全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（1）：40–48 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–08–03；修回日期：2011–11–01
基金项目：国家自然科学基金项目（31101534）；福建省自然科学基金项目（2010J0111）；福建省科技重大专项（2008NZ0002）；福建
省属公益类科研院所基本科研专项（2010R1028-5）；福建省农业科学院科技创新团队重点科研项目（CXTD2011-20）；福建省农业科学院博
士科研启动基金项目（BS04）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：fjvrc@163.com）
草莓 9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因
FaNCED 的克隆及表达分析
朱海生 1，李永平 1，花秀凤 2，温庆放 1,*
（1 福建省农业科学院作物研究所，福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建省蔬菜工程技术研究中心，福州 350013；
2福州市蔬菜科学研究所，福州 350012）
摘 要：采用 RT-PCR 和 RACE 技术从草莓果实中克隆 ABA 合成途径中关键基因 FaNCED，该 cDNA
全长 2 228 bp，具有完整的开放阅读框（ORF），共 1 827 个碱基，编码 609 个氨基酸。序列分析表明，
FaNCED 编码的氨基酸序列与其他植物的 NCED 蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示，草莓 NCED
与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类，与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实 NCED 蛋白亲缘关系
较近。实时荧光定量 PCR 分析发现，FaNCED 基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达；在果实
成熟过程中 FaNCED 的表达出现两次高峰，分别在大白果期和红果期，且在红果期表达量最高，并与 ABA
积累相吻合；FaNCED 在果实采后 1 d 表达略有下降，之后急剧上升，ABA 含量变化与 FaNCED 基因的
表达基本一致。FaNCED 可能参与调控 ABA 的合成并在草莓成熟中起一定作用。
关键词：草莓；9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶；NCED；脱落酸；ABA；基因；表达
中图分类号：S 668.4 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）01-0040-09

Cloning and Expression Analysis of 9-cis-epoxycarotenoid Dioxygenase
Gene FaNCED in Strawberry
ZHU Hai-sheng1，LI Yong-ping1，HUA Xiu-feng2，and WEN Qing-fang1,*
（1Crops Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences；Vegetable Research Center，Fujian Academy of
Agricultural Sciences，Fujian Engineering Research Center for Vegetables，Fuzhou 350013，China；2Fuzhou Vegetable
Institute，Fuzhou 350012，China）
Abstract：The FaNCED gene cDNA sequence was cloned from strawberry fruit（Fragaria ×
ananassa）using RT-PCR and RACE techniques. The cDNA sequence consists of 2 228 bp with an intact
open reading frame of 1 827 bp，encoding a polypeptide of 609 amino acids. Homology analysis showed
that the deduced NCED protein was highly homologous to other NCED proteins from different plant
species. Phylogenetic analysis indicated that FaNCED and NCED of Malus hupehensis was gather to a
same group and was more related to other NCED of nonclimacteric fruits including orange，lemon，
Wenzhou pomelo and grape. Real-time PCR analysis revealed FaNCED could be expressed in different


1 期 朱海生等：草莓 9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因 FaNCED 的克隆及表达分析 41

strawberry tissues including root，stem，leaf，calyx and fruit. The expression level of FaNCED has two
peak during the whole period of strawberry fruit development and reached the maximum at the red
ripening stage. The expression level of FaNCED gene decreased 1 d after harvest，but sharply increased
later on. ABA content was consistent with the expression level of FaNCED. FaNCED may participate in
ABA biosynthesis and play a role in the fruit ripening.
Key words：strawberry；9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase；abscisic acid；gene；expression

