiarly belong to the family of fatty acids desaturase. Real-time quantitative PCR showed that PoFAD2
was differentially expressed in various tissues of P. ostii. It was barely expressed in stems，sepals，stamens
or petals，weakly present in leaves（about one seventieth of ovules），moderately in buds and pistils（about

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one tenth of ovules），and extremely highly in ovules. This gene was therefore considered as seed specific.
During seed development，PoFAD2 transcript in ovules rapidly increased and reached the highest level at
75 day after florescence，followed by a sharp decline and gradual recovery.
Key words：Paeonia ostii；PoFAD2；molecular cloning；expression analysis；seed

在不饱和脂肪酸合成过程中，脂肪酸去饱和酶 FAD2（fatty acid desaturase 2）基因控制编码内质
网结合的油酸去饱和酶，此酶首先催化单不饱和脂肪酸——油酸脱氢生成亚油酸，亚油酸再由其它
脱氢酶催化生成亚麻酸等一系列多不饱和脂肪酸，因此 FAD2 是植物体内合成多不饱和脂肪酸的限
速酶（Okuley et al.，1994；Lee et al.，2013）。分离油料植物中 FAD2 基因并研究其表达模式，已成
为该领域科学研究的热点之一。
凤丹（Paeonia ostii T. Hong & J. X. Zhang）属于油用牡丹，是一种重要的新型油料作物。根据
测定，凤丹籽油中亚油酸（linoleic acid，LA）和亚麻酸（linolenic acid，LNA）这两类不饱和脂肪
酸含量较高，二者均由油酸（oleic acid，OA）脱氢而来（林萍 等，2006）。研究凤丹中的 FAD2，
对于进一步了解该基因的结构、功能及调控方式等具有重要研究意义，同时也将为通过基因工程调
节凤丹种子中各不饱和脂肪酸的含量奠定基础。
对模式植物及一些常见油料作物 FAD2 的研究已有很多报道。1990 年以来，前人已对多不饱和
脂肪酸含量较高的植物，如棉花（Pirtle et al.，2001）、油菜（熊兴华 等，2002）、玉米（Tao et al.，
2006）、马齿苋（Teixeira et al.，2009）、红花（官玲亮 等，2013）及多不饱和脂肪酸含量较低的植
物，如拟南芥（Zhang et al.，2009）、油茶（谭晓风 等，2008）、花生（谢金喜 等，2007；黄冰艳 等，
2008）等物种的 FAD2 序列和相关表达进行了研究，并成功分离了相应的基因序列；Miller 等（1987）
还对多不饱和脂肪酸较高的植物向日葵的FAD2进行了人工诱变，使葵花籽油的油酸含量提升了40% ~
60%，亚油酸含量下降了 36%（单基因突变体）和 54%（双基因突变体）；此外，Hitz（1995）、熊
兴华（2002）等通过对∆12 油酸去饱和酶基因的反义抑制，培育出高油酸含量的油菜新材料。综上所
述，在多种油料植物中已克隆得到了 FAD2 的基因序列，并进行了转基因及表达调控的研究。而凤
丹作为一种新型油料植物，其 FAD2 基因的研究却尚为空白。
本研究中通过 RT-PCR、RACE 技术及实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术研究 PoFAD2 基因序
列及表达情况。
1 材料与方法
1.1 材料
供试凤丹材料采自山东省菏泽牡丹园内。于开花后 60 d 采集胚珠用于基因克隆试验，2015 年 3
月中旬采集混合芽，4 月中旬采集幼叶、成熟叶、茎、萼片、花瓣、雄蕊及雌蕊，用于不同器官组
织的荧光定量分析。采集凤丹开花后 25、50、75、100 和 110 d 的胚珠，用于种子发育进程表达分
析试验。所采材料均经液氮速冻后于–80 ℃保存备用。
EASY spin 植物 RNA 快速提取试剂盒购自艾德莱生物科技有限公司；5′-RACE System for Rapid
Amplification of cDNA Ends，Version 2.0 购自 Invitrogen 公司；反转录试剂购自全式金生物技术有限
公司；PMD18-T Vector 连接试剂盒、胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；AceQTM qPCR
SYBR Green Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
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凤丹（Paeonia ostii）脂肪酸去饱和酶基因 PoFAD2 的克隆及表达分析.
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1.2 基因克隆
凤丹胚珠及其他供试材料总RNA的提取参照艾德莱的EASY spin植物RNA快速提取试剂盒说
明书操作。利用琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测 RNA 的质量及浓度。从总 RNA 中取 1 µg 以随
机引物 OligodT 进行反转录合成第 1 链 cDNA。
从 NCBI 下载芍药、芝麻、油桐、花生及西葫芦的 FAD2 基因序列，根据这些序列的保守区域，
利用软件 DNAMAN5.2.2 设计简并引物（表 1）。

