全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（7）：1233–1243 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–03–04；修回日期：2013–06–17
基金项目：现代农业产业技术体系项目（CARS-28-01-07）；山东省良种产业化工程项目（620902）；青岛市科技计划基础研究项目
[12-1-4-5-(1)-jch]；山东省教育厅项目（J10LC12）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hydai@qau.edu.cn）
苹果 NBS-LRR1 基因的鉴定与表达分析
宋 霄 1，柏素花 2，戴洪义 1,*
（1 青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109；2 青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266109）
摘 要：NBS-LRR 蛋白是植物细胞内普遍存在的主要抗性蛋白家族，该家族的蛋白包含有 NBS 结构
域和 LRR 结构基序，在植物抵御各种病原物的侵袭中发挥重要作用。从‘嘎啦’苹果中鉴定了一个
NBS-LRR 类基因，命名为 MdNBS-LRR1，（GenBank 登录号：JX126858）。该基因全长为 3 116 bp，包含
一个 2 826 bp 的开放读码框，编码包含 941 个氨基酸残基的蛋白质；其氨基酸序列含有典型的 NBS-LRR
类抗病基因所具有的 NB-ARC 结构域。Blast 分析发现 MdNBS-LRR1 与大豆 NBS-LRR 类抗性蛋白具有较
高的氨基酸序列一致性（60%）。RT-PCR 分析结果表明，MdNBS-LRR1 在‘嘎啦’苹果的幼叶、茎、功能
叶、芽、皮和花等组织中均有表达，在幼叶中的表达量最高，茎中最低。苹果轮纹病病原菌侵染可促进
MdNBS-LRR1 基因表达上调，接种后 24 d 表达量最高，是对照的 10.6 倍左右，另外，在‘嘎啦’苹果幼
苗叶片中，SA、MeJA 和 ACC 均可诱导该基因的表达，表明 MdNBS-LRR1 基因的表达受到与抗病相关信
号转导途径的调控。
关键词：苹果；NBS-LRR；基因表达；水杨酸；茉莉酸甲酯；ACC；Botryosphaeria dothidea
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）07-1233-11

Identification of an Apple NBS-LRR1 Gene and Its Expression Analysis
SONG Xiao1，BAI Su-hua2，and DAI Hong-yi1,*
（1College of Landscaping and Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China，
2 College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China）
Abstract：NBS-LRR proteins are one protein family which contains Nucleotide-binding site（NBS）
and leucine-rich repeat（LRR），and play an important role in defending plants from various pathogens. A
new NBS-LRR gene was identified from‘Gala’apple and named MdNBS-LRR1（JX126858）. The full
cDNA was 3 116 bp in length with an open reading frame（ORF）of 2 826 bp and encoded a protein of 941
amino acids. The putative amino acid sequence contains an NB-ARC domain. The BLAST analysis
exhibited high identity（60%）to NBS-LRR resistant protein（ACM89637）from Glycine max. Real time
quantitative PCR analysis showed that the expression of MdNBS-LRR1 was observed in all tissues tested
here including young leaves，shoot，functional leaves，bud，bark and flower，and the highest expression
level was found in younger leaves. The expression of MdNBS-LRR1 was up-regulated by infection with
Botryosphaeria dothide and reached the peak value at 24 d（10.6-fold higher than that in control）after
inoculation. In addition，SA，MeJA and ACC could induce the expression of MdNBS-LRR1 gene in

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leaves，indicating that MdNBS-LRR1 could be regulated by the disease-resistant related signaling
pathway.
Key words：Malus × domestica；NBS-LRR；gene expression；salicylic acid；methyl jasmonate；
ACC；Botryosphaeria dothidea