许多研究表明 ABA 的积累在葡萄成熟和衰老中可能起关键作用（Coombe，1989；Lund et al.，
2008；Zhang et al.，2009a）。吴洁芳等（2010）的研究表明西葫芦果实的成熟主要与 ABA 调控有
关，而乙烯对果实成熟的贡献很小。任杰等（2010）发现乙烯可能并不参与甜樱桃果实的成熟进程
或不起主要作用，而 ABA 可能启动并参与了甜樱桃果实的成熟。
生化与遗传研究已经证明，9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是高等植物 ABA 生
物合成途径的关键酶（Ren et al.，2007）。编码 NCED 的基因首先在玉米中通过 viviparousl4（vpl4）
突变体得到验证（Tan，1997）。在番茄的一个 ABA 缺乏的突变体 notabilis 中分离到了与 vpl4 相关
的基因 LeNCED1（Burbidge，1999）。目前许多植物 NCED 基因已经克隆和鉴定，包括豌豆（Qin &
Zeevaart，1999）、豇豆（Iuchi et al.，2000）、鳄梨（Chernys & Zeevaart，2000）、柑橘（Rodrigo
et al.，2006）、甜樱桃（任杰 等，2010）、柿（Leng et al.，2009）、桃和葡萄（Zhang et al.，2009a；
王延书 等，2010）等。
草莓（Fragaria × ananassa Duch.）属典型的非呼吸跃变型果实（Coombe，1976），其成熟调
控以及采后保鲜困难一直是生产、运输及销售过程中的一个难题。研究发现，乙烯可能并不参与草
莓果实的成熟进程或不起主要作用，推测 ABA 可能启动并参与了草莓果实的成熟（朱海生 等，2008，
2009；贾海锋 等，2011）。
本研究中从草莓果实中克隆了 1 个 NCED 基因（FaNCED），研究 FaNCED 基因表达与 ABA 信
号积累及果实成熟的相关性，为继续开展草莓 ABA 合成代谢调控机制的研究提供实践基础，为在
草莓上应用 ABA 调控果实成熟提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 草莓总 RNA 的提取和 cDNA 的克隆
试验于 2010—2011 年在福建省农业科学院作物研究所进行。供试草莓（Fragaria × ananassa
Duch.）品种为‘法兰地’。
参照 Trizol 说明书和王关林和方宏筠（2002）的方法加以改进提取草莓红果总 RNA。按大连宝
生物有限公司的 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒的方法合成 cDNA 第一链，逆转
录引物 AP 序列为 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17-3′。
根据 GenBank 其他 NCED 基因序列设计一对保守区简并引物，上游 N1：5′-GGK CACCACTTC
TTCGACGG-3′，下游 N2：5′-CTCTTCAAACTCTCVTCGCATTC-3′。
根据 FaNCED 基因保守区克隆测序结果，设计 3′端上游引物 N3，引物序列为：5′-ATCTGGGTT
GAGTCGCCGG-3′，与通用引物 AUAP 配对进行 PCR 扩增，AUAP 序列为：5′-GGCCACGCGT
CGACTAGTAC-3′。
根据已获得的FaNCED基因序列，设计了两个 5′端下游引物N4：5′-AAGAGGCGGTCGTTGAAG
42 园 艺 学 报 39 卷
TA-3′和 P5：5′-GTCTCCCGATTTCACGCTCC-3′。以大连宝生物有限公司的 PrimeScriptTM 1st Strand
cDNA Synthesis Kit 试剂盒为基础，以 N4 为引物合成 cDNA 第 1 链，cDNA 第 1 链加同聚物尾，在
加尾的基础上进行 cDNA 第 2 链的合成，产物用于 PCR 扩增。N5 与通用引物 AUAP 配对进行 PCR
扩增。
根据获得的 FaNCED 基因 cDNA 全长，设计 ORF 引物 N6 和 N7 以及全长引物 N8 和 N9，进行
FaNCED cDNA ORF 和全长克隆，验证已获得的序列。4 个引物的序列为，N6：5′-ATGGCTACTCCTT
CGAATAGTTG-3′，N7：5′-CTATGCCTGGTTTTTCAAGGC-3′，N8：5′-GAAACAAAACACATAAAA
CACCTTGC-3′，N9：5′-AAGGCAGAACTCCTAAATATTTACC-3′。
PCR 扩增产物经 1%的琼脂糖电泳检测后，回收纯化连接到 pMD18-T 载体上，转化，挑取阳性
克隆子，PCR 检测后送至测序，获得 FaNCED 基因全长序列后利用生物信息学数据库和互联网上的
软件进行分析。
1.2 FaNCED 基因的实时荧光定量 PCR 分析
提取草莓不同组织（根、茎、叶、花萼、红果）和不同发育阶段（小绿果、大绿果、小白果、
大白果、粉红果、红果）、采后不同时间（0、24、48 和 72 h）的果实总 RNA，采用 High-Capacity
cDNA Reverse Transcrption Kits（美国，ABI）合成 cDNA 第 1 链。
FaNCED 定量 PCR 引物为，N10：5′-CTACTTCAACGACCGCCTCT-3′，N11：5′-GAGTGTGGA
GGTGACTGGATAC-3′；以草莓 18S rRNA 为内参，18S rRNA 引物为 18SQF：5′-GTAGTCATATGC
TTGTCT-3′，18SQR：5′-GAATGATGCGTCGCCAGCACAAAGG-3′。按照 Power SYBR® Green PCR
Master Mix（美国，ABI）说明书在 ABI7500 实时定量 PCR 仪上进行 PCR 反应。反应体系为：12.5
μL Power SYBR® Green PCR Master Mix，1 μL cDNA，正、反向引物各 0.5 μL（10 μmol · L-1），补
蒸馏水至总体积 25 μL。反应程序为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 1 min，共
40 个循环。
反应结束后分析荧光值变化曲线和融解曲线。每个反应 3 个重复，采用 ABI7500 分析软件中
Comparative CT（ΔΔCT）法分析试验结果。
1.3 草莓 ABA 的提取和测定
参考 Mapelli 和 Rocchi（1983）、Kelen 等（2004）、彭运生和凌祖铭（1992）的方法略有改动，
测定 ABA 含量。
准确称取新鲜样品，在弱光下加液氮研磨至粉末状，加 20 mL 80%的甲醇再次研磨后放入 4 ℃
冰箱浸提 16 ~ 18 h，真空抽滤收集滤液，残渣反复浸提 3 次，每次加 80%甲醇 30 mL 浸提 3 ~ 5 h，
收集并合并其滤液。
滤液过美国 Waters 公司 SEP-PAK CLASSIC C18 50BX 小柱。流出液在 35 ~ 40 ℃、弱光下减压
蒸干甲醇相，收集水相并用 1 mol · L-1 的醋酸调节水相 pH 值至 2.5 ~ 2.8，用等体积的乙酸乙酯萃取
3 次，收集酯相，蒸干，用色谱纯甲醇定溶至 1 mL，过 0.22 μm 的微孔滤膜，用日立 L-2000 高效液
相色谱仪（日本）分析。
进样量为 10 μL；色谱柱为 Phenomenex Luna C18 反相柱（5 μm，250 mm × 4.6 mm），流动相
为甲醇︰乙腈︰磷酸缓冲液（pH 3.5），梯度洗脱；流速为 1 mL · min-1；柱温为 35 ℃；检测波长：
260 nm。
3 次重复，以标样出峰时间和峰高叠加定性，外标法峰面积定量。
1 期 朱海生等：草莓 9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因 FaNCED 的克隆及表达分析 43

