全 文 ：园艺学报，2016，43 (2)：365–372.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0590；http：//www. ahs. ac. cn 365
收稿日期：2015–10–31；修回日期：2016–02–18
基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2014CM028）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：guoxf@sdau.edu.cn）
致谢：本论文研究在山东省农业生态与环境重点实验室、山东农业大学农业微生物重点实验室完成，谨致谢意！
山东省芍药红斑病病原菌鉴定
李 丽 1，宋淑香 1，刘会香 2，郭先锋 1,*
（1 山东农业大学林学院，山东泰安 271018；2 山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018）
摘 要：从山东菏泽和泰安两地感病芍药（Paeonia lactiflora Pall.）植株的叶片上进行了红斑病病原
分离纯化和致病力检测，并对致病菌进行了形态学鉴定及 rDNA-ITS 序列分析。研究结果表明，病样组
织中可分离到两种疑似病原菌，分离比例为 4.8︰1，初步鉴定为链格孢（Alternaria alternata）和细极链格
孢（A. tenuissima）。进一步 rDNA-ITS 分析结果表明，两种病原菌 5.8S rDNA 及其两侧 ITS 区序列分别与
GenBank 中序列号为 KF380822.1、HM467832.1 的同源性最高，均为 99%，由此确定两种病原菌分别为
链格孢Alternaria alternata和细极链格孢A. tenuissima，其序列已在GenBank登录，登录号分别为KR912224
和 KR912225。因此，确定山东省芍药红斑病是由链格孢 A. alternata 和细极链格孢 A. tenuissima 两种病原
菌引起的复合侵染。
关键词：芍药；红斑病；病原鉴定；链格孢属；rDNA-ITS
中图分类号：S 682.1+2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）02-0365-08

Identification of Red Spot Pathogens on Peony in Shandong Province
LI Li1，SONG Shu-xiang1，LIU Hui-xiang2，and GUO Xian-feng1,*
（1College of Forestry，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China；2College of Plant Protection，
Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：Red spot has been one of the most serious diseases in herbaceous peony production.
Identification of the pathogen causing the disease is necessary for the determination of effective treatment
options. In the present study，firstly，the fungi were isolated and purified from the infected leaves and the
pathogenicity was detected by artificial inoculation. Then the morphological characteristics and rDNA-ITS
sequence of the pathogens causing red spot disease was studied. The results demonstrated that two kinds of
suspected fungi，A and B，were isolated from the disease-infected samples，with the isolation ratio of 4.8︰
1. Both fungi were further confirmed pathogenic and therefore determined as the pathogens. The
morphological characteristics revealed that these two pathogens were Alternaria alternate and A.
tenuissima，which was validated by further rDNA-ITS analysis. ITS1-5.8S rDNA-ITS2 sequences of
pathogen A and pathogen B were respectively highly homogenic with those of KF380822.1 and
HM467832.1 in GenBank database，hence they were respectively identified as A. alternate and A.
tenuissima. The sequences of these two pathogens have been submitted to GenBank，and the accession
numbers are KR912224 and KR912225. Based on the above results，it was concluded that red spot disease

Li Li，Song Shu-xiang，Liu Hui-xiang，Guo Xian-feng.
Identification of red spot pathogens on peony in Shandong Province.
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on herbaceous peony in Shandong province was caused by both A. alternate and A. tenuissima.
Key words：Paeonia lactiflora；red spot；pathogen identification；Alternaria；rDNA-ITS