目前，在不同物种中已有大约 70 个抗性基因（R 基因）被分离鉴定（Liu et a1.，2007）。这些
已鉴定的 R 基因编码的蛋白产物往往具有相似的结构域，部分区域在不同物种间表现高度保守。根
据已克隆的 R 基因所编码的蛋白质保守结构及其在细胞中的位置，R 基因分为 5 类
（Hammond-Kosack & Jones，1997），其中一类是 NBS-LRR 蛋白，即具有核苷酸结合位点和富亮氨
酸重复基序的蛋白。该类蛋白常常与真菌或细菌病原的效应子进行结合，抑制病原在植物细胞中定
植和扩展。
NBS-LRR 是主要的抗性基因，其抗病性是目前该类蛋白已知的唯一功能（Belkhadir et a1.，2004；
Jones & Takemoto，2004）。NBS 包含多个功能基序，如 P-loop、亮氨酸重复，核苷酸结合基序、及
激酶结构域等。其 LRR 结构可能作为受体，参与病原体的识别和信号转导，激酶结构域在激活其下
游转导元件中发挥作用。近年来，在许多果树中，对该类基因的研究已有报道，如荔枝、龙眼、银
杏、芦柑、柚子、香蕉、梨、草莓和柚 × 枳壳等（黄代青，2002；袁克华 等，2009；张洪磊 等，
2010；刘建成 等，2011）。2004 年，Baldi 等（2004）从苹果基因组中鉴定了 30 个不同的 NBS-LRR
基因的同源序列，发现这些同源序列在苹果基因组 12 个连锁群中广泛分布，但目前尚未有完整的
NBS-LRR 基因被克隆鉴定，其在苹果抗性中的作用也缺乏研究。
苹果抗病基因的相关研究虽然起步较早，但由于复杂的遗传背景，尚未取得实质性的进展。近
年来，随着分子标记技术与克隆技术的改进，先后克隆了 59 个 RGA（抗病基因同源序列）和与 R
基因非常类似的基因，目前为止，除了抗黑星病的 Vf 基因外，还未分离出其它的苹果 R 基因（渠
慎春 等，2009）。2010 年苹果基因组测序工作已完成（Velasco et al.，2010），基于苹果基因组水平
上 NBS 类抗病基因的研究还很少。在对苹果基因组 NBS 基因进行分析的基础上，根据其结构、进
化特征等进行了分类，克隆具代表性、保守性强的基因，并对轮纹病病原菌侵染后的表达变化进行
了分析。
本文报道对轮纹病病原菌侵染前后发生显著变化的基因 MdNBS-LRR1 的 cDNA 全长序列的克
隆、苹果轮纹病病原菌侵染后的时序表达及外源激素处理后的时序表达变化，以探讨其在苹果植物
防御反应中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料及其处理
供试材料为青岛农业大学果树育种基地的‘嘎啦’苹果树。于 2011 年 5 月采集幼叶、功能叶、
茎、枝皮、芽和花等，每种组织从 6 株树上取样混合作为一个样品，3 次重复，用于基因的组织表
达分析。
激素处理用茎尖培养获得的‘嘎啦’组培苗进行。扩繁培养基为 MS + 2.0 mg · L-1 6-BA + 0.5
mg · L-1 NAA + 30 g · L-1 蔗糖 + 8 g · L-1 琼脂。生根培养基为 1/2MS + 1.0 mg · L-1 IBA + 20 g · L-1 蔗
糖 + 8 g · L-1 琼脂。诱导生根 30 d 后进行处理。分别用不同浓度的水杨酸（salicylicacid，SA 0.25、
0.5、1 和 2 mmol · L-1）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA 20、50、100 和 200 μmol · L-1）以
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及 ACC（5、10、30 和 50 μmol · L-1）分别喷施植株，于处理后 0、2、4、10、24 和 30 h 后取其
叶片分析基因表达；以喷施蒸馏水作为对照，于 24 h 后取样。试验设 3 次重复，每次重复 6 株
苗。
轮纹病接种试验在嫁接于八棱海棠砧木上的 2 年生‘嘎啦’苹果树的当年生枝条上进行。轮纹
病病原菌用菌株 040301 由青岛农业大学植物病理实验室李保华教授提供，接种方法参考周增强等
（2010）稍作改动。将活化后的菌种接种在 PDA 培养基上，25 ℃培养，用 75%酒精棉球擦拭枝条
表面进行消毒，然后用打孔器在菌落边缘取直径为 1.2 cm 的菌饼接种，使菌丝面接触枝条表面，用
塑料薄膜包裹在枝条上，2 d 后除去塑料薄膜。每个枝条接种 3 个点，每株接种 3 个枝条，共接 20
株。分别于接种后 0、6、12、18、24、28、32 和 36 d 取样，每次取 3 株，每个植株取 1 个枝条。
剥下接种部位的嫩皮，提取 RNA，检测基因表达，设 3 次重复，以不接种的枝条作为对照。
1.2 基因克隆
总 RNA 用原平皓生物技术有限公司的“EASY spin 植物 RNA 快速提取试剂盒”从‘嘎啦’苹
果幼叶提取。所提取的RNA采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，Cat# K1622）
反转录合成第一链 cDNA，用于目的基因的扩增。为方便进行 3′RACE，反转录引物在 O1igo（dT）
的 5′端连接一接头序列（表 1）。
用 blastP 算法在苹果基因组数据库中搜索拟南芥 NBS-LRR 蛋白（RPM1，AT3G07040）的同源
蛋白的编码基因组序列，对所得到的基因组序列用 Softberry 在线软件预测其编码区。根据其预测的
编码区用 Primer 5.0 软件设计特异引物 FA 和 RA（表 1）。
以合成的第一条链 cDNA 为模板，以 FA/RA 为引物进行目的片段的 PCR 扩增。扩增片段纯化
回收后测序，在此序列基础上设计引物正向特异引物：GSP1 和 GSP2，并以接头序列为反向引物（表
1），以合成的带接头的第一链 cDNA 为模板，通过两次扩增获得基因 3′cDNA 末端。

