全 文 ：园艺学报，2016，43 (5)：841–852.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0735；http：//www. ahs. ac. cn 841
收稿日期：2015–12–11；修回日期：2016–04–29
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-28）；山东省自然科学基金项目（ZR2014CL024）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yinchengmiao@163.com；mzhiquan@sdau.edu.cn）
草酸青霉 A1 菌株的鉴定及对苹果 4 种镰孢病菌
的拮抗作用
张先富 1，相 立 1，王艳芳 2，王功帅 1，刘会香 3，孙庚午 3，沈 向 1，
陈学森 1，周 慧 4，尹承苗 1,*，毛志泉 1,*
（1 山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018；2 山东农业大学化学与材料科
学学院，山东泰安 271018；3 山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018；4 蓬莱市果树工作总站，山东蓬莱
265600）
摘 要：从连作条件下的平邑甜茶健康根系分离得到 1 株内生真菌 A1，通过形态学特征、培养特性
观察鉴定该菌属于青霉属，将其 ITS rDNA 序列和 β-tubulin 序列与 GenBank 中已知标准菌株的 ITS rDNA
序列和 β-tubulin 序列进行比对，并利用 MEGA5.05 软件构建青霉菌 A1 菌株进化树。结果表明，青霉菌
A1 与草酸青霉 Penicillium oxalicum（KF152942.1，KC344990.1）序列同源性最高，为 100%，最终将青
霉菌 A1 鉴定为草酸青霉 A1。在马铃薯培养基（PDA）和玉米粉培养基上分别将内生真菌 A1 与尖孢镰孢
菌、串珠镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌进行对峙试验，结果在 PDA 培养基上对菌丝生长抑制率分别
为 42.0%、74.0%、47.0%和 54.5%，拮抗系数达到Ⅱ级或Ⅰ级，在玉米粉培养基上菌丝生长抑制率分别为
60.5%、82.2%、68.4%和 53.4%，拮抗系数达到Ⅱ级或Ⅰ级，说明草酸青霉 A1 对 4 种苹果连作障碍病原
镰孢属真菌具有较好的抑制作用。平邑甜茶盆栽试验结果表明，与连作土对照相比，A1 菌肥显著促进了
连作平邑甜茶幼苗鲜样质量、干样质量的增加，分别增加 2.53 倍和 2.35 倍，说明草酸青霉 A1 菌肥能在
一定程度上减轻苹果连作障碍。使用实时荧光定量技术对土壤中的尖孢镰孢菌基因拷贝数进行检测，发
现 A1 菌肥处理的土壤中尖孢镰孢菌的基因拷贝数量大幅下降，说明草酸青霉菌 A1 可以抑制其生长。A1
菌株可作为防控苹果连作障碍的拮抗菌进一步研究。
关键词：苹果；腐皮镰孢菌；尖镰孢菌；串珠镰孢菌；层出镰孢菌；草酸青霉 A1 菌株；拮抗作用
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）05-0841-12

Identification of Penicillium oxalicum A1 Strain and Antagonistic Effects on
Four Species of Fusarium Pathogen of Apple
ZHANG Xian-fu1，XIANG Li1，WANG Yan-fang2，WANG Gong-shuai1，LIU Hui-xiang3，SUN Geng-wu3，
SHEN Xiang1，CHEN Xue-sen1，ZHOU Hui4，YIN Cheng-miao1,*，and MAO Zhi-quan1,*
（1College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop
Biology，Tai’an，Shandong 271018，China；2College of Chemistry and Material Science，Shandong Agricultural University，
Tai’an，Shandong 271018，China；3College of Plant Protection Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong
271018，China；4Fruit Trees Work Station of Penglai City，Penglai，Shandong 265600，China）