表 1 凤丹 PoFAD2 基因克隆及表达分析所用引物及其序列
Table 1 Primers used to clone and analyze the expression of PoFAD2
用途
Purpose
引物名称
Primer name
核苷酸序列（5′–3′）*
Nucleotide sequence
F1 GCHCATGARTGTGGHCAYCAT 中间片段扩增
Intermediate fragment amplification R1 YGCCTCYCTCCACATYGCCTT
3′F1 ACAAGGCAATGTGGAGAGAGG 3′RACE PCR 扩增
3′RACE amplification B26 GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT
GSP-1 AGTGTTGGAGTGGTGG
GSP-2 GTGGCTGTGTTTCCATGAG
GSP-3 TGATGAGTGGAGGATGAGG
GSP-4 AGCCTTGTAGTGCCCAGT
GSP-5 AGCAACATAAGGGAAGGG
5′RACE PCR 扩增
5′RACE amplification


GSP-6 AAGGGAAGGGGTGAGGAA
FAD2-f TCCCTTGCTCAAAGCCTCCAT 全长 cDNA 扩增
Full-length cDNA amplification FAD2-r CCTCATCCGGCTCAACATAGT
Actin 内参引物 Actin-F GAGAGATTCCGTTGCCCAG
Actin primers Actin-R TCCTTGCTCATTCTGTCTGC
Real-time PCR 引物 qPCR-F TCACGCTTACTCTTGGATGGC
Specific primer for real-time PCR qPCR-R CGTATGGATCGTAGTGGCAAG
* H = A/T/C；R = A/G；Y = C/T。