表 1 苹果 NBS-LRR 基因克隆所用引物
Table 1 The primers for NBS-LRR gene cloning

1.3 基因的生物信息学分析
氨基酸序列同源性分析用 BLAST 算法（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行。
用在线软件 Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析保守结构域，蛋白的相
对分子量和等电点用 ExPASy 的 Protparam toll 分析，信号肽和跨膜结构域分析分别使用 SignalP 4.0
和 TMHMM Server v.2.0。
ClustalX 进行多重序列比对的基础上，用软件 MEGA 5.0 按邻接法构建系统进化树。
1.4 实时定量 PCR
荧光定量 PCR 应用 LightCycler 480 SYBY Green MasterⅠ 试剂盒，根据厂商推荐的方法，在罗
引物名称
Name of primers
序列（5′–3′）
Primer sequences
FA(上游引物 Forward primer sequence)
RA(下游引物 Reverse primer sequence)
CCATACATCATCTTCTCAGT
ATTCTCCTTCCAGGAATGAT
GSP1(上游引物 Forward primer sequence)
GSP2(上游引物 Forward primer sequence）
Adaptor(下游引物 Reverse primer sequence）
GAGGAGGCTTGAACCTAATA
ATCAGGCATCGAGCATTTAA
CATGACTAGTCGGACTGAAC
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氏 Light Cycler 480 系统上进行。所用 MdNBS-LRR1 的引物为：F1，5′-CATTTAGAGCCCTTGT-3′；
R1，5′-CCTTTGTAGCCAGAAC-3′。内参基因 β-actin（GQ339778.1）的引物为：5-CTGAACCCAAA
GGCTAATCG-3和 5-ACTGGCGTAGAGGGAAAGAA-3。扩增片段大小为 171 bp。反应体系为 20
μL，包括 10 μL Master 预混液，上下游引物各 0.8 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 7.4 μL。反应程序
设置为 95 10 s℃ ，55 10 s℃ ，72 10 s℃ ，共进行 45 个循环。设置熔解曲线，以检测引物是否可用。
试验做 3 次生物学重复和 3 次技术重复。
数据分析根据 Livak 和 Schmittgen（2001）报道的 2-ΔΔCT 法进行。在组织表达分析中用表达量最
低的组织作为校正子，在激素和轮纹病病原菌诱导处理中用未处理的样品作校正子。
2 结果与分析
2.1 苹果 MdNBS-LRR1 全长 cDNA 的克隆及其生物信息学分析
以‘嘎啦’苹果幼叶总 cDNA 为模板，FA/RA 为引物，通过 PCR 扩增得到 2 930 bp 的片段，
其中包括 49 bp 的 5′端非编码序列。根据此片段序列设计引物 GSP1 和 GSP2 作为正向引物，分别与
带接头的引物 adaptor 组成引物对进行巢式 PCR，获得 298 bp 的片段。将获得的两个 cDNA 片段经
DNAMAN 6.0 软件拼接后，获得一个全长 3 116 bp 的 cDNA 序列，命名为 MdNBS-LRR1（GenBank
登录号：JX126858），并在编码区两端设计引物扩增获得了全长 cDNA 片段加以验证。MdNBS-LRR1
开放阅读框为 2 826 bp，编码 941 个氨基酸；3′端有 244 bp 的非翻译区（3′UTR），包括有加尾信号
序列 AATAA 及多聚腺苷酸序列，全长 cDNA 及推定的氨基酸序列如图 1 所示。
用 ProtParam tool 软件预测 MdNBS-LRR1 编码蛋白质分子质量为 107.322 kD，等电点为 8.75，
分子式为 C4829H7795N1337O1359S31。结构分析表明 MdNBS-LRR1 编码的蛋白质基因属于 NBS-LRR 基
因家族：N 端为一个典型的 NB-ARC 结构域，由 P-looP 结构域、激酶 Kinase-2a、激酶 Kinase-3a 以
及疏水结构域 HD 组成，其共有序列分别为 GMGGGKTT、VLDDLW（D/X）、GSRXXXTTR（X 为
任意氨基酸）和 GLPLA（图 2）；而 C 端具有亮氨酸重复序列（LRR）。
根据 NBS 的 Kinase-2a 最后一个氨基酸的不同，NBS-LRR 基因可分为 TIR-NBS-LRR 和 CC-
NBS-LRR 两类，即 TIR 类和 non-TIR 类，前者 Kinase-2a 最后一个氨基酸是天冬氨酸（D），后者则
为色氨酸（W）（Meyers et al.，1999；Pan et al.，2000）。MdNBS-LRR1 基因 Kinase-2a 区最后一个氨
基酸是 W，可推断其属于 CC-NBS-LRR 类型。
2.2 MdNBS-LRR1 基因编码的氨基酸序列同源性比对及其进化分析
通过 Blast 分析发现，MdNBS-LRR1 与大豆 ACM89637、蒺藜苜蓿 AES95653、毛果杨 EEE72365、
蓖麻 EEF40615、麻疯树 BAJ53254、葡萄 CAN74463 的 NBS-LRR 类抗性蛋白在氨基酸序列的一致
性分别为 60%、58%、58%、54%、54%和 52%，且不同植物间 NBS-LRR 类基因在氨基酸序列上存
在高度的保守性，具有 NB-ARC 结构域（图 2），但与已知功能的烟草 N、水稻 Xa1、小麦 Lr21、
拟南芥 RPP5 等的相似性很低，不足 20%。
将 MdNBS-LRR1 蛋白与来源于拟南芥、烟草、亚麻、玉米、水稻等的 NBS-LRR 蛋白的氨基酸
序列采用邻接法聚类。由图 3 看出 NBS-LRR 家族明显分为两个亚群，即 TIR-NBS-LRR 和 CC-NBS-
LRR。MdNBS-LRR1 与拟南芥的 RPS5（AEE28852）、RPP8（AED94968）、RPP13（AAF42832）、
RPM1（AEE74492），以及来源于水稻的 Xa1（AB002266）、小麦的 Lr21（AAO12455）和玉米的
ROX1（AAX31149）共同聚类在同一个亚群，属于 CC-NBS-LRR 亚类。
7 期 宋 霄等：苹果 NBS-LRR1 基因的鉴定与表达分析 1237

