全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（6）：1207–1217 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–11–26；修回日期：2014–04–28
基金项目：国家自然科学基金项目（31101584）；国家重点基础研究发展计划（‘973’）项目（2009CB19001）；国家现代农业产业技术
体系建设专项资金项目（CARS-25）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：jiangwj@mail.caas.net.cn）
黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体
制备
王 燕*，杨学勇*，刘晓林，张晓孟，余宏军，蒋卫杰**
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：以黄瓜果实总 RNA 为模板，通过 RT-PCR 获得了动蛋白基因 CsKF1 和 CsKF2 的 cDNA 序
列，进行测序，构建 T-easy 载体。SMART 在线预测 CsKF1 和 CsKF2 均含有动蛋白（Kinesin）约 340 个
氨基酸残基的马达区保守序列（moter domain）。体外表达蛋白的马达区和非马达区，将带有 His 标签的
CsKF1-N、CsKF2-C、CsKF1-M、CsKF2-M 融合蛋白通过 E. coli BL21（DE3）表达，摸索不同诱导条件
下目的蛋白的表达和纯化。其中 His-CsKF1-N、His-CsKF2-C、His-CsKF1-M 原核表达蛋白的分子量分别
为 25、30 和 40 kD，均以 0.1 mmol · L-1 IPTG，22 ℃ 6 h 诱导表达效果最好。His-CsKF2-M 原核表达蛋
白的分子量约 38 kD，以 18 ℃ 8 h 诱导表达效果最好。融合蛋白 His-CsKF1-N 和 His-CsKF2-C 经过亲和
纯化后作为抗原，通过 5 轮免疫注射兔子后，取心脏血作为抗血清，通过 AminoLink Plus kit 试剂盒亲和
纯化得到多克隆抗体 anti-CsKF1-N 和 anti-CsKF2-C。经过 Western blot 分析表明多克隆抗体具有特异性，
可与抗原特异结合。
关键词：黄瓜；果实；动蛋白；肽段；原核表达
中图分类号：S 642.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1207-11

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Kinesin
Peptide Segment from Cucumber
WANG Yan*，YANG Xue-yong*，LIU Xiao-lin，ZHANG Xiao-meng，YU Hong-jun，and JIANG Wei-jie**
（Institute of Vegetable and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：Using the total RNA of cucumber（Cucumis sativus L.）fruits as the template，we cloned
two novel Kinesin genes CsKF1 and CsKF2 by RT-PCR. The results from deduced protein sequence
analysis indicated that both CsKF1 and CsKF2 contain moter domain of kinesin family. For protein
expression in vitro，the coding regions for KF1-N，KF2-C，KF1-motor and KF2-motor were amplified by
PCR and inserted into either the pET28a vector or the pET30a vector and then transformed into E. coli
strain BL21（DE3）. SDS-PAGE analysis results showed that the recombinant plasmid His-CsKF1-N and
His-CsKF1-N，His-CsKF2-C，His-CsKF1-M could be expressed a 25 kD，30 kD，40 kD molecule mass

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of fusion protein with 0.1 mmol · L-1 isopropyl thiogalactoside for 6 h at 22 ℃. But His-CsKF2-M could
be expressed a 38 kD molecule mass of fusion protein with 0.1 mmol · L-1 isopropyl thiogalactoside for 8 h
at 18 ℃. The His-tagged fusion proteins were purified using a Ni2+-chelating Sepharose Fast Flow
（Amersham Biosciences）column. Polyclonal anti-CsKF1-N，anti-CsKF2-C antibodies were raised in
rabbits using the purified His-CsKF1-N and His-CsKF2-C protein as the antigens. Antiserum was then
affinity purified using the AminoLink Plus kit with immobilized antigens according to the manufacturer’s
instructions. Western blot analysis show that the polyclonal antibodies could specifically identify the
corresponding antigen peptides His-CsKF1-N，His-CsKF2-C.
Key words：cucumber；fruit；Kinesin；peptide segment；prokaryotic expression

