全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（8）：1517–1526 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–01–16；修回日期：2013–07–02
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（DL10CA03）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xuzhiru2003@126.com，lyhshen@126.com；Tel：0451-82191783）
露地菊离体再生体系建立及 BrDFR 基因遗传转
化
许志茹，陈智华，姜艳东，侯 杰，佟 玲，李玉花*
（东北林业大学生命科学学院，林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040）
摘 要：以露地菊（Chrysanthemum morifolium）品种‘神韵’无菌苗叶片为外植体材料，研究植物
生长调节剂配比对其愈伤组织诱导再生芽的影响，以建立离体再生体系。研究结果表明，露地菊‘神韵’
在含 NAA 1.0 mg · L-1 + BA 1.0 mg · L-1的 MS 培养基上获得了最高的再生芽分化率。利用已经克隆的‘津
田’芜菁 BrDFR 基因构建非抗生素筛选的表达载体。以露地菊‘神韵’的无菌苗叶片为受体，通过农杆
菌介导进行 BrDFR 基因的遗传转化。以载体的 PMI 基因为筛选标记，通过甘露糖筛选获得了‘神韵’的
遗传转化再生植株。经过 PCR 验证和 Southern 杂交检测证实 BrDFR 基因已经整合到‘神韵’基因组中。
关键词：露地菊；组织培养；二氢黄酮醇 4–还原酶基因；遗传转化；分子检测
中图分类号：S 682.1+1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）08-1517-10

Establishment of the Regeneration System and Genetic Transformation of
BrDFR Gene in Chrysanthemum Cultivar
XU Zhi-ru，CHEN Zhi-hua，JIANG Yan-dong，HOU Jie，TONG Ling，and LI Yu-hua*
（College of Life Sciences， Northeast Forestry University，State Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement，
Harbin 150040，China）
Abstract：In our study，with the leaves of the aseptic seedlings of Chrysanthemum morifolium
‘Shenyun’，the effect of plant growth regulator combination on regeneration buds induced from callus
was analyzed，and the regeneration system of‘Shenyun’was established. The study results indicated that
the optimum condition for regeneration buds inducing on MS medium is NAA 1.0 mg · L-1 + BA 1.0
mg · L-1 for Chrysanthemum morifolium‘Shenyun’. Using the BrDFR gene of turnip‘Tsuda’，the
expression vector of non-antibiotic screening was constructed. Leaf explants of the chrysanthemum aseptic
seedlings were infected with Agrobacterium tumefaciens EHA105 pCAMBIA1301 and the BrDFR gene of
turnip‘Tsuda’was introduced into‘Shenyun’. The selection system was based on the use of Escherichia
coli phosphomannose isomerase（PMI）gene as a selectable marker gene and mannose as a selective
nutrient. The explants were selected on medium supplemented with a combination of mannose and sucrose
as a carbon source at different concentrations. Among the leaf explants which were infected，there were 7
shoots surviving after selection by the medium containing 10 g · L-1 mannose. PCR analysis and southern

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blot analysis confirmed that T4 and T7 independent transformed lines were positive for PMI and DFR
genes.
Key words：Chrysanthemum morifolium；tissue culture；dihydroflavonol 4-reductase gene；genetic
transformation；molecular detection