Zhang Xian-fu，Xiang Li，Wang Yan-fang，Wang Gong-shuai，Liu Hui-xiang，Sun Geng-wu，Shen Xiang，Chen Xue-sen，Zhou Hui，Yin Cheng-miao，
Mao Zhi-quan. Identification of Penicillium oxalicum A1 strain and antagonistic effects on four species of Fusarium pathogen of apple.
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Abstract：A strain of endophytic fungi A1 was isolated from the roots of Malus hupehensis Rehd.
seedlings by using dilution separation methods after surface disinfection and grinding，and was identified
as Penicillium oxalicum by observation of morphology，cultural characteristics compared the ITS rDNA
sequences and β-tubulin sequences with the known standard strains sequences that of GenBank，and the
MEGA5.05 software was used to construct the phylogenetic tree of the A1 strain. The similarity of the ITS
rDNA and β-tubulin sequences between A1 strain and Penicillium oxalicum（KF152942.1，KC344990.1）
were 100%，so it was finally identified as the nearest genetic relationship with Penicillium oxalicum. By
using a potato medium and a corn meal medium，endophytic fungi A1 was respectively confrontation test
with Fusarium oxysporum，F. moniliforme，F. proliferatum and F. solani. It could inhibit growth of hypha
of F. oxysporum，F. moniliforme，F. proliferatum and F. solani to a variable extent，and increased by
42.0%，74.0%，47.0% and 54.5% on the potato medium，and the coefficient of antagonism could be
reached or . Ⅱ Ⅰ Similarly，growth of hypha was increased by 60.5%，82.2%，68.4% and 53.4% and the
coefficient of antagonism could be reached or on the Ⅱ Ⅰ corn meal medium. That Penicillium oxalicum
A1 had better inhibitory effect on four kinds of Fusarium sp. of the apple replant disease. Pot experimental
results showed that fresh weight and dry weight were obviously increased by function of A1 manure，and
were 2.53 and 2.35 times respectively higher than the control，so A1 manure could reduce the apple replant
disease to a certain extent. At the same time soil F. oxysporum gene copy number was detected by using
real-time fluorescence quantitative technique and found that Penicillium oxalicum A1 could inhibit the
growth of F. oxysporum，and could be ulteriorly studied as a antagonism strain to control the apple replant
disease.
Key words：apple；Penicillium oxalicum A1；Fusarium oxysporum；Fusarium moniliforme；Fusarium
proliferatum；Fusarium solani；antagonism