芍药（Paeonia lactiflora Pall.）红斑病又称褐斑病，是芍药生产中最常见的病害，在中国大部分
芍药种植产区常大面积发生。该病危害芍药茎、叶、花和蓇葖果，尤以叶片危害最为严重。一般植
株在开花前后即感染，在夏季高温多雨时发病严重（李嘉珏，1999；秦魁杰，2004）。该病害严重降
低植株的观赏价值，而且还极大影响叶片正常的光合作用，阻碍芍药地下芽的发生及花芽分化，导
致植株第 2 年的开花数量及花朵品质明显下降。因此，准确鉴定芍药红斑病致病病原菌，对生产实
践中的科学防控具有重要研究和实用意义。
前人关于芍药病害的报道多集中在病害综述（俞思佳 等，1993；李桂凡 等，2001）和不同地
区病害种类调查及品种抗病性研究方面（姜瑶 等，2013；石颜通 等，2014），但对病原菌的鉴定研
究较少，仅蓝莹等（1984，1987）对南京地区芍药灰霉病及红斑病开展过病原的形态学鉴定及生物
学特性研究，在其关于芍药红斑病病原方面的研究中，报道了南京地区芍药红斑病的病原菌为链格
孢。但在不同地域不同生态条件下某种病害的致病病原可能存在差异（范子耀 等，2013）。山东省
是中国观赏芍药品种最为集中、种植规模最大的产区，其红斑病发生的病原是否与前人研究报道一
致，目前尚无相关研究证实。
本研究中以栽种于山东菏泽和泰安的芍药为研究对象，拟通过植物病原真菌的形态学特征、致
病性检测以及 rDNA-ITS（internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA）序列分析，明确其
芍药红斑病致病病原的种类。
1 材料与方法
1.1 材料
病原分离的寄主植物材料采自山东省泰安市山东农业大学林学实验站芍药种植资源圃和山东
省菏泽市曹州牡丹园，从前者产地采集的寄主芍药品种有‘春晓’、‘大富贵’、‘粉玉奴’、‘红星满
天’、‘蝴蝶戏金花’、‘菱花晨浴’、‘奇花露霜’、‘巧玲’、‘杨妃出浴’、‘红楼藏金’等 10 个品种；
从后者产地采集的有‘晨曦’、‘丹凤’、‘粉玉奴’、‘鲁红’、‘奇花露霜’等 5 个品种。
1.2 病原菌的分离与纯化
2013 年 5—6 月，通过形态调查结合病害研究专家协同诊断，从其感病植株的病叶、茎、花上
共分离了 561 块组织病块。采用常规组织分离法进行病原菌的分离（方中达，1998）。清洗芍药病样，
取其病健交界处的组织小块，约 2 mm × 2 mm，先后用 75%的酒精和 0.1%的升汞各消毒 30 s和 2 min，
无菌去离子水冲洗，之后接种于 PDA 培养基平板上，每皿 5 块，置于光照培养箱中培养 5 ~ 6 d，
培养条件为 28 ℃，12 h/12 h 光暗交替。3 次重复。病原菌的纯化采用单孢分离法（龚国淑 等，2010）。
纯化菌株于 4 ℃保存备用。
1.3 致病性测定
采用离体刺伤接种法，清水作对照，同时采用无伤接种作为阳性对照（檀根甲 等，2008；吴
良庆 等，2010）。将纯化后培养 5 ~ 7 d 的新鲜病原菌的菌落、菌丝或孢子配成悬浮液，浓度为 1 × 106
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个 · mL-1。每个病原物接种时，均选健康叶片 30 ~ 40 片。接种前将组织用灭菌水清洗干净，经 75%
酒精表面消毒后，用灭菌的昆虫针刺成微伤口，接种病原菌孢子悬浮液 100 μL 于伤口处，28 ℃，
12 h/12 h 光暗交替，保湿培养，3 d 后观察记录发病情况。病原物接种致病后，将发病的组织进行
病原的重新分离，检验分离病原是否与接种病原一致。
1.4 病原菌的形态鉴定与分子鉴定
将分离纯化后的菌株接种于 PDA 培养基上培养，观察记录菌落的颜色、形状、表面特征、生
长速度等。在显微镜下观察孢子的类型、大小、颜色、分生孢子梗特征等。
采用液体培养法，将菌丝置于 PSA 培养基中，于 28 ℃、200 r · min-1 振荡培养 3 d，获得大量
菌丝，再采用两层无菌滤纸进行抽滤，65 ℃烘干备用。
采用 2× CTAB 法提取总 DNA（易润华 等，2003）。PCR 扩增采用真菌 rDNA 通用引物 ITS1
和 ITS4，均由北京华大基因合成。用于 ITS 序列的 PCR 扩增反应体系为 25 mL（10× 缓冲液，2.5 mL；
MgCl2，1.0 mL；ITS1 和 ITS4，各 2.0 mL；2.5 U · μL-1 的 Taq 酶 0.5 mL；DNA 模板，1.0 mL；ddH2O，
15.0 mL）。反应程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，
30 个循环；72 ℃保温 10 min；4 ℃保温。
PCR 扩增产物采用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，采用纯化回收试剂盒（BIOMIGA 生物公司）
进行回收。
PCR 回收产物送交北京华大基因研究中心有限公司进行测序。将测序完成的菌株序列提交到
NCBI 上，并用 BlastTn 进行同源性比对，确定菌株的分类地位。
为构建系统发育树，将已知种属的序列（表 1）与目标序列以 FASTA 格式编辑成为一个文本文
件，并加入其它外属序列进行对比，用 MEGA5.05 的 Neighbor-Joining 法构建系统发育树，采用自
举法（bootstrap）对系统发育树进行检验，共 1 000 次循环，以保证系统树的可靠性。最后将所得系
统树以 EMF 的形式输出保存。