1 M A E S V V T F L 1 CCATACATCATCTTCTCAGTTTCAAAACAAAAGTTCAAAGCCAAAAGAAATGGCAGAAAGTGTAGTTACCTTCTT 10 L D R L T S L I E Q E V R L F S G V R A Q I E D I 76 GCTCGACAGGCTCACCTCCTTGATTGAACAGGAGGTGAGGCTATTCTCAGGGGTCCGAGCCCAGATCGAGGATAT 35 I D E L E R I K A F L R V A D A K E D D D P Q L K 151 AATCGATGAGTTGGAGCGCATTAAGGCCTTCTTAAGAGTTGCTGATGCAAAGGAAGATGACGACCCTCAGCTCAA 60 V W V K Q V R D V A Y E I E D A L D K F R L S H S 226 AGTGTGGGTCAAACAAGTCAGAGATGTGGCTTATGAGATTGAAGATGCGCTTGATAAATTCAGGCTTTCCCATTC 85 H V H R H G F H A S L R K L S R I I K K L I A R R 301 ACATGTTCATAGGCATGGATTCCATGCATCCCTTCGTAAGCTTTCTCGCATCATCAAGAAATTAATAGCCCGGCG 110 Q I A G D I Q T I K S K I R S L S E G H V K Y K L 376 ACAAATTGCTGGTGATATCCAAACCATCAAATCAAAGATCAGAAGCCTCTCCGAGGGACATGTCAAATACAAGCT 135 D V D P G S S K A R K P W F R Q G D A L L L E E A 451 TGATGTTGACCCTGGCTCAAGCAAGGCTCGGAAGCCTTGGTTCCGTCAAGGCGATGCCCTTTTGCTGGAAGAGGC 160 D L V A I G E P K R Q L I E L L M A G E S G R Q A 526 TGATCTGGTGGCAATCGGTGAGCCCAAAAGGCAGCTGATTGAGTTGCTTATGGCGGGTGAATCTGGACGCCAGGC 185 I S V V G M G G L G K T T L V K Q V Y E D A R V Q 601 AATCTCGGTGGTTGGGATGGGAGGACTGGGGAAAACGACCTTGGTAAAGCAAGTGTACGAGGATGCAAGAGTTCA 210 K R F K V H A W I T V S Q P F K I K R L L R H V V 676 GAAACGTTTTAAGGTACATGCTTGGATCACTGTTTCTCAACCATTCAAGATAAAGCGGCTCCTAAGACACGTAGT 235 Q K I F Q V I R K P V P E E V D S M N T D Q L R E 751 TCAGAAAATCTTCCAAGTTATCAGGAAACCAGTCCCTGAAGAAGTTGATAGTATGAACACCGACCAGCTAAGAGA 260 R I K K L L Q Q T R Y L I V L D D L W N N D V W D 826 GAGAATCAAAAAATTACTGCAGCAGACCAGGTACCTGATTGTTCTAGATGACCTTTGGAACAACGATGTGTGGGA 285 A I N H A L P H N G N G S R V M I T T R N A A V A 901 TGCCATCAATCATGCACTGCCCCACAACGGTAATGGTAGTCGTGTAATGATCACTACCCGTAATGCTGCTGTAGC 310 S A S S M E N H G M V Y H L E P L S P E E S W T L 976 CTCTGCCTCTAGCATGGAAAACCACGGTATGGTCTACCATTTAGAGCCCTTGTCTCCAGAAGAGTCTTGGACTCT 335 F C R K T F P E N S C P P N L E G I C Q S I L R K 1051 TTTCTGCAGGAAGACATTTCCAGAAAACTCATGTCCGCCCAACTTGGAGGGAATTTGTCAAAGTATCTTAAGGAA 360 C G G L P L A I V A I S A V L A T K D K R N I E E 1126 ATGCGGGGGACTGCCCCTTGCAATTGTGGCAATCAGTGCTGTTCTGGCTACAAAGGACAAGAGAAACATAGAGGA 385 W A A V S G S I G A Q I E E N G Q L D N M K K L L 1201 ATGGGCTGCCGTTTCTGGAAGCATTGGTGCTCAAATTGAGGAAAATGGCCAACTTGATAACATGAAAAAGTTGTT 410 Y L S F S D L P Y H L K S C F L Y L S I F P D L Y 1276 GTACCTCAGTTTCAGTGACTTACCATACCATCTCAAGTCTTGTTTCTTGTATCTAAGTATCTTTCCCGACCTCTA 435 Q I D H M R L I R L W M A E G F V I E R E G K T P 1351 TCAAATCGACCATATGAGATTAATTCGATTATGGATGGCTGAAGGATTTGTTATTGAAAGGGAAGGAAAGACACC 460 E E V A E S Y L K E L L D R S L I Q A A E I A T D 1426 AGAAGAAGTTGCTGAGAGTTACCTGAAGGAGCTATTGGACAGAAGTTTGATCCAAGCAGCAGAAATAGCAACCGA 485 G R V K S C R I H D L L R E I I I S K S R E