中国老苹果园更新时普遍面临连作障碍问题（Manici et al.，2003；Mazzola & Manici，2012；
Liu et al.，2014）。有研究认为镰孢菌属真菌（Fusarium spp.）是引起苹果连作障碍的主要病原菌之
一（Kelderer et al.，2012；Ju et al.，2014）。van Schoor等（2009）研究发现在南非所有连作苹果园
土壤中有害真菌镰孢属、柱孢属以及腐霉属是引起连作障碍的主要原因。刘志（2013）研究认为，
造成中国环渤海湾地区苹果再植病的主要真菌病原是镰孢菌中的串珠镰孢菌、层出镰孢菌、腐皮镰
孢菌和尖孢镰孢菌。
轮作是目前防控苹果连作障碍效果最好的措施之一，缺点是耗时太长，一般轮作时间不能低于
3 年，生产中不易推广。而生物防治是利用有益菌抑制土壤中病原菌的数量或干扰病原菌对寄土植
物侵染的一种环保型防治方法。Shin 等（2006）研究认为，霉菌可产生大量生物活性成分并对病原
菌、植物线虫等的生长发育可能有不同程度的抑制作用，且青霉菌 Penicillium simplicissimum
IFM53375 中分得的 Penicillide（1 ~ 4）类化合物及其衍生物具有抗真菌活性作用，同时青霉菌分泌
的青霉素对根皮苷有降解作用（王娟，2009）。王芳等（2013）研究认为青霉菌对尖孢镰孢菌在营养
竞争、重寄生、抗生作用方面均具有较明显的抑制作用。李芳等（2005）研究认为淡紫拟青霉次生
代谢物质对尖孢镰孢菌的孢子萌发与菌落生长有明显的抑制作用，且淡紫拟青霉与镰孢菌活体间存
在明显的营养竞争作用（刘俊男，2012）。而在苹果连作障碍中生防青霉菌的相关研究少有报道。
本试验中从山东省泰安市山东农业大学国家苹果中心试验基地的连作平邑甜茶（Malus
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草酸青霉 A1 菌株的鉴定及对苹果 4 种镰孢病菌的拮抗作用.
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hupehensis Rehd.）健康根系内部分离筛选出 1 株具有生防作用的青霉菌株，在室内培养条件下研究
其对尖孢镰孢菌、串珠镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌的拮抗作用，盆栽试验条件下研究其菌肥
对连作平邑甜茶幼苗生长状况的影响以及对连作土壤中有害真菌尖孢镰孢菌的影响，为苹果连作障
碍的生物防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
连作平邑甜茶根系于 2014 年 10 月 25 日采集于山东泰安市山东农业大学南校区国家苹果中心
试验基地，随机挖取一些连作平邑甜茶的健康根系并带土置于无菌袋内带回实验室，4 ℃保存。于
山东农业大学园艺科学与工程学院苹果重茬微生物研究室和植物保护学院微生物资源研究室分离。
1.2 内生青霉菌的分离鉴定
1.2.1 分离纯化与形态学鉴定
马铃薯培养基（PDA)：去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，121 ℃
高压灭菌 20 min，待冷却至 45 ℃左右时，分别加入 2.5 mL 链霉素和 1.25 mL 青霉素，将培养基倒
入培养皿凝固。察氏培养基（CA)：硝酸钠 3 g，磷酸氢二钾 1 g，硫酸镁 0.5 g，氯化钾 0.5 g，硫酸
亚铁 0.01 g，蔗糖 30 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，121 ℃高压灭菌 20 min。内生真菌的分离纯
化参考吴婧波等（2013）和陈贤兴等（2003）的方法稍有改动。接种分离纯化后的内生青霉菌于马
铃薯 PDA、察氏 CA 培养基上，28 ℃培养 7 d，观察菌落培养特征；取少量菌体，于光学显微镜下
观察青霉菌菌丝，用棉蓝染色液染色观察分生孢子及孢子头类型，分生孢子梗、小梗等的特点。
1.2.2 分子生物学鉴定
将活化好的内生青霉菌用接种针挑至 PDA 培养基上 28 ℃恒温培养 7 d，无菌条件下刮取菌丝，
液氮多次研磨至粉末状破坏细胞壁，按照 Omega 公司 HP Fungal DNA Kit 试剂盒说明书步骤提取菌
丝 DNA，然后利用 ITS 引物和 β–微管蛋白基因引物进行 PCR 扩增，琼脂糖电泳检测，送样测序。
ITS 引物为 ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR
反应体系：12.5 μL Taq mix、模板 DNA 1.0 μL、上下游引物各 1.0 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR 反应条
件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 1 min，51 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，循环 34 次；72 ℃后
延伸 10 min，4 ℃保温。