表 1 用于系统发育分析的引用序列
Table 1 The reference sequences used in phylogenetic analysis
种类 菌株 ITS 登录号 种类 菌株 ITS 登录号
Species Strains GenBank accession Species Strains GenBank accession
A. alternata HETAO-10 KJ002064

MG3 HM467832
FS7 KP689210 A. allii CBS121345 KJ718624
C-10 KJ526174 A. sesami CBS240.73 JQ646427
KS44T14L KF380822 A. zinniae CBS118.44 KJ718771
A. tenuissima JL-7W JX867218 Cladosporium phaenocomae CPC18221 JF499882
FL8 KP689164 C. multigeniculatum ATCC38012 AY352589
dzlw5 FJ949086 Venturia nashicola CYP51 AJ314649
2 结果与分析
2.1 病害田间症状
芍药红斑病为害芍药叶片、茎、花，且在叶片上发病尤为严重（图 1，A）。常在开花前后发病。
发病初期，叶片的正反面出现黄褐色针头状小点；随后病斑扩大增多，颜色加深，20 d 后病斑可扩
大成 1 ~ 3 cm 大小的病斑，圆形或不规则形，呈现红色、红褐色、栗褐色至黑色；病斑发展不受叶
脉限制，可横跨叶脉，扩大成片，若病斑发生在叶片边缘，可使叶片卷曲；后期病斑焦枯。在山东
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泰安、菏泽地区的 8、9 月，当温度升高湿度增大时，可在叶片的正反面产生褐绿色的霉层，为病原
菌的分生孢子梗及分生孢子，可直接切片镜检。
茎受害后，初期出现紫红色的（长）圆形小点，部分凸起，之后病斑缓慢扩展，直至相连成片，
色深红褐色如烧焦状（图 1，B）。花朵花期较短，因此受害后的表现不如叶片和茎严重，仅在花瓣
或花萼上出现红褐色斑点。
2.2 病原菌的分离及致病性检测
经组织分离，从 561 块病样组织块中主要分离到两种疑似病原菌，其中分离到 409 个疑似病原
菌 A，分离率 72.9%；疑似病原菌 B 分离到 85 个，分离率 15.2%，两种疑似病原菌的分离比例为
4.8︰1。此外，未长菌落和杂菌的 67 个，杂菌主要指细菌。
两种疑似病原分离物的致病性检测分老叶接种（2013 年 8 月）和新叶接种（2014 年 4 月）。结
果（表 2）发现，疑似病原物 A（图 1，C）接种在老叶时，有伤接种叶片的发病率为 87% ~ 100%，
无伤接种叶片的发病率为 83% ~ 100%；接种在新叶时，无论有伤接种还是无伤接种，叶片全部发病，
而且品种间没有差异。叶片接种疑似病原物 B（图 1，D）后也可发病，发病率为 57% ~ 90%。两病
原物接种后的叶片发病症状与田间发病症状相同。将疑似病原菌 A 和 B 有伤接种到健康新叶 2 d 后
的发病症状如图 1，E 和图 1，F。将发病叶片进行病原物再分离培养，得到的菌落与接种菌落表型
一致，因此，根据柯赫氏法则，确定病原物 A 和 B 均为芍药红斑病的致病菌。













图 1 芍药红斑病的发病症状及病原菌的形态特征
A：感病叶片；B：感病的茎；C：病原物 A 组菌落（菌株 F1）；D：病原物 B 组菌落（菌株 P-L3-1）；
E：病原物 A 接种 2 d 后的发病状况；F：病原物 B 接种 2 d 后的发病状况；G：病原物 A（链格孢菌）的分生孢子；
H：病原物 B（细极链格孢菌）的分生孢子梗及分生孢子。
Fig. 1 Field symptoms of infected plants and morphological characteristics of the pathogens causing peony red spot disease
A：Infected leaves；B：Infected stem；C：Colony of pathogen A（strain F1）；D：Colony of pathogen B（strain P-L3-1）；
E：Symptom 2 days after inoculation with pathogen A；F：Symptom 2 days after inoculation with pathogen B；
G：Conidia of the pathogen A（A. alternate）；H：Conidiophores and conidia of the pathogen B（A. tenuissima）.