Q N F 1501 CGGGAGGGTTAAATCATGCCGGATCCATGATCTTTTACGGGAGATTATCATCTCGAAGTCTAGAGAGCAAAACTT 510 A A I E K E Q G T M W P D K V R R L S I F N T L R 1576 TGCAGCAATAGAGAAAGAGCAAGGTACTATGTGGCCGGACAAAGTTCGACGCCTGTCAATTTTTAACACATTGCG 535 N V I P K R T P S H L R S L L I F G V E D S L T E 1651 GAATGTAATACCAAAGAGGACCCCTTCTCATCTACGCTCGCTGCTCATTTTTGGGGTAGAAGATTCACTTACTGA 560 F S I P K L F P K G L P L L T V L D L Q G A P L D 1726 GTTTTCGATACCAAAATTGTTTCCTAAAGGTCTTCCGCTGCTTACGGTATTAGACTTGCAAGGTGCACCTCTAGA 585 M F P R E V V N L L L L R Y L S L R D T K V K Q I 1801 CATGTTTCCAAGAGAGGTTGTCAACCTTCTTCTTCTCAGGTATCTTAGTTTGAGGGATACCAAGGTGAAACAAAT 610 P S S I R K L Q N L E T L D L K H S L V V E L P P 1876 CCCAAGCTCCATCAGGAAGCTTCAAAACCTAGAGACCCTGGATCTTAAACATTCTCTTGTTGTTGAGTTGCCTCC 635 E I L N L K R L R H L L V Y R Y E V E S Y A R F N 1951 AGAAATTTTGAATCTCAAGCGCCTTCGCCATCTCCTGGTGTATCGGTATGAAGTTGAATCTTATGCACGCTTTAA 660 S R F G V K V P A G I C G L Q S L Q K L C F I E A 2026 TTCCAGATTTGGAGTTAAGGTTCCTGCAGGAATATGTGGCTTGCAGTCGCTCCAAAAGCTGTGTTTTATTGAGGC 685 N H D N G A L M A E L G R M N Q L R R L G I F K L 2101 AAATCATGACAATGGTGCTTTAATGGCCGAACTTGGCAGAATGAATCAACTGAGGAGGTTGGGCATTTTCAAGTT 710 R T E D G V T V C S S V E K L T N L R S L S V S S 2176 GAGGACAGAAGATGGGGTCACCGTGTGCTCATCGGTTGAAAAGCTGACCAACCTTCGCTCGCTGTCTGTATCTTC 735 V E K G M I I D L T Q I S C P P Q F L Q R L Y L T 2251 TGTGGAGAAGGGGATGATAATTGATCTGACACAAATTTCTTGTCCTCCACAGTTCCTTCAGCGACTATATTTGAC 760 G R L E N L P H W I S S L H N L V R L F L K W S R 2326 AGGGCGTTTAGAAAACTTACCGCACTGGATTTCTTCTCTTCATAACCTGGTGAGACTCTTTTTGAAATGGAGTCG 785 L K E D P L V H L Q G L P N L V H L E L L Q V Y D 2401 GCTAAAGGAGGATCCTCTGGTACATCTCCAAGGTTTGCCAAATCTGGTACATCTTGAACTGCTTCAGGTTTATGA 810 G E C L H F K E G G F P S L K L L G I D K L E G V 2476 TGGAGAATGCTTGCATTTTAAGGAAGGAGGGTTTCCAAGTCTAAAGCTATTAGGTATCGACAAATTAGAAGGAGT 835 E E I I I D E G A M P C L E K L I I Q R C N L L K 2551 GGAAGAGATTATCATAGATGAGGGAGCAATGCCCTGTCTAGAAAAGTTAATAATCCAGCGCTGCAACTTGTTGAA 860 K V P S G I E H L K S L K L L E F F D M P D E L I 2626 GAAGGTCCCATCAGGCATCGAGCATTTAAAAAGTTTAAAATTGCTAGAATTTTTCGATATGCCAGATGAATTGAT 885 Q S L L P D G G E D H G K V A H I Q A V Y Y S Y W 2701 CCAGTCACTACTTCCTGATGGTGGAGAAGATCATGGGAAAGTTGCTCACATTCAAGCAGTTTACTATTCCTATTG 910 R G G G W D V N S L E I I H P A T S S A M R R L E 2776 GAGAGGTGGGGGTTGGGATGTGAATTCATTAGAGATCATTCATCCAGCAACTTCTTCTGCCATGAGGAGGCTTGA 935 P N I L W K A * 2851 ACCTAATATCCTATGGAAAGCATAGTTTAGGTTACTGCCTATAATTTATTTATTTGCTTTATCATTCCTGGAAGG 2926 AGAATTCAACCTTGCGACCTCTTCCAACATTGTGGACGAGAGATAACACTAGAGCAATAGCAAGTTGGTGGCTCT 3001 GGCCTATGATCAATAATTGTAAAGAAATCTATCATGAATTCATGATTGAGCTTCTACTACTGCTTGTAACTTTAA 3076 TTAATTCTTGTACTCTTTTACAACAAAAAAAAAAAAAAAAA