以凤丹胚珠第 1 链 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 的反应体系为：cDNA 1 µL，上下游引物
各 1 µL（10 µmol · L-1），PCR MIX 12.5 µL，用 ddH2O 补足至 25 µL。PCR 反应条件为：94 5 min℃
预变性；94 1 min℃ ，55 30 s℃ ，72 ℃ 45 s，共 35 个循环；72 ℃延伸 10 min。将 PCR 产物用胶回
收试剂盒回收后，与 pMD18-T 载体连接，然后转化大肠杆菌 DH5α，挑选阳性克隆，送华大基因公
司测序。
利用软件 DNAMAN5.2.2 和得到的中间片段序列设计 3′端特异引物 3′F1 及 5′RACE 特异引物
GSP-1、GSP-2 和 GSP-3。利用 F1、3′F1 和 B26 进行嵌套 PCR 扩增，并经回收、连接、转化及测序
后得到 3′端序列。利用特异引物 GSP-1、GSP-2、GSP-3 用于 5′-RACE 的嵌套 PCR 扩增，并经回收、
连接、转化及测序，具体扩增步骤参照试剂盒说明；根据上述得到的序列再设计特异引物 GSP-4、
GSP-5、GSP-6，方法同上，测序得到 5′端序列。
1.3 基因的生物信息学分析
开放阅读框（open reading frame，ORF）查找和核苷酸翻译等使用 DNAMAN5.2.2 及 DNATOOLS
软件；BLAST 同源性搜索在 NCBI 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行分析。
FAD2 蛋白的基本理化性质、跨膜结构、二级结构及亚细胞定位分别通过在线软件 ProtParam
（http：//web. expasy. org/protparam/）、TMHM（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）、SOPMA
（http：//nhjy. hzau. edu. cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8. htm）及 PSORT（http：//psort.
hgc. jp/cgi-bin/runpsort. pl）分析获得。
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用 MEGA5.05 的 Neighbor-Joining 法构建系统发育树，采用自举法（bootstrap）对系统发育树
进行检验，共 1 000 次循环，以保证系统树的可靠性。
1.4 基因的表达分析
首先分别提取胚珠、芽、幼叶、成熟叶、茎、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊等不同器官及不同发育
时期种子的总 RNA，并反转录 cDNA 第 1 链。再以反转录后的 cDNA 为模板，根据 FAD2 基因全序
列设计荧光定量 PCR 引物（表 1），研究其在不同器官组织间及种子发育进程中的表达情况，以牡
丹 Actin 作为内参。
荧光定量 PCR 采用 AceQTM qPCR SYBR Green Master Mix，参照说明书进行，反应体系为 20 μL，
包括 10 μL SYBR Green Master Mix，2 μL cDNA，引物各 0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反应程序为：95 ℃
变性 5 min；然后，95 10 s℃ ，60 ℃退火 30 s，共 39 次循环；每次循环第 3 步进行荧光采集，最后
退火至 65 ℃，每隔 5 s 上升 0.5 ℃，至 95 ℃变性 1 min。
qRT-PCR 反应使用 Bio-Rad CFX96TM 系统进行荧光采集。
cDNA 标样和待测样均设置 3 次重复，数据分析采用 2-ΔΔCT 法。
2 结果与分析
2.1 PoFAD2 基因的克隆及序列分析
提取凤丹胚珠的 RNA 用于 PCR 扩增，获得了 1 个约 760 bp 的中间片段（图 1，A）。根据保守
序列，分别进行 3′和 5′-RACE 扩增，获得该基因序列的 3′端（图 1，B）及 5′端序列部分片段（图 1，
C）；再由得到的 5′端序列进行第 2 次 5′-RACE 扩增，获得 5′端剩余序列（图 1，D）。将所得到的中
间片段、3′端及 5′端序列拼接后，设计上、下游引物扩增得到该基因的全长 cDNA 序列（图 1，E）。


图 1 FAD2 基因 cDNA 的扩增
A：中间片段；B：3′-RACE；C、D：5′-RACE；E：全长 cDNA 片段。M：Marker。
Fig. 1 PCR amplification of FAD2 cDNA
A：Intermediate fragment；B：3′-RACE；C，D：5′-RACE；
E：Full-length fragment. M：Marker.

序列分析结果（图 2）表明，凤丹 PoFAD2 基因序列全长 1 695 bp，5′非编码区 277 bp，3′非编
码区 261 bp（不包括 polyA 尾巴），开放阅读框 1 152 bp，共编码 383 个氨基酸。该序列与已知物种
的 FAD2 基因高度同源，故将其命名为 PoFAD2（在 GenBank 登录号为 KT153989）。

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图 2 PoFAD2 cDNA 序列及其推导的氨基酸序列
方框标注起始密码子 ATG 和终止密码子 TAA；灰色阴影标注 3 个组氨酸簇。
Fig. 2 PoFAD2 cDNA nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence
The ATG start codon and TAA stop codon are marked in boxes. Three His clusters are marked by shadow.