β–微管蛋白基因引物为 Bt2a：GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC；Bt2b：ACCCTCAGTGTAG
TGACCCTTGGC。PCR 反应体系：12.5 μL Taq mix，模板 DNA 1.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，ddH2O
9.5 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 45 s，58 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 40 s，循环
30 次；72 ℃后延伸 10 min，4 ℃保温。
将测得的序列提交到 NCBI 的 GenBank，通过 BLAST 程序进行同源性比对，并利用 MEGA5.05
软件构建系统发育树。
1.3 生防青霉菌株的筛选
从连作平邑甜茶根系中共分得真菌 26 株，其中青霉菌 14 株。
初筛：用接种环分别挑取 14 株青霉菌的菌丝分别接种在 PDA 培养基上，重复 3 次，观察其在
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PDA 平板上的生长速度情况，初筛选出 5 株生长速度较快的青霉菌进行复筛试验。
复筛：将初筛选出的 5 株青霉菌分别与串珠、腐皮、尖孢和层出病原镰孢菌在 PDA、玉米粉培
养基上进行对峙试验，对峙试验操作步骤和计算拮抗系数。拮抗系数分级标准，根据徐文凤（2011）
和张丰（2013）的报道，分为 5 级：Ⅰ级，青霉菌占据平皿 100%，病原菌菌落萎缩；Ⅱ级，青霉
菌占据平皿大于 2/3，病原菌菌落边缘萎缩；Ⅲ级，青霉菌占据平皿大于 1/3，小于 2/3，病原菌停
止生长，菌落边缘凹陷；Ⅳ级，青霉菌占据平皿小于 1/3，病原菌停止生长；Ⅴ级，病原菌占据平
皿 100%。
试验所用 4 种病原菌串珠、腐皮、尖孢和层出镰孢菌是本课题组植保学院于金凤教授于 2013
年在环渤海湾地区的连作果园土壤及感病苹果植株上分离得到并保存的。
玉米粉培养基：玉米粉 10 g，水 20 mL，121 ℃高压灭菌 20 min，备用。
抑制率（%）=（对照镰孢菌落半径–与青霉菌对峙的镰孢菌落半径）/对照镰孢菌落半径 × 100。
1.4 平邑甜茶盆栽生长试验
盆栽试验在山东农业大学园艺科学与工程学院国家苹果工程实验中心以及作物生物学国家重
点实验室进行。2015 年 3 月将经过层积、催芽的平邑甜茶种子播种于育苗盘育苗，至幼苗长至第 3
片真叶时，取长势基本一致的幼苗移栽。每盆定植 3 株幼苗，缓苗期结束后间掉 1 株苗。盆中土壤
分为如下处理：连作土（对照 1），连作土经溴甲烷熏蒸（对照 2），A1 菌肥处理（T1），本试验中
筛选出的青霉菌 A1 菌株菌肥处理，菌肥载体处理，A1 孢子液处理，每处理 20 盆。正常肥水管理。
青霉菌 A1 菌株菌肥是由山东农业大学研制，每克菌肥含 3.57 × 109 孢子；剂型：粉末状。青霉菌
A1 菌株菌肥和菌肥载体的使用量均为土壤质量的 1%。
1.5 土壤中 A1 的抑制效果
运用实时荧光定量技术对土壤中的尖孢镰孢菌基因拷贝数进行检测，验证青霉菌 A1 在土壤中
对尖孢镰孢菌抑制效果，特异性引物及反应步骤参考尹承苗（2014）的方法。
利用 SPSS 19.0 中的 ANONA 对数据进行分析，邓肯氏新复极差法进行差异显著性测验。
2 结果与分析
2.1 内生青霉菌 A1 菌株的分离鉴定
2.1.1 筛选分离
通过根系研磨液的平板稀释涂布法，检测发现有 20 多个真菌种类，其中 14 个青霉菌株具有抑
菌活性，在其周围其他菌很难生长，分离纯化得到 14 株纯化的青霉菌株，通过初筛、复筛预试验，
最终确定内生青霉菌 A1 为供试拮抗菌株。
2.1.2 形态学特征
将内生青霉菌 A1 接种于 PDA 和 CA 培养基上 28 ℃培养 7 d，其形态特征如图 1 所示：在 PDA
平板上（图 1，A），菌落平坦或近于平坦，质地绒状，菌丝初为白色后逐渐变为暗绿色，分生孢子
易脱落，分生孢子结构大量产生，分生孢子面深橄榄绿色，渗出液缺乏，反面近于无色，可溶性色
素缺乏。在 CA 平板上（图 1，B），菌落平坦，菌落周围有一圈白色菌丝，质地绒状，菌丝体白色，
分生孢子易脱落，分生孢子结构大量产生，分生孢子面深绿色，渗出液缺乏，反面近于无色，可溶
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性色素缺乏。
显微镜下内生青霉菌 A1 的分生孢子结构如图 1，C 所示，分生孢子梗发生于基质，壁平滑，帚
状枝通常双轮生，偶有三轮生或单轮生；梗基每轮 2 ~ 3 个，13 ~ 20 μm × 3.2 ~ 3.7 μm，彼此通常较
紧贴；瓶梗每轮 5 ~ 8 个或更多，10 ~ 15 μm × 2.5 ~ 3.2 μm，幼龄时呈现瓶状或披针状，充分成熟时
近圆柱状，梗颈通常明显；分生孢子椭圆形，4.5 ~ 5.5 μm × 3.0 ~ 4.0 μm，壁平滑；分生孢子链圆柱
状。