大多数植物的果实发育分为 3 个时期：子房发育、细胞分裂、细胞膨大（Gillaspy et al.，1993）。
黄瓜（Cucumis sativus L.）果实在前 2 周生长中经过快速细胞分裂和细胞膨大，质量增加了 200 多
倍（Marcelis & Hofmaneijer，1993；Boonkorkaew et al.，2008；Fu et al.，2008，2010）。黄瓜采收一
般在果实发育前期（Ando et al.，2012），因此，早期的细胞快速分裂和膨大对于果实产量至关重要。
目前，很多研究都关注于果实成熟期和采后生理，而对果实早期发育机理，尤其果实早期的细胞分
裂和膨大机理尚不清楚。
动蛋白是首先在动物神经细胞中发现的一类依赖于微管的马达蛋白（Vale et al.，1985），在细胞
有丝分裂、减数分裂、维持细胞形态和细胞器的运输方面都发挥着重要作用（Lee & Liu，2004；Lu
et al.，2005；Vanstraelen et al.，2006；Hirokawa et al.，2009；Li et al.，2011；Zhou et al.，2011）。
在植物中，已有报道的动蛋白 ATK1、ATK5、AtKRP125c、AtPAKRP1 和 AtKINESIN-13A 都以依
赖于微管的方式参与了细胞分裂和膨大（Lee & Liu，2000；Chen et al.，2002；Ambrose & Cyr，2007；
Bannigan et al.，2007）。黄瓜果实发育早期细胞分裂和细胞膨大有其独到的特点，例如其分裂和膨
大的速度极快，然而，在黄瓜果实发育早期是否有动蛋白的参与？又是有哪些特异动蛋白参与调控，
目前尚未可知。
目前关于动蛋白在果实发育早期细胞快速彭大和快速分裂中的作用尚未见报道，黄瓜是果实早
期发育研究的典型物种，所以选择黄瓜作为研究对象。关于黄瓜中动蛋白特异肽段的原核表达和多
克隆抗体制备的研究目前也未见报道。本试验中找到了两个在黄瓜果实发育早期特异表达的动蛋白，
通过对这两个基因进行克隆，经过多次原核表达、纯化以及诱导条件的摸索和优化，得到了高效表
达且纯度较高的蛋白特异肽段，最终得到特异识别目的蛋白的抗体，为其在黄瓜果实细胞分裂和细
胞膨大过程中的表达、定位和功能研究奠定了重要基础，也为研究黄瓜果实早期发育的分子机理提
供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所无土栽培温室内进行，黄瓜（Cucumis sativus L.）‘9930’
由中国农业科学院蔬菜花卉研究所顾兴芳和黄三文老师提供。2011 年 1 月 10 日播种于穴盘，1 月下
旬定植。取健康植株选第 5 节位以上果实组织液氮速冻，–80 ℃保存。
大肠杆菌菌株 DE3（BL21）及质粒 pET28a(+)和 pET30a(+)为本实验室保存。
质粒小量提取试剂盒、DNA 片段回收试剂盒购自 QIAGEN 公司。LA Taq 聚合酶、T4 DNA 连
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接酶、dNTPs、DNA Marker、限制性内切酶等均购自 TaKaRa 公司。pGEM T-easy 购自 Promega 公
司。反转录试剂盒购自 Fermentas 公司。引物合成和测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。
1.2 CsKF1 和 CsKF2 特异肽段的原核表达载体构建
以黄瓜果实总RNA为模板，通过RT-PCR获得了动蛋白基因CsKF1 和CsKF2 的 cDNA序列，
进行测序，构建T-easy载体（Yang et al.，2013）。对这两个动蛋白二级结构进行预测，决定CsKF1
原核表达的特异肽段为 5′端的 1 ~ 504 bp（KF1-N），马达区为 504 ~ 1 497 bp（KF1-M）；而CsKF2
原核表达的特异肽段为 5′端的 1 ~ 591 bp（KF2-C），马达区为 315 ~ 1 356 bp（KF2-M），分别设计
特异引物如下。KF1-N-F：GAATTCATGAATGGAATGGGGAGA；KF1-N-B：GTCGACTCAAGAGT
TTGCCCTCTCT；KF1-M-F：GGATCCATGGTTGCCAAGATCAAAG；KF1-M-B：CTCGAGTCAGAC
ATTATTTCCTTTTGAAAG；KF2-C-F：GAATCCATGATAAGAGCAAATGCCAAC；KF2-C-B：GTCG
ACTCAAAGATCGTCTACGTGGTT；KF2-M-F：GGTACCATGGATCCACCCATCAAG；KF2-M-B：
CTCGAGTCATTCATTTATGATTGGCTGA。