2 结果与分析
2.1 草莓 NCED 基因的克隆
以草莓红果果肉总 RNA 逆转录的 cDNA 第 1 链为模板，用简并引物 N1、N2 进行 PCR 扩增，
获得了 1 个大约 850 bp 的特异产物（图 1，A），与预期的片段长度相符。对该片段进行回收纯化，
经连接、转化、筛选阳性克隆、重组质粒 PCR 鉴定、测序，得到 1 个 842 bp 的 cDNA 序列。经 BLAST
分析，证实所获得的序列是草莓 NCED 的保守序列。
根据 3′RACE 的原理，扩增出了 3′端约 950 bp 的片段（图 1，B）。测序结果表明该序列长 948 bp，
与保守区有 143 bp 的重叠区段，实际大小 805 bp。该序列在终止密码子后有长 345 bp 的 3′端非编码
区，其中包括 1 个含 19 个腺苷酸的 poly（A）。经 NCBI 网站上 BLAST 检索证实它是草莓 NCED
的 3′端序列。
根据 5′RACE 的原理，扩增出了 5′端约 700 bp 的片段（图 1，C）。测序得到 1 个 705 bp 的 cDNA
片段，该片段与保守区 cDNA 有 124 bp 的重叠区段，扣除重叠序列和加同聚物尾序列，实际大小为
581 bp，在序列的 5′端包含 1 个 53 bp 的 5 段非编码区。经 NCBI 网站上 BLAST 检索，证实其是草
莓 NCED 的 5′端序列。
图 1 草莓 NCED 基因的克隆
A：NCED 基因的保守区产物；B：NCED 基因的 3′RACE 产物；C：NCED 基因的 5′RACE 产物；
M：DNA 分子量标准 DL2000。
Fig. 1 NCED gene cloning
A：Conserved region product of NCED；B：3′RACE product of NCED；
C：5′RACE product of NCED；M：Marker DL2000.