2.3 菌落及病原菌形态特征
纯化后的菌落按其特征分为两组：病原物 A 组的菌落培养特征表现为菌落圆形生长，初期灰白
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色，后转为灰色至灰黑色，菌丝疏松，气生菌丝茂盛，菌落隆起，菌落背面灰褐色（图 1，C）；病
原物 B 组的菌落培养特征表现为不规则圆形，菌落初期白色，后转为灰色，菌丝致密，菌落隆起，
菌落背面黄色至黄褐色，呈现规则的轮纹，边缘颜色较浅（图 1，D）。供试菌株共产生两种分生孢
子，一为倒梨形、卵形或圆柱形，大小为（20.0 ~ 39.0）μm ×（8.0 ~ 14.5）μm，具纵横隔膜，有短
喙（图 1，G）；二为尖细长狭卵形，（37.0 ~ 73.0）μm ×（4.0 ~ 6.3）μm，具纵横隔膜，有细长柱状
喙（图 1，H）。综合菌落特征和分生孢子形态，初步鉴定两种病原菌分别为链格孢（Alternaria alternata）
和细极链格孢（A. tenuissima）。

表 2 芍药红斑病接种致病性测定
Table 2 Pathogenicity test of red spot disease on peony
有伤接种
Innoculation with
injury

无伤接种
Innoculation without
injury 病原菌
Fungi
接种时间
Innoculation
time
芍药品种
Peony cultivar
接种叶片数
Innoculated
leaf number 感病
Infected
致病率/%
Infection
percentage
感病
Infected
致病率/%
Infection
percentage
致病性
Pathogenicity
A 2013–08 春晓 Chunxiao 30 30 100 25 83.3 +++
粉玉奴 Fenyunu 30 29 96.7 30 100 +++
红艳争辉 Hongyan Zhenghui 30 27 90.0 26 86.7 ++
朱砂判 Zhushapan 30 26 86.7 30 100 +++
2014–04 晨曦 Chenxi 30 30 100 30 100 +++
春晓 Chunxiao 40 40 100 40 100 +++
大富贵 Dafugui 40 40 100 40 100 +++
粉玉奴 Fenyunu 40 40 100 40 100 +++
菱花晨浴 Linghua Chenyu 40 40 100 40 100 +++
红楼藏金 Honglou Cangjin 30 30 100 30 100 +++
红星满天 Hongxing Mantian 30 30 100 30 100 +++
奇花露霜 Qihua Lushuang 40 40 100 40 100 +++
巧玲 Qiaoling 40 40 100 40 100 +++
杨妃出浴 Yangfei Chuyu 40 40 100 40 100 +++

B 2013–08 春晓 Chunxiao 30 21 70.0 20 66.7 ++
粉玉奴 Fenyunu 30 19 63.3 17 56.7 +
红艳争辉 Hongyan Zhenghui 30 23 76.7 20 66.7 ++
朱砂判 Zhushapan 30 23 76.7 22 73.3 ++
2014–04 晨曦 Chenxi 30 25 83.3 25 83.3 ++
春晓 Chunxiao 30 23 76.7 21 70.0 ++
大富贵 Dafugui 30 21 70.0 21 70.0 ++
粉玉奴 Fenyunu 30 27 90.0 21 70.0 ++
菱花晨浴 Linghua Chenyu 30 25 83.3 23 76.7 ++
红楼藏金 Honglou Cangjin 30 23 76.7 23 76.7 ++
红星满天 Hongxing Mantian 30 23 76.7 23 76.7 ++
奇花露霜 Qihua Lushuang 30 27 90.0 26 86.7 ++
巧玲 Qiaoling 30 21 70.0 19 63.3 ++
杨妃出浴 Yangfei Chuyu 30 26 86.7 24 80.0 ++
注：“+++”平均致病率 90%以上，“++”平均致病率 60% ~ 90%，“+”平均致病率 30% ~ 60%。
Note：“+++”，“++”and“+”respectively mean that the average pathogenicity percentage was more than 90%，60%–90%，and 30%–60%.