以连接有 CsKF1 全长 CDS 的 T-vector 为模板，PCR 扩增相应 CsKF1 5′端序列和马达区序列，
并在序列两端分别引入 SalⅠ和 EcoRⅠ酶切位点。PCR 回收产物、原核表达载体 pET28a(+)经
SalⅠ和 EcoRⅠ双酶切消化后，通过 T4 DNA Ligase 将 KF1-N 和 KF1-M 连接到 pET28a(+)上。挑取
单菌落进行 PCR 和双酶切鉴定，并测序确认序列正确。构建好的载体定名为 pET28a-CsKF1-N 和
pET28a-CsKF1-M。
以连接有 CsKF2 全长 CDS 的 T-vector 为模板，PCR 扩增相应 CsKF2 5′端序列和马达区序列，
并在序列两端分别引入 KpnⅠ和 XhoⅠ酶切位点。PCR 回收产物、原核表达载体 pET30a(+)经
KpnⅠ和 XhoⅠ双酶切消化后，通过 T4 DNA Ligase 将 KF2-C 和 KF2-M 连接到 pET30a(+)上。挑取
单菌落进行 PCR 和双酶切鉴定，并测序确认序列正确。构建好的载体定名为 pET30a-CsKF2-C 和
pET30a-CsKF2-M。
1.3 序列分析
通过 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在线进行基序（motif）和结构域（domain）预
测。采用 DNAman 和 Mega5.0 软件进行序列比对和进化树构建。
1.4 融合蛋白的诱导表达和 SDS-PAGE 电泳分析
1.4.1 重组细胞培养
挑取含有重组质粒 pET28a-CsKF1-N，pET28a-CsKF1-M，pET30a-CsKF2-C，pET30a-CsKF2-M
的大肠杆菌 BL21（DE3）单菌落接种到含有 50 µg · mL-1 卡那霉素的 LB 液体培养基中，37 ℃振荡
培养过夜。次日将过夜培养物以 1︰100 的比例转接到 25 mL 含 50 µg · mL-1 卡那霉素的 LB 液体培
养基中，37 ℃振荡培养约 2.5 h 至 OD600 0.6 ~ 0.8 时取少量菌液离心后用 1× SDS 制样（诱导前样），
其余菌液加入 IPTG 至终浓度 0.1 mmol · L-1。
1.4.2 诱导条件的筛选
以 200 r · min-1 转速继续培养细胞，诱导条件分别设为 18 ℃ 6 h、18 ℃ 8 h、22 ℃ 6 h、22 ℃ 8 h。
重复 3 次。最终获得的目的蛋白产物经过 SDS-PAGE 检测后，确定最佳诱导条件。
1.4.3 融合蛋白在原核细胞中的诱导表达与纯化
将上述不同诱导条件下得到的菌液，于 4 ℃，5 000 r · min-1 离心 10 min，弃上清液，收集菌体
后用 M 端裂解缓冲液（0.1 mol · L-1 PIPES，pH 6.9；1 mmol · L-1 MgCl2，2 mmol · L-1 EGTA，10%
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甘油）和 N/C 端裂解缓冲液（25 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 7.5；150 mmol · L-1 NaCl，10%甘油），用
移液器轻轻吸打使菌体充分悬起，相同条件下离心，收集菌体沉淀–80 ℃冻存或继续进行破碎纯化。
加入裂解缓冲液用移液枪将菌体充分悬起并加入PMSF至1 mmol · L-1，冰浴下进行超声波破碎细胞，
每次破碎 20 s，期间停止 1 min，10 次左右（破碎时间与菌体体积和超声破碎仪功率有关）。超声破
碎后取 15 µL 菌液加入 5 µL 4× SDS 样品缓冲液制样（记作：诱导后样），以下制样方法相同。细胞
破碎完成后，4 ℃，12 000× g 离心 30 min，取上清液（含目标蛋白的细菌可溶性总蛋白提取液）制
样（记作：上清样），沉淀用裂解缓冲液重悬后制样（记作：沉淀样），其余上清液上镍柱进行纯化。
尽量使样品缓慢通过柱床，将穿柱液重复上样 1 次，收集穿柱液 15 µL 加入 5 µL 4× SDS 制样（记
作：穿柱样）。随后用 6 ~ 8 倍体积的裂解缓冲液洗去大多数的杂蛋白，再用 6 ~ 8 倍体积的含有 100
mmol · L-1 咪唑的清洗缓冲液洗涤柱床 1 次，取洗涤后流出液体 15 µL 加入 5 µL 4× SDS 制样（记作：
洗涤样）。最后用含有 300 mmol · L-1 咪唑的洗脱缓冲液洗脱 3 次，收集第 1、2、3 次洗脱液体制样
（分别记作：洗脱样 1、2、3）。
1.4.4 SDS-PAGE 电泳
取 20 µL 已经加入了 SDS 缓冲液的蛋白样品，沸水中加热 3 ~ 5 min，12 000× g 离心 2 min，取
上清液点样。12.5% SDS-PAGE 电泳检测，比较结果确定适宜诱导条件。