图 1 MdNBS-LRR1 的核苷酸序列及推定的氨基酸序列
*代表终止密码子，阴影部分为加尾信号，方框内为 LRR 结构域。
Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MdNBS-LRR1 gene from Malus × domestica
* Indicate termination codon；Letters with gray background represent polyadenylation signal
sequence and the boxed amino acid residues represent LRR motif.
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图 2 苹果 MdNBS-LRR1 与其他物种抗性蛋白的氨基酸序列同源性比较
JX126858：苹果 MdNBS-LRR1；ACM89637：大豆 GmNBS-LRR；AES95653 和 AES95645：蒺藜苜蓿 RPP8 和 RPM1；
EEE72365：毛果杨 PtNBS-LRR；BAJ53254：麻疯树 JcNBS-LRR；CAN74463：葡萄 VvNBS-LRR。
Fig. 2 Homology comparison of amino acid sequences aligment of Malus × domestica MdNBS-LRR1 with
resistance protein from other species
JX126858：Malus × domestic MdNBS-LRR1；ACM89637：Glycine max GmNBS-LRR；AES95653 and AES95645：Medicago truncatula RPP8
and RPM1；EEE72365：Populus trichocarpa PtNBS-LRR；BAJ53254：Jatropha curcas JcNBS-LRR；
CAN74463：Vitis vinifera VvNBS-LRR.