图 1 A1 菌株的菌落形态和分生孢子结构观察
Fig. 1 The morphological observation and conidium structure observation of A1 strain

根据以上菌落培养和分生孢子特征，参照《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）和中国真菌志（孔
华忠和王龙，2007）进行对比分析，内生青霉菌 A1 符合青霉属的生长特性，可初步鉴定为半知菌
纲（Fungi Imperficti）壳霉目（Sphaeropsidales）杯霉科（Discellaceae）青霉属（Penicillium）。
2.1.3 分子鉴定
内生青霉菌 A1 的扩增产物电泳图见图 2，β-tubulin 和 rDNA-ITS 扩增序列大小均在 500 ~ 700 bp
之间；测序结果显示 β-tubulin 的全序列大小为 504 bp，rDNA-ITS 的全序列大小为 567 bp。该菌株
已于 2015 年 7 月 14 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.
11111。



图 2 基于 β-tubulin（左）和 rDNA-ITS（右）序列的 PCR 扩增产物电泳图
1 ~ 3：PCR 扩增产物；M1：100 bp DNA ladder；M2：Trans DNA markerⅠ。
Fig. 2 The electrophoregram of the β-tubulin（left）and rDNA-ITS（right）sequence of PCR product of A1 strain
1–3：PCR products；M1：100 bp DNA ladder；M2：Trans DNA markerⅠ.

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将 A1 菌株的基因序列与 GenBank 中相关序列 BLAST 比对，与已发表的相关青霉属（Penicillium
sp.）菌株的序列同源性为 100%。利用 MEGA5.05 软件构建以青霉属 rDNA-ITS 序列为基础的系统
发育树（图 3），A1 菌株与草酸青霉（Penicillium oxalicum，KF152942.1）的进化距离最近。利用
MEGA5.05 软件构建以青霉属 β-tubulin 序列为基础的系统发育树（图 4），A1 菌株与草酸青霉
（Penicillium oxalicum，KC344990.1）的进化距离最近。
结合形态学特征和分生孢子结构特征，最终将内生青霉菌 A1 鉴定为草酸青霉（Penicillium
oxalicum）。














图 3 A1 菌株基于青霉属 rDNA-ITS 序列的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of A1 strain based on Penicillium rDNA-ITS sequence














图 4 A1 菌株基于青霉属 β-tubulin 序列的系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic tree of A1 strain based on Penicillium β-tubulin sequence

2.2 A1 菌株的平板抑菌作用
拮抗菌的一大特点就是生长速度快，能在短时间内迅速占领生长空间，与病原菌进行营养竞争。
将 A1 菌丝接种在 PDA 平板上，28 ℃恒温培养（重复 3 次）观察到菌落生长速度特别快，3 d 内迅
速占满整个平板，产生大量孢子，孢子易脱落，说明 A1 菌具有拮抗菌生长快的特点。因此有必要
与镰孢属病原菌进行对峙试验进一步研究 A1 菌株的拮抗能力。
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对峙培养结果表明，A1 菌株对 4 种病原镰孢菌的生长都有一定的抑制作用（图 5，图 6，表 1）。
对串珠镰孢菌的抑制率较高，在玉米粉培养基上抑制率达到 80%以上，在 PDA 培养基上的抑
制率达 74%。A1 菌株和串珠镰孢菌接入培养皿后，分生孢子大量产生，迅速将串珠镰孢菌包围，
与串珠镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌带，A1 的菌丝在两者接触后继续生长，直到菌丝长满全皿，
拮抗系数为Ⅰ级。
A1 菌株对腐皮镰孢菌也存在一定的抑制作用，在 PDA 和玉米粉培养基上抑制率均达到 50%以
上，拮抗系数为Ⅱ级。