1.5 His-CsKF1-N 和 His-CsKF2-C 大量诱导表达与纯化
适宜诱导条件确定后，用 500 mL LB（含 50 µg · mL-1 卡那霉素）进行菌液大量诱导 His-CsKF1-N，
菌体离心后用裂解缓冲液充分悬浮并加入 PMSF 至 1 mmol · L-1，TAE 至 1 mmol · L-1，溶菌酶至 2
mmol · L-1，然后置于冰上超声破碎细胞。细胞破碎完成后 4 ℃，12 000× g 离心 30 min，取上清液
上镍柱进行纯化。镍柱用 5 ~ 10 倍柱体积裂解缓冲液充分平衡后上样，随后用 6 ~ 8 倍体积的裂解
缓冲液洗去大多数的杂蛋白，再用 6 ~ 8 倍体积的含有 100 mmol · L-1 咪唑的清洗缓冲液洗涤 1 次，
最后用 5 ~ 10 mL 含有 300 mmol · L-1 咪唑的裂解缓冲液，按每个离心管收集 500 µL 进行分部收集，
标记为样品 1、样品 2、……样品 7，各取 15 µL，加入 5 µL 4× SDS 制样检测。His-CsKF2-C 是以包
涵体形式存在，与 His-CsKF1-N 纯化方法不同，在细胞破碎离心后，在沉淀中加入裂解缓冲液并加
入 triton（2%）、PMSF 进行充分重悬，离心后留上清液。获得的目的蛋白产物经过 SDS-PAGE 检测，
用 Bio-Rad 蛋白浓度测定试剂（Bio-Rad protein dye reagent）进行测定后用于活性分析。
1.6 多克隆抗体制备及纯化
将纯化的抗原蛋白送中国科学院遗传研究所实验动物中心制备多克隆抗体，对兔子共免疫 5 次
后取血清测效价，最后取心脏血得到抗血清。多克隆抗体的纯化使用 PIERCE 公司的 Amino Link Plus
Immobilization Kit 进行，具体纯化步骤参见说明书。
1.7 Western blot 分析
进行 SDS-PAGE，使用半干式转移电泳槽装置将纯化后的原核表达产物 His-CsKF1-N 和
His-CsKF2-C 从 SDS-PAGE 凝胶电转移到硝酸纤维素膜（NC）上。转移后的 NC 膜用丽春红染色，
做好标记后，在含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液（50 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol · L-1 NaCl，
0.05% Tween 20 中室温封闭 1 h 后，TBST 洗涤 10 min，加入用封闭液制备的纯化抗体 anti-CsKF1-N
和 anti-CsKF2-C（稀释度 1︰2 000），4 ℃孵育过夜，用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。用碱磷酶标
记的羊抗兔抗体为二抗（稀释度 1︰5 000）室温孵育 1 h，用 TBST 洗膜 3 × 10 min 后，加入 10 mL AP
反应缓冲液，先加入 15 µL NBT 充分混匀，再加入 10 µL BCIP，混匀约 5 min 左右可见条带。根据
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条带的位置是否符合预期 CsKF1-N 和 CsKF2-C 的大小从而判断抗体的特异性。
2 结果与分析
2.1 黄瓜果实动蛋白基因 CsKF1 和 CsKF2 cDNA 全长的获得
以黄瓜果实总 RNA 反转录 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。扩增得到 CsKF1 和 CsKF2 的基因编
码序列（CDS）分别为 2 058 bp 和 3 420 bp。扩增产物经纯化后克隆到 pGEM T-easy 载体上（Yang et
al.，2013）。测序结果经过 DNAman 进行分析比对，表明所克隆的 CsKF1 和 CsKF2 基因编码序列
与黄瓜基因组数据库中所登录的 Csa7G446860（2 058 bp）和 Csa3G062600（3 420 bp）编码序列完
全相同。
2.2 序列分析
CsKF1 的 CDS 序列为 2 058 bp，推导出氨基酸残基为 686 aa，对该蛋白结构域进行分析（图 1），
动蛋白 CsKF1 的保守马达区（kinesin motor domain）位于总蛋白 168 ~ 499 aa 区域（灰色区域），ATP
结合位点位于马达区内（178 ~ 179 aa，261 ~ 268 aa）。CsKF2 的 CDS 序列为 3 420 bp，推导出氨基
酸残基为 1 140 aa，CsKF2 动蛋白保守马达区位于总蛋白 106 ~ 442 aa 区域（灰色区域），ATP 结合
位点位于马达区内（115 ~ 116 aa，183 ~ 190 aa）。