7 期 宋 霄等：苹果 NBS-LRR1 基因的鉴定与表达分析 1239

图 3 MdNBS-LRR1 氨基酸序列与其他植物 NBS-LRR 类抗性蛋白的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of MdNBS-LRR1 and other NBS-LRR proteins

2.3 苹果 MdNBS-LRR1 基因在各种组织器官中的表达特性
利用实时荧光定量 PCR 技术分析 MdNBS-LRR1 基因的组织表达特异性，结果显示 MdNBS-LRR1
在所分析的 6 种组织幼叶、功能叶、幼茎、芽、枝皮和花中均有表达，其中在幼叶中的表达量最高，
幼茎中表达量最低，暗示该基因可能在幼叶的免疫防御中发挥作用（图 4）。
2.4 轮纹病病原菌侵染对 MdNBS-LRR1 表达的影响
为检验 MdNBS-LRR1 基因表达对病原菌侵染的响应，利用苹果轮纹病病原菌 Botryosphaeria
dothidea 接种 1 年生枝条，分别于不同的时间点取样，用实时荧光定量 PCR 技术分析 MdNBS-LRR1
在枝皮中的时序表达。结果显示，苹果轮纹病病原菌接种后可诱导 MdNBS-LRR1 基因的表达，在接
种后 24 d 时表达量最高，为对照的 10.6 倍，随后有所降低（图 5）。

图 4 MdNBS-LRR1 在苹果各组织和器官中的表达 图 5 轮纹病病原菌侵染后 MdNBS-LRR1 在苹果枝皮中的表达
Fig. 4 The expression of MdNBS-LRR1 in different tissues Fig. 5 The expression of MdNBS-LRR1 in bark of apple after
and organs of apple inoculation with Botryosphaeria dothidea
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2.5 外源激素处理对 MdNBS-LRR1 表达的影响
2.5.1 不同浓度 SA、MeJA和 ACC处理后 MdNBS-LRR1在叶片中的表达
SA、JA 和 ETH 是参与植物防御反应的主要信号分子，为了探讨 MdNBS-LRR1 基因是否参与
了植物防御反应，分析了 MdNBS-LRR1 基因表达对不同浓度 SA、MeJA 和 ACC 处理叶片 24 h 的
响应。
结果显示，SA、MeJA 和 ACC 均能诱导 MdNBS-LRR1 基因的表达：1 mmol · L-1 SA 处理能诱
导 MdNBS-LRR1 基因的表达提高 3.9 倍；100 μmol · L-1 的 MeJA 处理诱导其表达提高 2.3 倍；10
μmol · L-1 ACC 处理诱导提高约 2.1 倍，更高浓度的 ACC 处理不能进一步诱导提高表达量（图 6）。

图 6 不同浓度 SA、MeJA 和 ACC 处理 24 h 后 MdNBS-LRR1 在苹果叶中的表达
Fig. 6 The expression of MdNBS-LRR1 in leave of apple at 24 h after treatment with different
concentration of SA，MeJA and ACC

2.5.2 SA、MeJA和 ACC处理后 MdNBS-LRR1在叶片中时程表达
根据上述分析结果，选择 1 mmol · L-1 SA、100 μmol · L-1 MeJA、10 μmol · L-1 ACC 处理叶片，
分别在 0、2、4、10、24 和 30 h 后采样分析。
结果（图 7）显示，1 mmol · L-1 SA 处理 4 h 后，MdNBS-LRR1 基因的表达显著上调，在 24 h
时达到最大，在 30 h 有所降低。
100 μmol · L-1 MeJA 处理后 2 h，MdNBS-LRR1 在叶中的表达量开始有显著提高，为对照的 1.6
倍，24 h 后达到峰值，随后表达量回落，30 h 时接近对照水平。
10 μmol · L-1 ACC 处理后的 10 h，MdNBS-LRR1 在叶中的表达显著被诱导，其表达水平为处理
前的 1.7 倍左右，其后一直到 30 h 时一直处于上升趋势（图 7）。