2.2 PoFAD2 基因编码蛋白的生物信息学分析
ProtParam 分析表明，PoFAD2 蛋白的分子式为 C2070H3033N527O540S14，相对分子质量为 44 389.9
Da，预测，PoFAD2 蛋白中共有 4 个跨膜区，分别位于 55 ~ 77 位、178 ~ 200 位、223 ~ 245 位、
250 ~ 272 位，其中第 4 个跨膜区的疏水性较强。
SOPMA 分析发现，α–螺旋（α-helix）、无规则卷曲（random coil）和 β–折叠（β-sheet）构成
PoFAD2 酶蛋白的最大量的结构元件，分别占 36.55%、31.85%和 21.93%；而 β–转角（β-turn）则占
9.66%，散布于整个蛋白质中。利用 NCBI Conserved Domain Search 预测 PoFAD2 蛋白的保守结构域。
结果表明：PoFAD2 编码的蛋白主要包括 1 个脂肪酸去饱和酶所共有的保守功能域，即∆12–脂肪酸
去饱和酶型结构域，该结构域内，共含有 3 个高度保守的组氨酸簇——HECGHH、HRRHH、HVAHH，
分别在氨基酸序列 105 ~ 110、140 ~ 144、314 ~ 318 的位置（在图 2 中分别用灰色阴影标出），其中
第 1 个和第 2 个相隔 30 个氨基酸，距离较短；而第 2 个和第 3 个之间相隔 170 个氨基酸，距离较远。
这 3 个组氨酸簇可富集二价铁离子，是 PoFAD2 酶的催化活化中心。
2.3 PoFAD2 的蛋白系统进化分析
从 NCBI 氨基酸比对结果中选取 12 个与 PoFAD2 蛋白同源性较高的其他植物 FAD2，分析其系
统进化关系，结果如图 3 所示。这些氨基酸序列可以聚为两大类。第一大类中，凤丹与芍药（P.
lactiflora）最先聚合，表明其在进化上与芍药亲缘关系最近；接着与芝麻（Sesamum indicum）、油橄
榄（Olea europaea）聚合为一个亚类，再与亚麻（Linum usitatissimum）、蓖麻（Ricinus communis）、
橡胶树（Hevea brasiliensis）和油桐（Vernicia montana）构成的另一亚类聚合为一大类，该大类的
其他 7 个物种均为典型的种子油用型作物，由此推断，总体上，PoFAD2 在进化上与种子油用型作物
的 FAD2 相近；第二大类包括醉蝶花（Tarenaya hassleriana）、芥菜（Brassica juncea）、播娘蒿
（Descurainia sophia）等 5 种植物，表明 PoFAD2 在进化上与这些植物的亲缘关系较远。

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图 3 PoFAD2 与其他物种 FAD2 蛋白系统进化树分析
Fig. 3 The phylogenetic tree derived from the alignment of amino acid
secquences of PoFAD2 and other FAD2s

2.4 PoFAD2 的表达分析
2.4.1 不同器官组织间的表达分析
PoFAD2 在凤丹中的表达具有明显的组织特异性，在茎、萼片、雄蕊及花瓣中几乎不表达，在叶
片中（不管是成熟叶还是幼叶）极微弱表达，表达量仅为胚珠中的 1/73；在芽及雌蕊中低表达，表
达量约为胚珠中的 1/10 ~ 1/12；而在胚珠中高表达。由此推断，PoFAD2 的主要表达器官是种子；对
于 PoFAD2 在芽、雌蕊中具有一定表达量的原因推测如下：种子由雌蕊进一步发育而来，而混合芽
又是雌蕊的发育前体，在由芽—雌蕊—胚珠的发育过程中，PoFAD2 的表达水平是由低（芽、雌蕊中）
到高（胚珠中）的趋势。

图 4 PoFAD2 在凤丹各种器官中的表达特性
Fig. 4 Expression characteristics of PoFAD2 in different organs of Paeonia ostii

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图 5 PoFAD2 在凤丹种子发育进程中的表达特性
Fig. 5 Expression characteristics of PoFAD2 in
developing Paeonia ostii seeds