图 1 CsKF1 和 CsKF2 的氨基酸序列
Fig. 1 The deduced amino acid sequence of CsKF1 and CsKF2

将拟南芥 33 个动蛋白氨基酸序列与 CsKF1 和 CsKF2 进行同源性分析，从进化树（图 2）可以
看出，CsKF1 与拟南芥动蛋白 13 家族动蛋白的氨基酸序列同源性达到 73%，CsKF2 与拟南芥动蛋
白 12 家族动蛋白的氨基酸序列同源性达到 92%。
2.3 黄瓜果实动蛋白基因原核表达载体的构建
应用 PCR 方法扩增获得 KF1-N（504 bp），KF1-M（1 002 bp）基因片段（图 3，A、B），经过
内切酶、连接酶将其插入 pET-28a(+)载体中，将 pET28a-CsKF1-N，pET28a-CsKF1-M，经EcoRⅠ/SacⅠ
双酶切鉴定（图 3，C）。同样将扩增获得的 KF2-C（594 bp），KF2-M（1 044 bp）基因片段（图 3，
A、B）经过内切酶、连接酶将其插入 pET-30a(+)载体中，获得的 pET30a-CsKF2-C，pET30a-CsKF2-M
进行 KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定（图 3，C）。测序证实重组质粒的外源基因插入正确。
2.4 黄瓜动蛋白马达区在原核细胞中的诱导表达与纯化
将重组质粒 pET28a-CsKF1-M 质粒转化至大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞内。分别在 18 6 ℃
h、18 8 h℃ 、22 6 h℃ 、22 8 h℃ 几种不同的条件下诱导，与诱导前对照相比，与预测分子量相当
的约 40 kD 的 His-CsKF1-M 蛋白被大量诱导表达（图 4，A），4 个条件相比较而言，22 6 h℃ 诱导
的蛋白浓度明显比其他 3 个条件下的高，杂带也最少，因此将该条件设为大量诱导的适宜条件。
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图 2 CsKF1 和 CsKF2 与拟南芥动蛋白家族氨基酸序列同源性进化分析
Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino acid sequences homolog
of CsKF1 and CsKF2 with Arabidopsis Kinesin family