图 5 A1 菌株与 4 种镰孢菌的对峙试验（PDA 培养基）
Fig. 5 The antagonistic experiment between A1 strain and four kinds of Fusarium（PDA medium）


图 6 A1 菌株与 4 种镰孢菌的对峙试验（玉米粉培养基）
Fig. 6 The antagonistic experiment between A1 strain and four kinds of Fusarium（Corn meal medium）
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图 7 不同处理对尖孢镰孢菌基因拷贝数的影响
Fig. 7 Effect of different treatments on the copy number of
Fusarium oxysporum
表 1 A1 菌株对 4 种镰孢菌的抑制率
Table 1 The inhibition rate of A1 strain on the four kinds of Fusarium
培养基 Culture medium 病原真菌 Pathogenic fungi 抑制率/% The inhibition rate 拮抗系数 Antagonism coefficient
PDA Potato dextrose agar 腐皮镰孢菌 Fusarium solani 54.5 cd Ⅱ
层出镰孢菌 Fusarium proliferatum 47.0 ef Ⅱ
串珠镰孢菌 Fusarium moniliforme 74.0 b Ⅰ
尖孢镰孢菌 Fusarium oxysporum 42.0 f Ⅱ
玉米粉 Corn meal 腐皮镰孢菌 Fusarium solani 53.4 de Ⅱ
层出镰孢菌 Fusarium proliferatum 68.4 b Ⅰ
串珠镰孢菌 Fusarium moniliforme 82.2 a Ⅰ
尖孢镰孢菌 Fusarium oxysporum 60.5 c Ⅱ
P  0.05.

A1 菌株在玉米粉培养基上对层出镰孢菌抑制率较高，达到了 68.4%，拮抗系数Ⅰ级。在 PDA
培养基上对层出镰孢菌的抑制率达到了 47%，拮抗系数Ⅱ级。A1 菌与层出镰孢菌的菌落交界处未产
生抑菌带，A1 的菌丝在两者接触后继续生长，占领了层出镰孢菌的大部分生长空间。
A1 菌株在玉米粉培养基上对尖孢镰孢菌抑制率较高，达到了 60.5%，拮抗系数Ⅰ级；在 PDA
培养基上对尖孢镰孢菌的抑制率为 42%，拮抗系数Ⅱ级。A1 与尖孢镰孢菌的菌落交界处未产生抑菌
带，A1 的菌丝在两者接触后继续生长，占领尖孢镰孢菌的大部分生长空间。
2.3 A1 菌株对平邑甜茶幼苗的促进生长作用
由表 2 可以看出，与连作土处理（对照 1）相比，A1 菌肥显著促进了连作平邑甜茶幼苗鲜质量、
干质量的增加，分别增加 2.53 倍和 2.35 倍，但是 A1 孢子液处理与连作土对照没有显著性差异。A1
菌肥和 A1 孢子液均促进了连作平邑甜茶幼苗株高、地径的增加，株高分别比对照增加了 97.8%、
35.5%，地径分别比对照增加了 44.4%和 24.4%，但是 A1 菌肥、A1 孢子液处理的连作平邑甜茶幼苗
的长势均未超过溴甲烷处理（对照 2），且 A1 菌肥处理效果优于 A1 孢子液处理。