7 期 宋 霄等：苹果 NBS-LRR1 基因的鉴定与表达分析 1241

图 7 1 mmol · L-1 SA、100 μmol · L-1 MeJA 和 10 μmol · L-1 ACC 处理后 MdNBS-LRR1 的时程表达
Fig. 7 The course expression of MdNBS-LRR1 after treatment with 1 mmol · L-1 SA，100 μmol · L-1 MeJA and 10 μmol · L-1 ACC
3 讨论
抗病相关基因的克隆与鉴定是植物抗病育种中进行遗传改良的一项重要内容。目前已克隆出的
植物抗病基因大部分是通过分子标记结合图位克隆技术获得的（Bent et al.，1994；Whitham et al.，
1994；Feuillet et al.，2003；Huang et al.，2003）。但这并不适于苹果等这类高度杂合的的木本植物，
它们由于树体大、童期长，使得用传统方法克隆基因受到限制。随着基因组测序技术的进步，在全
基因组测序的基础上通过候选基因鉴定的方法发现抗病基因越来越多的被应用到科研实践中。本试
验中从苹果基因组中所鉴定出的 NBS 基因中选取代表性的基因序列，利用 softberry 在线软件在苹
果基因组中预测其编码区，并结合 RACE 技术，从苹果品种‘嘎啦’中克隆了一个全长 3 116 bp 的
NBS-LRR 基因，在对其编码的蛋白进行结构分析的基础上，运用荧光定量 PCR 技术分析了该基因
表达对病原菌接种的响应以及抗病性相关激素处理而发生的变化。结果表明该基因可能参与了苹果
的抗病防御反应。
MdNBS-LRR1 编码的蛋白质含有 NBS-LRR 抗病蛋白的特征结构域，其 N 端为 1 个典型的
NB-ARC 结构域，由 P-loop、kinase2a、kinase3a 以及疏水结构域 GLPL 组成，C 端含有 1 个 LRR
保守结构域。是典型的 NBS-LRR 类抗病基因的结构。NBS 位于真核生物的许多蛋白中，如 GTP 结
合蛋白、核糖体延伸因子（elongation factors）异质三聚体、ATP 合成酶 β 亚基、R 基因编码蛋白等
（Bent，1996），它们在细胞的生长与分化、细胞骨架形成、小泡运输以及防御反应中都具有重要作
用（Pan et al.，2000）。P-loop、kinase2a 和 kinase3a 共同组成了 R 蛋白 NBS 区的 ATP/GTP 结合位
点，在蛋白与蛋白互作中作为一个功能组件发挥作用，比如嘌呤核苷酸的结合通常被认为是改变了
R 蛋白与防御信号传导途径中其它成员间的相互作用（Bent，1996）。而具有特异识别的氨基酸残基
大部分位于 LRRs，可形成多种配基结合域作为 R 蛋白的受体区域，配基结合、参与蛋白与蛋白间
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的互作、蛋白与碳水化合物结合，并能特异性识别病原物来源的信号分子。在对拟南芥 NBS-LRR
类抗病基因 RPS5 的 LRR 突变体研究发现，它不仅参与信号的识别还参与了下游信号的传导（Wang
et al.，1998）。根据 MdNBS-LRR1 的结构特征，推测该基因可能通过与病原的效应子进行结合而抑
制病原在植物细胞中定植和扩展，从而在苹果抗病防御过程中发挥作用。
本研究中使用苹果轮纹病病原菌接种‘嘎啦’苹果枝条，分析了不同时间 MdNBS-LRR1 基因的
表达情况，结果显示接种后 24 d 开始表达显著上调，表明该基因表达响应轮纹病病原侵染而发生变
化，暗示参与了苹果植物对轮纹病的防御反应。
水杨酸、茉莉酸以及 ACC 是植物体内的重要抗病信号分子，当病原菌侵染植物时，可以参与
激活植物免疫防御反应（陈英 等，2012）。SA 被认为是诱发 SAR 的重要信号分子之一。许多植物
在感病后体内的 SA 会大量积累，且与 SAR 的形成紧密相关（Sticher et al.，1997），外源 SA 可诱
导多种植物表达 PR 蛋白。另外，JA 和 ET 是诱导抗病反应的信号分子。JA 和 ET 不敏感的植物对
病原菌（Botryris cinerea）更为敏感（Thomma et al.，1999），且外施 MeJA 可诱导野生型拟南芥对
灰霉病 Botryris cinerea 的抗性（Epple et al.，1995；Penninckx et al.，1996），JA 和 ET 不敏感突变
体也证实了两者作为信号分子在植物抗病反应中的作用（Penninckx et al.，1996；Staswick et al.，
1998）。本研究中对苹果组培苗进行 SA、MJ、ACC 激素诱导处理，通过实时荧光定量 PCR 技术分
析 MdNBS-LRR1 基因的表达，发现在处理的叶片中 MdNBS-LRR1 基因在转录水平上响应了外源 SA、
MJ 和 ACC 的处理，一定浓度范围内其表达量均有不同程度的上调。该结果暗示 MdNBS-LRR1 基因
参与苹果的抗病防御反应，用轮纹病接种苹果枝条同样能诱导该基因的表达也证实了这一点。

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