图 3 特异肽段的 PCR（A、B）和双酶切检测（C）
Fig. 3 PCR（A，B）and restriction enzyme digestion analysis（C）of pET28a-CsKF1-N/M and pET30a-CsKF2-C/M
M：DL2000 DNA marker；1：pET28a-CsKF1-N；2：pET30a-CsKF2-C；
3：pET28a-CsKF1-M；4：pET30a-CsKF2-M.


同样的 4 种条件下，与诱导前对照相比，与预测分子量相当的约 38 kD 的 His-CsKF2-M 蛋白被
大量诱导表达（图 4，B）。从表达量上看，18 8 h℃ 的诱导蛋白的表达量比 22 8 h℃ 稍少一些，但
是从纯度上看 18 8 h℃ 比 22 8 h℃ 要好，在浓度满足要求的情况下选择 18 8 h℃ 进行大量诱导。
6 期 王 燕等：黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备 1213

从结果中还可以看出，几个不同条件下 His-CsKF2-M 的蛋白表达量明显高于 His-CsKF1-M，但
是相应杂带也比较多。为了提高纯度，可以适当增加洗脱次数，但是随着洗脱次数的增加，蛋白的
表达量会有损失，因此在试验中应根据对蛋白浓度和纯度的综合考虑选择合适的洗脱次数。

图 4 不同诱导条件下动蛋白马达区 His-CsKF1-M（A）和 His-CsKF2-M（B）原核表达的 SDS-PAGE 检测
M：Blue plus protein marker；1：诱导前样；2：诱导后样；3：上清样；4：沉淀样；5：穿柱样；
6：洗涤样；7 ~ 9：洗脱 1、2、3 次得到的纯化蛋白。
Fig. 4 SDS-PAGE detection of prokaryotic expression product of His-CsKF1-M（A）and His-CsKF2-M（B）by different condition
M：Marker；1：Total proteins from non-induced E. coli；2：Total proteins from IPTG-induced E. coli；
3：Soluble proteins from IPTG-induced E. coli；4：Insoluble proteins from induced E. coli；
5：Flowing through protein from induced E. coli；6：Washing protein from induced E. coli；
7–9：Eluting soluble protein purified for three times through Ni-NTA affinity column.

2.5 黄瓜动蛋白非马达区特异肽段在原核细胞中的诱导表达与纯化
将重组质粒 pET28a-CsKF1-N 质粒转化至大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞内。在 18 6 h℃ 、
18 8 h℃ 、22 6 h℃ 、22 8 h℃ 条件下诱导，与诱导前对照相比，与预测分子量相当的约 25 kD 的
His-CsKF1-N 蛋白被大量诱导表达（图 5，A），4 个条件相比较而言，22 ℃下 2 个时间段诱导的蛋
白表达量比 18 2℃ 个时间段诱导的都高，说明 22 ℃更适合该蛋白表达，相比 8 h，6 h 诱导的杂带
更少，因此将 22 6 h℃ 设定为 His-CsKF1-N 大量诱导的适宜条件。
与诱导前对照相比，与预测分子量相当的约 30 kD 的 His-CsKF2-C 蛋白被大量诱导表达（图 5，
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B），但是在上清液中（泳道 3）没有发现明显目的蛋白的表达，该蛋白大部分是以包涵体（泳道 4）
的形式存在的。22 6 h℃ 和 22 8 h℃ 诱导蛋白的量相比其他两个条件都明显多，纯度相当，从节省
时间上考虑选择 22 6 h℃ 进行大量诱导即可。


图 5 不同诱导条件下动蛋白非马达区 His-CsKF1-N（A）和 His-CsKF2-C（B）原核表达的 SDS-PAGE 检测
M：Blue plus protein marker；1：诱导前样；2：诱导后样；3：上清样；4：沉淀样；5：穿柱样；
6：洗涤样；7 ~ 9：洗脱 1、2、3 次得到的纯化蛋白。
Fig. 5 SDS-PAGE detection of prokaryotic expression product of His-CsKF1-N（A）and His-CsKF2-C（B）by different condition
M：Marker；1：Total proteins from non-induced E. coli；2：Total proteins from IPTG-induced E. coli；
3：Soluble proteins from IPTG-induced E. coli；4：Insoluble proteins from induced E. coli；5：Flowing through protein
from induced E. coli；6：Washing protein from induced E. coli；7–9：Eluting soluble protein purified for
three times through Ni-NTA affinity column.