表 2 A1 菌肥对平邑甜茶幼苗生物量的影响
Table 2 Effects of different treatments on the biomass of Malus hupehensis Rehd. seedling
处理 Treatment 株高/cm Plant height 地径/mm Basal diameter 鲜质量/g Fresh weight 干质量/g Dry weight
对照 1 Control 1 27.30 ± 4.93 d 4.59 ± 0.36 d 15.78 ± 1.71 c 6.94 ± 1.43 c
对照 2 Control 2 67.00 ± 4.36 a 9.57 ± 0.48 a 64.19 ± 9.34 a 27.37 ± 3.72 a
A1 菌肥 A1 manure 54.00 ± 4.00 b 6.63 ± 0.51 b 39.90 ± 7.15 b 16.30 ± 2.44 b
菌肥载体 Manure carrier 40.70 ± 4.04 c 5.98 ± 0.10 bc 34.81 ± 5.08 b 9.82 ± 1.60 c
A1 孢子液 A1 spore fluid 37.00 ± 1.00 c 5.71 ± 0.35 c 18.20 ± 2.94 c 7.33 ± 0.77 c
2.4 土壤中 A1 菌株对镰孢菌的抑制效果
从图 7 可以看出，与连作土（对照 1）相
比，不同处理均使尖孢镰孢菌的基因拷贝数显
著降低，且以溴甲烷熏蒸和 A1 菌肥处理降低
较显著，分别比对照 1 降低了 94.4%和 90.7%。
A1 菌肥处理后土壤中尖孢镰孢菌的拷贝数大
幅下降，说明 A1 菌肥施入土壤后草酸青霉 A1
大量繁殖，占据了大部分营养空间使尖孢镰孢
菌的生长繁殖受到抑制，说明草酸青霉 A1 在
土壤中对尖孢镰孢菌也有很好的抑制效果。
张先富，相 立，王艳芳，王功帅，刘会香，孙庚午，沈 向，陈学森，周 慧，尹承苗，毛志泉.
草酸青霉 A1 菌株的鉴定及对苹果 4 种镰孢病菌的拮抗作用.
园艺学报，2016，43 (5)：841–852. 849