2.4.2 种子发育进程中的表达分析
利用 qRT-PCR 技术测定种子发育进程中 5
个时期的 PoFAD2 相对表达情况。结果如图 5
所示，花后 75 d 内，PoFAD2 表达量急速上升，
75 d 时达到最高峰，之后迅速下降（花后 75 ~
100 d），至种子接近成熟时则又回升（花后 100 ~
110 d），总体呈现急速上升—下降—回升的变
化趋势。
3 讨论
FAD2 基因催化多不饱和脂肪酸生物合成
的第 1 步反应，参与在脂肪酸碳链的第 12 位碳
原子上引入第 2 个双键，负责除质体膜内膜膜
脂外所有不饱和甘油脂的合成，是植物体中产生多不饱和脂肪酸的一个关键酶（Alonso et al.，2003；
Lee et al.，2012，2013）。该基因目前已经在拟南芥等模式植物及大豆、花生、芝麻等油料植物中陆
续分离得到，但前人研究结果表明，FAD2 虽具有比较高的保守性，却在不同植物中基因的核酸序列
和数量上都不一样（戴晓峰 等，2007；Li et al.，2007；官玲亮 等，2013）。凤丹作为一种新兴的
油料作物，于 2011 年被卫生部批准为新资源作物，其 FAD2 基因的研究尚为空白。本研究首次以凤
丹未成熟种子为研究对象，采用 RT-PCR 及 RACE 技术对凤丹 FAD2 基因进行克隆，获得了凤丹 FAD2
基因的 cDNA 全长序列并挖掘了其生物学信息，开展了表达模式研究。这是有关牡丹去饱和酶基因
PoFAD2 的首次报道。本研究的结果为进一步研究该基因的表达、调控方式及脂肪酸合成分子机制等
奠定了基础，也为油用牡丹分子育种奠定了基础，即通过对 PoFAD2 基因的正义表达或反义抑制可
望培育出多不饱和脂肪酸含量更高或偏低的转基因牡丹新品系。
PoFAD2 基因编码的氨基酸序列与油茶（谭晓风 等，2008）等其他物种相比，同样含有 3 个高
度保守的组氨酸簇——HECGHH、HRRHH 和 HVAHH，且氨基酸位置基本一致，符合 FAD2 的氨基
酸簇特征；其跨膜结构域与棉花 FAD2 中所含的 6 个跨膜结构域（常颖 等，2009）相比，在数量、
长度及所在位点上差别较大，但与橄榄（Hernandez et al.，2005；常颖 等，2009）、红花（官玲亮 等，
2013）的 FAD2 相同，且至少 3 个所在的氨基酸位点基本一致。高等植物中的 FAD2 基因属于一个亚
家族，其氨基酸序列一般均包含 3 个组氨酸保守区及 4 个跨膜区（Dyer et al.，2002），本研究中获
得的 PoFAD2 序列与前人推测的模型基本一致。
脂肪酸去饱和酶 FAD2 基因具有管家型表达（housekeeping type）和种子特异性表达（seed type）
两种（Kim et al.，2006）。PoFAD2 基因的同源性比对及系统进化树分析结果均表明，该基因序列与
其他作物中种子特异表达的 FAD2 序列具有很高相似性；并且，qRT-PCR 检测结果表明，该基因在
胚珠中表达量极高，因此推测该基因属于种子特异型，且在种子发育进程中第 3 时期（花后 75 d）
表达量最高。关于 PoFAD2 表达量在种子发育进程中呈现出的“上升—下降—回升”趋势，推测其
原因如下：（1）与反应底物油酸含量的变化有关；（2）在脂肪酸去饱和途径中，处于 FAD2 下游的
脂肪酸去饱和酶 FAD3 的酶活性变化同样间接影响着 PoFAD2 的表达。
FAD2 在很多植物中存在多拷贝现象，不同基因拷贝的表达特性和功能有差异（Jung et al.，2011；
Song Shu-xiang，Guo Xian-feng，Ma Yan，Li Jun-jie，Han Lu-le.
Isolation and expression analysis of PoFAD2 gene in Paeonia ostii.
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Lee et al.，2013）。本研究中虽然只分离到一种 FAD2 基因，但其表达特征表明该基因有可能是凤丹
种子中脂肪酸去饱和的主要功能基因。对于凤丹中可能存在的其他 FAD2 拷贝，尚待于进一步的探
索。

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