2.6 anti-KF1-N 和 anti-KF2-C 多克隆抗体制备及纯化
His-CsKF1-N 经过镍柱纯化（图 6，A）后作为抗原，His-CsKF2-C 包涵体经过裂解缓冲液重悬
后的样品进行 SDS-PAGE 后用 KCl 染色法将目的条带切下液氮研磨成粉末作为抗原（图 7，A），
制备多克隆抗体，0.5 mg 抗原/次，免疫 4 次加强免疫 1 次后对兔子进行心脏取血，抗血清进行 ELASA
测定，anti-KF1-N 效价值 16 000，anti-KF2-C 效价值为 4 000。抗体经亲和纯化试剂盒 Amino Link Plus
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Immobilization Kit 纯化后，进行 SDS-PAGE（图 6，B；图 7，B）。可以看出，anti-KF1-N 在第 4 ~
6 收集管中纯化的抗体浓度比较高，anti-KF2-C 第 3 ~ 5 收集管中抗体浓度较高，因此合并分装后
–80 ℃保存。另外将电泳可见但浓度比较低的几个收集管也合并保存备用。


图 6 anti-CsKF1-N 多克隆抗体的亲和纯化
A：His-CsKF1-N 抗原纯化（M：Blue plus protein marker；1 ~ 8：镍柱洗脱后得到的纯化蛋白）。
B：anti-CsKF1-N 多克隆抗体纯化（M：Blue plus protein marker；a：抗原结合柱子前；a’：抗原结合柱子后；
b：穿柱前抗血清；b’：穿柱后抗血清；1 ~ 8：亲和柱洗脱抗血清）。
Fig. 6 Affinity-purification of anti-CsKF1-N polyclonal antibody
A：Purification of antigen His-CsKF1-N（M：Marker；1–8：Eluting soluble protein through Ni-NTA affinity column）.
B：Affinity-purification of anti-CsKF1-N polyclonal antibody（M：Marker；a：The antigen before binding
to the resin；a’：The antigen after binding to the resin；b：The antiserum before binding to the resin；
b’：The antiserum after binding to the resin；1–8：Elution fraction from affinity column）.


图 7 anti-CsKF2-C 多克隆抗体的亲和纯化
A：His-CsKF2-C 抗原纯化（M：Blue plus protein marker；1：诱导前样；2：诱导后样；3：上清样；4：沉淀样；5：穿柱样；
6：镍柱洗脱得到的纯化蛋白）。B：anti-CsKF2-C 多克隆抗体纯化（M：Blue plus protein marker；
b：亲和柱穿柱前抗血清；b’：亲和柱穿柱后抗血清；1 ~ 7：亲和柱洗脱抗血清）。
Fig. 7 Affinity-purification of anti-CsKF2-C polyclonal antibody
A：Purification of antigen His-CsKF2-C（M：Marker；1：Total proteins from non-induced E. coli；2：Total proteins
from IPTG-induced E. coli；3：Soluble proteins from IPTG-induced E. coli；4：Insoluble proteins from induced E. coli；
5：Flowing through protein from induced E. coli；6：Eluting soluble protein through Ni-NTA affinity column）.
B：Affinity-purification of anti-CsKF2-C polyclonal antibody（M：Marker；b：The antiserum before
binding to the resin. b’：The antiserum after binding to the resin；
1–7：Elution fraction from affinity column）.

2.7 Western blot 分析
以表达的融合蛋白 His-CsKF1-N 和 His-CsKF2-C 为抗原，以免疫兔子得到的纯化多克隆抗体
anti-CsKF1-N，以 anti-CsKF2-C 为一抗，碱磷酶标记的羊抗兔抗体为二抗，对多克隆抗体的原核表
达产物进行 Western blot 分析，结果显示，未诱导的大肠杆菌泳道上未出现目的条带（图 8，A，泳
道 1），在免疫印迹结果中也没有相应的杂交条带（图 8，B，泳道 1）。通过 SDS-PAGE 和 Western blot
检测结果可以看出 His-CsKF1-N 的分子量约为 25 kD（图 8，A、B，泳道 2），去除载体上的约 6 ~ 8
kD 大小的多肽标签（His-tag），该分子实际表达约 17 ~ 19 kD，与预期表观分子量符合。
1216 园 艺 学 报 41 卷
通过 SDS-PAGE 和 Western blot 检测结果可以看出 His-CsKF2-C 的分子量为 30 kD（图 8，A、
B，泳道 3），免疫印迹的对应位置出现了杂交条带（图 8，B，泳道 3），该分子实际表达约 22 ~ 24 kD，
与预期表观分子量符合。