3 讨论
连作障碍的发生与根际微生态系统的失衡密切相关，连作可导致微生物群落结构趋向简单化，
有益微生物菌群减少，有害病原菌群增加。长期连作可导致根际微生物种群结构失衡，降低有益微
生物数量，增加土传病害菌数量，土传病害加重从而导致作物减产（刘建国 等，2009；Li et al.，
2010；张重义 等，2010；Kelderer et al.，2012；Urashima et al.，2012；Yang et al.，2012；Yim et al.，
2013；Zhang et al.，2014）。已报道与苹果连作障碍有关的主要致病真菌属有柱孢属、镰孢属、丝核
属、疫霉属和腐霉属等。不同地区、不同果园连作土壤中的致病真菌不同，Manici 等（2013）调查
发现柱孢属真菌（Cylindrocarpon）是德国、澳大利亚和意大利等欧洲连作苹果园中的主要致病真菌。
徐文凤（2011）在环渤海湾地区连作苹果园土壤中分离到大量的串珠镰孢菌、尖孢镰孢菌、腐皮镰
孢菌和层出镰孢菌，并进行盆栽试验发现 4 种镰孢属真菌对平邑甜茶幼苗具有强致病性。
目前，综合防控苹果连作障碍的措施主要有客土、施用有机物料、轮作、选择抗性砧木、土壤
熏蒸等可有效地减轻苹果连作障碍，而在生产上，客土成本高不易采用。研究发现向连作土壤中添
加生物炭（Wang et al.，2014）、有机物料发酵流体（Zhang et al.，2012，尹承苗 等，2013，2014）、
饼肥（Mazzola & Manici，2012）、甲壳素（王艳芳 等，2015）等有机肥可减轻连作幼树的障碍，
但这些措施往往存在一些因素限制其在生产中的应用，如地区取材不便、缺乏水资源等。有研究认
为轮作搭配选择抗性砧木等栽培措施可有效地防控苹果连作障碍（吕毅 等，2014），缺点是耗时太
长，一般轮作时间不能低于 3 年，生产中也不易推广。土壤化学熏蒸仍是最有效地防控苹果连作障
碍的措施，溴甲烷和氯化苦可以有效控制土壤中的真菌（王娟，2009），但因其对环境和人身的有害
性而逐渐限制使用。因此，寻找一种高效、低毒、环保型的生物防治防控措施非常重要，而将青霉
菌用于苹果连作障碍生物防控的研究报道较少。青霉菌种类很多，分布很广，广泛存在于自然界，
可产生大量生物活性成分并对病原菌，植物线虫等的生长发育可能有不同程度的抑制作用。本试验
中从平邑甜茶根系分离筛选得到一株青霉菌，通过形态学观察、分子生物学等手段鉴定为草酸青霉
（Penicillium oxalicum）。该青霉菌在室内试验条件下对尖孢、串珠、层出和腐皮镰孢菌均有较强的
抑制作用。因此，该青霉菌可作为拮抗菌进一步研究其在苹果连作障碍的生物防控作用。
关于微生物菌肥防治连作障碍或者土传病害，前人进行了很多探索，周晓芬和杨军芳（2004）
研究发现施用 EM 菌剂可以有效防治大棚黄瓜的连作障碍；施用菌根真菌或 B3512 为功能菌的菌肥
可以防治草莓的连作障碍（解灵军 等，2009）；使用微生物菌剂 MB-97，能够有效的减轻大豆连作
障碍（胡春江 等，2002）。郝玉敏等（2012）的研究表明，内生拟茎点霉 B3 菌剂与有机肥配施可
以改善连作草莓土壤微生物区系，提高土壤酶活性，增强草莓抗病能力，增加草莓产量，是一种有
效缓解草莓连作障碍的方法。本研究中在盆栽试验条件下，将所得青霉菌制成菌肥施入连作土壤中，
研究发现青霉菌肥处理能显著促进平邑甜茶幼苗的生物量的增加，且对连作土壤中的尖孢镰孢菌有
很好的抑制作用，说明草酸青霉 A1 菌肥能在一定程度上减轻苹果连作障碍。
综上所述，草酸青霉 A1 在室内试验条件下对尖孢、串珠、层出和腐皮镰孢菌有很好的拮抗作
用，草酸青霉 A1 菌肥在盆栽试验条件下能显著促进平邑甜茶幼苗的生长，且对连作土壤中有害真
菌尖孢镰孢菌有很好的抑制作用，说明草酸青霉 A1 菌肥能在一定程度上减轻苹果连作障碍。但草
酸青霉 A1 菌肥在盆栽、田间试验条件下对连作土壤中有害真菌串珠、腐皮和层出镰孢菌的影响仍
需进一步研究，且连作土壤中的病原菌与草酸青霉 A1 之间的作用方式等方面还需要进一步探讨。

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《Horticultural Plant Journal》
（《园艺学报》英文版）征稿

《园艺学报》英文版《Horticultural Plant Journal》由中国科学技术协会主管，中国园艺学会、中国农业科学院
蔬菜花卉研究所和中国农业科学技术出版社共同主办，于 2015 年 7 月创刊，国内统一连续出版物编号 CN10-1305/S，
国际标准连续出版物编号 ISSN 2095-9885，Online ISSN 2468-0141，双月刊，大 16 开，与国际出版商 Elsvier 合作，
在 ScienceDirect 网络出版平台实现全文开放存取（主页网址 http://www.journals.elsevier.com/horticultural-plant-journal/）。
办刊宗旨：准确、全面、及时地报道园艺学科领域重大研究成果和科研进展，反映学科研究水平和发展动向，
为学术交流服务，为促进学科发展作贡献。
刊载范围：有关园艺作物遗传学、基因组学、育种学、栽培学、园艺作物的起源及驯化、生物技术、生物化学、
生理学和细胞与分子生物学等原创性学术论文、研究报告、简报及专题综述等。
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征 稿