2.2 FaNCED 基因 cDNA 全长克隆及其序列分析
根据 FaNCED 保守区序列、5′端、3′端序列结果，拼接出全长 cDNA，分别设计 ORF 引物以及
全长引物，进行 PCR 扩增，目的片段符合预期（图 2）。
该 cDNA 全长 2 228 bp，具有完整的开放阅读框（第 54 ~ 1 880 个碱基），共 1 827 个碱基，编
码 609 氨基酸，编码产物的分子量为 66 927.8，理论等电点为 6.12。两端含有 53 bp 的 5′非编码区
和 345 bp 的 3′非编码区。将 cDNA 序列命名为 FaNCED，已登录 GenBank，登录号为：HQ399498
（专利申请号 201010589511.3）。
将获得的 FaNCED 基因全长 cDNA 及其编码的氨基酸序列登录到 NCBI 网站，用 BLAST 进行
核苷酸和氨基酸同源性检索，发现该序列与湖北海棠 NCED（EU716329）、葡萄 NCED1（AY337614）、
柠檬 NCED2（AB219172）、鳄梨 NCED3（AF224671）等序列的同源性分别为 78%、74%、73%、
72%。该序列完整的开放阅读框推导的氨基酸序列与湖北海棠 NCED（ACH85193）、温州蜜柑 NCED3
44 园 艺 学 报 39 卷
（BAE92960）、柠檬 NCED2（BAE92962）、葡萄 NCED1（AAR11193）等的氨基酸序列同源性分别
为 78%、77%、77%和 75%。
图 2 草莓 NCED 基因 ORF 和全长的 PCR 扩增产物
A：ORF克隆；B：全长基因克隆，M：TaKaRa DL2000 marker。
Fig. 2 ORF amplification and PCR amplified product of NCED gene in strawberry
A：ORF amplification；B：The full length of cDNA amplification；M：TaKaRa DL2000 marker.

利用 DNAMAN5.0 软件对草莓和其他植物 NCED 基因的氨基酸序列进行多重比较表明，不同
植物 NCED 基因的氨基酸序列在 N 末端氨基酸序列差异较大，而在中、后部具有很高的保守性（图
3）。
图 3 草莓 NCED 与其他 NCED 的氨基酸序列比对
Ah：花生；Cl：柠檬；Cs：橙；Cu：温州蜜柚；Fa：草莓；Mh：湖北海棠；Vv：葡萄。
Fig. 3 The multiple sequence alignment of NCED in strawberry with other NCED proteins
Ah：Arachis hypogaea；Cl：Citrus limon；Cs：Citrus sinensis；Cu：Citrus unshiu；Fa：Fragaria × ananassa；
Mh：Malus hupehensis；Vv：Vitis vinifera.

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图 5 FaNCED 在草莓不同组织中的
荧光定量 PCR 分析
Fig. 5 Real-time PCR analysis of FaNCED gene
expression in different tissue of strawberry
蛋白质系统进化发现草莓 NCED 与同为蔷薇科的湖北海棠，聚为同一类，和橙、柠檬、温州蜜
柚、葡萄等非跃变型果实 NCED 蛋白亲缘关系比较近（图 4）。


图 4 草莓 NCED 与其他植物 19 个 NCED 蛋白的系统进化分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of NCED in strawberry with 19 others plant NCEDs

2.3 不同组织中 FaNCED 的定量 PCR 分析
FaNCED 基因的定量 PCR 分析结果表明，
FaNCED 基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中
均有表达（图 5），说明该基因为组成型表达，
但表达量存在明显差异。在红果中表达量最高，
其次为根和茎，在花萼和叶中微量表达，即红
果 > 根 > 茎 > 花萼 > 叶。
2.4 FaNCED 基因在草莓果实成熟过程中的
表达
伴随着果实的成熟，FaNCED 基因的相对表
达量相应增加，在大白果期（开始转色）相对表
达量达到一个高峰，在粉红果期 FaNCED 基因
的表达有所下降，在红果中表达量达到最高峰
（图 6）。
伴随着草莓果实成熟，ABA 含量变化趋势与 FaNCED 基因的表达一致， FaNCED 表达水平变
化幅度要大于 ABA 含量变化幅度（图 7）。结果表明 FaNCED 基因可能调控了草莓果实 ABA 的合
成。