图 8 重组蛋白 SDS-PAGE 检测（A）和 Western blot 检测（B）
M：Blue plus protein marker；1：未诱导的大肠杆菌；2：His-CsKF1-N；3：His-CsKF2-C。
Fig. 8 SDS-PAGE detection（A）and Western blot（B）of recombinant protein His-CsKF1-N and His-CsKF2-C
M：Protein marker；1：Non-induced bacteria；2：Induced bacteria of His-CsKF1-N；
3：Induced bacteria of His-CsKF2-C.
3 讨论
果实发育是一个受不同基因调控的复杂过程，研究发现，细胞快速分裂和细胞膨大在果实发育
中起了重要作用，它在很大程度上决定了果实最终的形态和大小。Ando 等（2012）对黄瓜转录组数
据分析中发现，在果实发育早期细胞快速膨大过程中，细胞骨架微管蛋白（tublin），肌动蛋白（actin）
以及细胞壁相关蛋白的表达量都很高。微管蛋白是真核生物主要的细胞骨架蛋白之一，在维持细胞
形状、细胞分裂、胞内物质运输、信号转导等方面发挥着重要作用。细胞内有很多微管结合蛋白，
通过不同的方式结合于微管，并影响微管的结构特性，从而调节微管的功能。常见的微管结合蛋白
包括 MAPs、动蛋白（Kinesin）、动力蛋白（Dynein）等。
首次发现动蛋白至今，已经在不同的真核生物中发现了许多动蛋白。根据 2004 年的命名方法，
动蛋白超家族分为 14 个家族。动蛋白重链可分为马达区（motor domain）、茎区（stalk region）和尾
区（tail region）。马达区为球状头部，有约 340 个氨基酸残基的保守序列，含有保守的 ATP 结合位
点和微管结合位点形成的催化中心（Aizawa et al.，1992；Kikkawa et al.，2001）。本研究中，动蛋
白 CsKF1 的保守马达区（kinesin motor domain）位于总蛋白 168 ~ 499 aa 区域，ATP 结合位点位于
马达区内（178 ~ 179 aa，261 ~ 268 aa）。动蛋白 CsKF2 保守马达区位于总蛋白 106 ~ 442 aa 区域，
ATP 结合位点位于马达区内（115 ~ 116 aa，183 ~ 190 aa）。
通过原核表达获得大量的抗原蛋白，可用于特异性抗体制备、蛋白质性质与功能研究、蛋白质
的相互作用和多种生化功能研究。通过亲和层析方法，纯化得到高纯度的融合蛋白，免疫兔子制备
出 anti-CsKF1 和 anti-CsKF2 多克隆抗体，可进行直接的蛋白质组学与细胞学定位和定量分析检测。
从发育树还可以看出，黄瓜动蛋白 CsKF1 与拟南芥 AtKinesin13A/B 同源性达到 73%左右，
AtKinesin13-A 和 AtKinesin13-B 是拟南芥中的动蛋白（Lee & Liu，2004）。AtKinesin13-B 的功能尚
未报道，AtKinesin13A 的功能缺失导致拟南芥叶表皮毛表型异常，说明 AtKinesin13-A 与高尔基体
运输，表皮毛伸长和细胞形态有关（Lu et al.，2005）。水稻动蛋白 SRS3 与拟南芥 AtKinesin13-B 有
6 期 王 燕等：黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备 1217

相似氨基酸序列，在调控水稻细胞面积和种子长度中发挥作用（Kitagawa et al.，2001）。结合本课
题组对黄瓜动蛋白在果实发育早期的表达模式研究结果，发现 CsKF1 在果实快速膨大期表达量有明
显上调，因此推测该蛋白在果实细胞膨大过程中起着重要作用。从本研究的系统发育树中，可以看
出黄瓜动蛋白 CsKF2 与拟南芥中已经报道（Liu & Lee，2001）的 AtPAKRP1 同源性达到 92%，据
报道 AtPAKRP1 定位于成膜体中间区域，该动蛋白参与胞质分裂过程，那么黄瓜果实动蛋白 CsKF2
是否参与果实细胞快速分裂过程？这两个动蛋白的具体作用还有待深入研究。

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