2.4 病原菌的 rDNA-ITS 序列分析
两种病原菌分别以菌株 F1 和菌株 P-L3-1 的 DNA 为模板，采用通用引物 ITS1 和 ITS4 进行 PCR
扩增，分别获得长度为 545 和 528 bp 的 ITS 序列，其序列在 GenBank 登录号分别为 KR912224 和
KR912225。将所得序列在 NCBI 网站上与已知序列进行 blast 比对，其 5.8S rDNA 及其两侧的 ITS
区分别与序列号为 KF380822.1、HM467832.1 的同源性最高，均为 99%。KF380822.1 序列共 539 bp，
Li Li，Song Shu-xiang，Liu Hui-xiang，Guo Xian-feng.
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属于链格孢菌（A. alternata）；而 HM467832.1 序列共 544 bp，属于细极链格孢菌（A. tenuissima）。
进一步构建的系统进化树（图 2）可分为 4 大分支，其中链格孢属（Alternaria）为第一大分支，两
种供试菌株序列均紧密聚在其中，并且分别与登录号为 KJ002064.1、KP689210.1、KJ526174.1、
KF380822.1 及 JX867218.1、KP689164.1、FJ949086.1、HM467832.1 的序列聚合尤其紧密，远离该
属其他种，如 A. sesami 及另外两个属，枝孢属（Cladosporium）和黑星菌属（Venturia），充分说明
两个供试菌株的 ITS 序列属于链格孢属。
根据病原菌的形态鉴定、致病性测定和分子鉴定结果，山东省芍药红斑病的病原菌为链格孢菌
（A. alternata）和细极链格孢菌（A. tenuissima），其中链格孢菌占优势，占分离物总数的 72.9%，
是细极链格孢分离率的 4.8 倍。

图 2 基于 rDNA-ITS 序列构建的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences
3 讨论
植物病原菌鉴定的传统方法是采用显微形态学鉴定为主（陆家云，2001）。研究者认为，在接
近自然的培养条件下，链格孢属（Alternaria）真菌可根据菌落特征、产孢表型及分生孢子形态等开
展形态学鉴定（Simmons & Roberts，1993）。不过，众多研究报道亦指出，该属真菌的属级特征明
显，易于形态学鉴定，但种级特征变异较大，尤其是小孢子种形态特征易于受环境条件影响，因而
传统方法极易受分类者的分类知识及经验等人为影响，给种的形态鉴定造成很大困难（王洪凯 等，
2001；张天宇，2003；Sajeewa et al.，2011；曲文文 等，2012）。近年来，以 PCR 为基础的 rDNA-ITS
序列分析由于特异性强、可靠性高，目前在许多植物链格孢属真菌鉴定中得到成功应用，如王洪凯
等（2011）用 5.8S rDNA 及 ITS 区序列分析了链格孢的种级分类。形态特征与 rDNA-ITS 序列特征
相结合，已发展为当前许多植物病原菌分类和鉴定的常用手段。
本研究中从供试的 13 个芍药品种的感病叶片、茎和花瓣上分离到两种病原菌，经形态鉴定、
分子鉴定及致病性检测，确定其为链格孢（A. alternata）和细极链格孢（A. tenuissima），与红橘褐
斑病（陈昌胜 等，2011）、山茱萸褐斑病（牛小瑞 等，2014）和核桃顶端坏死病及黑斑病（曲文文
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山东省芍药红斑病病原菌鉴定.
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等，2012）等检测到的相应致病菌的形态一致，链格孢（A. alternata）形态特征也与蓝莹等（1984）
从芍药红斑病病叶上分离的链格孢菌形态一致，但其仅分离到 1 种病原菌。本研究中病样采自山东
省菏泽地区和泰安地区，芍药品种集中，种植规模大，其病害发生较之于南京市小量种植更具有代
表性，所以本研究结果表明，芍药红斑病可由链格孢（A. alternata）和细极链格孢（A. tenuissima）
两种病原菌引起，该鉴定结果为芍药红斑病的田间防治提供了重要参考。但是，两种致病菌的流行
规律、对防治药剂的敏感性乃至对野生芍药的致病性等仍需进行深入的研究。
此外，需要补充说明的是，芍药和牡丹是同属种，二者常同园栽植，且牡丹红斑病也是危害牡
丹植株的重要叶部病害，发病症状同芍药红斑病症状相似。不同于芍药红斑病病原菌，牡丹红斑病
的主要致病菌为枝孢霉属（Cladosporium spp.）（吴玉柱 等，2005；石良红 等，2014），链格孢（A.
alternata）和枝孢霉属（Cladosporium spp.）病菌均属于对寄主广适性菌种，多生于植物的枯死部分
或衰弱组织上（张天宇，2003），那么链格孢（A. alternata）、细极链格孢（A. tenuissima）与牡丹红
斑病之间、枝孢霉属（Cladosporium spp.）与芍药红斑病之间的关系到底如何，显然需要继续交叉
病样深入研究。

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