46 园 艺 学 报 39 卷
图 6 FaNCED 在草莓果实不同发育阶段的荧光定量 PCR 分析
SG：小绿果；LG：大绿果；SW：小白果；LW：大白果；
P：粉红果；R：红果。
Fig. 6 Real-time PCR analysis of FaNCED gene expression
during strawberry fruit development and ripening
SG：Small green fruits；LG：Large green fruits；
SW：Small white fruits；LW：Large white fruits
（visible start of the ripening phase）；
P：Fruits at the pink ripening stage；
R：Fruits at the red ripening stage.
图 7 草莓果实不同发育阶段的 ABA 含量变化
SG：小绿果；LG：大绿果；SW：小白果；LW：大白果；
P：粉红果；R：红果。
Fig. 7 Changes in ABA content during strawberry fruit
development and ripening
SG：Small green fruits；LG：Large green fruits；
SW：Small white fruits；LW：Large white fruits
（visible start of the ripening phase）；
P：Fruits at the pink ripening stage；
R：Fruits at the red ripening stage.
2.5 FaNCED 在草莓果实采后不同时间点的表达
FaNCED 基因表达在草莓采后 24 h 呈下降趋势，采后 48 和 72 h 表达量逐渐上升，并超过采收
当天红果表达量（图 8）。ABA 含量变化表现出相同趋势，但在采后 24 h 下降幅度较小（图 9）。

图 8 FaNCED 在草莓果实采后不同时间的荧光定量 PCR 分析 图 9 草莓果实采后不同时间 ABA 含量变化
Fig. 8 Real-time PCR analysis of FaNCED gene expression at Fig. 9 Changes in ABA content at different strawberry fruit
different strawberry fruit postharvest time-points postharvest time-points
3 讨论
NCED 在果实成熟、萎蔫、缺水等过程或条件下对 ABA 的合成起着关键的调节作用。目前该基
因的研究主要集中在植物对干旱等逆境的抗性机制和信号传导上（Thompson et al.，2000；Iuchi et al.，
2001；Gang et al.，2009）。而 NCED 基因在果实中的表达只在鳄梨、柑橘、番茄、柿、甜樱桃以
及桃和葡萄上有报道，在鳄梨中 PaNCED1、PaNCED3 在果实成熟过程中表达，与果实成熟相关
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（Chemys & Zeevaart，2000）。柑橘的果实中克隆到两个 NCED 基因（CsNCED1 和 CsNCED2），
CsNCED1 主要作用是调控果实和叶中 ABA 的合成，而 CsNCED2 只是控制组织中叶绿素的含量
（Rodrigo et al.，2006）。番茄果实 ABA 含量增加，LeNCED1 表达量也相应增加，推测 LeNCED1
作为诱发因子，在果实成熟时启动 ABA 的合成（Zhang et al.，2009b）。PacNCED1 在甜樱桃果实
发育的整个过程以及不同部位都有表达，在果肉和种子中的表达不断增加，在果实成熟之前达到最
高峰，而在果柄中的表达则在果实完熟时达到最大（任杰 等，2010）。葡萄和桃上 NCED 表达非
常相似，在果实成熟，ABA 含量开始变高时，葡萄和桃的 NCED1 相应有较高表达（Zhang et al.，
2009a；王延书 等，2010）。
目前草莓 NCED 基因研究较少，GenBank 只登录了 NCED 基因家族 2 个基因片段，分别为
FaNCED1t（FJ560907.1）和 FaNCED1（HQ290318.1）。柴叶茂等（2010）研究表明 FaNCED1
（HQ290318.1）基因转录水平呈现与 ABA 水平相似的变化趋势，果肉中 ABA 含量主要由 FaNCED1
基因决定。本试验成功克隆获得了草莓 FaNCED 基因，该 cDNA 全长 2 228 bp，具有完整的开放阅
读框（ORF），共 1 827 个碱基，编码 609 氨基酸。FaNCED 基因编码的氨基酸序列与其它植物的
NCED 蛋白有很高的相似性。实时荧光定量 PCR 分析发现，FaNCED 基因在草莓根、茎、叶、花萼
和红果中都有表达，其中在红果中表达量最高。在草莓果实成熟过程中，FaNCED 基因均有表达，
并出现 2 个高峰，第 1 次在大白果期即果实由白色向红色转变时期，它可能与果实着色有关，第 2
次是在红果期即果实完熟期，此时 FaNCED 基因表达达到最高，推测它可能和草莓果实成熟有关；
在草莓果实贮藏阶段，FaNCED 表达出现起伏，在果实采后 24 h 表达略有下降，48 h 和 72 h 急剧
上升，ABA 含量与 FaNCED 基因的表达基本一致。以上研究表明 FaNCED 基因在草莓 ABA 生物
合成中起重要作用，草莓 FaNCED 基因表达与 ABA 合成及果实成熟有一定相关性。

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