露地菊（Chrysanthemum morifolium）多为红色和黄色等深色系列，花多而密，花期较长，植株
低矮，容易繁殖，广泛应用于北方城市秋季绿化（陈发棣 等，2005；丁兵 等，2007）。目前，通过
转基因技术修饰菊花性状获得菊花新品种的研究已经取得了相关进展（洪波 等，2009；da Slilva et
al.，2013）。
花色素苷属于水溶性类黄酮类色素，是重要的植物次生代谢产物，影响花和果实色泽（Shirley，
1996；Grotewold，2006；Tanak et al.，2008）。二氢黄酮醇 4–还原酶（DFR）是花色素苷合成途径
的关键酶，催化二氢栎皮黄酮、二氢堪非醇、二氢杨梅黄酮分别生成无色花青素、无色花葵素和无
色翠雀素。在此基础上进而形成各种类型的花色素糖苷，使花和果实呈色（Shimada et al.，2005；
Trabelsi et al.，2011）。目前已经从多种植物中克隆了 DFR 基因并研究了其表达特性（Shih et al.，2008；
Tang et al.，2009；Pitakdantham et al.，2011；Li et al.，2012）。DFR 基因的遗传转化可以使转基因
植株的花色发生相应变化。转中国大白菜（Brassica rapa ssp. pekinesis）DFR 基因的烟草植株花青
素含量增加（Lee et al.，2008）。利用夏堇（Torenia‘Summerwave’）的 DFR 基因遗传转化巴西野
牡丹（Tibouchina semidecandra）后转基因植株的花芽颜色变绿（Yong et al.，2009）；过量表达毛果
杨（Populus trichocarpa）PtrDFR1 基因的烟草花色变深（Huang et al.，2012）。
目前，利用花色素苷生物合成相关催化酶基因遗传转化菊花研究已经取得一定进展（Courtney-
Gutterson et al.，1993，1994；Mitiouchkina et al.，2000；Seo et al.，2007）。蓝眼菊（Osteospermum hybrida）
中飞燕草花色素苷的形成主要源于类黄酮 3’,5’羟化酶（F3’5’H）的作用。蓝眼菊的 DFR 不能催化
二氢堪非醇（Dihydrokaempferol，DHK）生成无色天竺葵色素，因此蓝眼菊不能合成花葵素糖苷。
利用能够催化 DHK 的非洲菊（Gerbera hybrida）DFR 基因遗传转化蓝眼菊，转基因植株花色素苷
成分未发生改变。当通过 RNAi 技术沉默了转非洲菊 DFR 基因的蓝眼菊的 F3’5’H 基因后，蓝眼菊
花中积累了大量花葵素糖苷（Seitz et al.，2007）。
本研究中用于遗传转化露地菊的 BrDFR 基因克隆于‘津田’芜菁（Brassica rapa L. subsp. rapa
‘Tsuda’）。‘津田’芜菁块根着色时对光具有敏感性，照光一侧有花青素糖苷的合成呈现粉红色；
背光一侧不着色。基于此，从‘津田’芜菁块根中克隆了花青素合成的关键催化酶基因 BrDFR。研
究表明，BrDFR 基因遗传转化烟草后转基因植株的花色变深（本课题组的试验数据，尚未发表）。
本试验中以露地菊‘神韵’为试材建立了组织培养的离体再生体系。利用 BrDFR 基因构建以磷
酸甘露糖异构酶（phosphomannose isomerase，PMI）基因为选择标记基因的植物表达载体
pCAMBIA1301-PMI-BrDFR，遗传转化露地菊‘神韵’，以期培育出花色柔和、色彩丰富且对环境具
有安全性的露地菊转基因新品系。
1 材料与方法
1.1 材料及其无菌苗的初代培养和继代培养
供试的露地菊品种为‘神韵’（丁兵 等，2007），花朵大，头状花序顶生，浅粉色，抗病性强，
群体效果好。试材 2009 年秋季取自东北林业大学花卉生物工程研究所。试验完成于东北林业大学生
8 期 许志茹等：露地菊离体再生体系建立及 BrDFR 基因遗传转化 1519

命科学学院。
剪取带芽点的幼嫩茎段为外植体，流水冲洗 30 min 之后，用 0.2%的 Tween20 浸泡 5 min，流水
洗涤 30 min。于超净工作台内用 75%乙醇将茎段表面杀菌 1 min，蒸馏水冲洗 3 ~ 4 遍，然后用 1%
的次氯酸钠溶液消毒 10 min，无菌水冲洗 3 遍，剪成约 3 cm 的小段接种于 MS 基本培养基中。接种
15 d 后统计：污染率（%）= 污染的外植体数/接种的外植体总数 × 100；死亡率（%）= 死亡的外
植体数/接种的外植体总数 × 100；成活率（%） =（1–死亡率）× 100。
将初代无菌苗的叶片剪掉，每个植株的茎段剪成 2 ~ 3 段，接种于继代培养基 MS 中，以扩大无
菌苗的数量。
1.2 组培苗不定芽的诱导及生根
将无菌苗的幼嫩叶片切成 1.0 cm × 1.0 cm 的小块，选择带有较粗主叶脉的小块正面朝上接种于
含不同浓度配比的 NAA 和 6-BA 的 MS 培养基上（采用双因素随机试验法设计，共 20 种配比，如
图 1），每处理 40 个外植体，接种于 6 ~ 7 个培养皿中。重复 3 次。在光照强度为 50 μmol · m-2 · s-1、
光周期 16 h · d-1、温度（25 ± 1）℃的条件下培养。30 d 更换 1 次培养基。
待分化的不定芽长至 1 ~ 2 cm 时，在无菌环境下将其切下接种到 MS 基本培养中进行生根培养。
1.3 表达载体的构建
农杆菌 EHA105、载体 pCAMBIA1301-PMI、‘津田’芜菁 BrDFR 基因由东北林业大学生命科
学学院发育生物学科实验室保存。Gateway 试剂盒购于 Invitrogen 公司；Blend Taq、dNTP 和内切酶
购自 TOYOBO 公司；大肠杆菌感受态细胞 TOP10、质粒提取和凝胶回收试剂盒购自北京天根生化
有限公司；Southern 杂交试剂购自罗氏公司和 GE 公司。
按照 Gateway 反应程序，通过 PCR 扩增在‘津田’芜菁 BrDFR 基因两侧加入接头 attB1 和 attB2。
PCR 产物回收纯化后进行 BP 反应和 LR 反应。LR 反应后即可得到 pCAMBIA1301-PMI-BrDFR 植物
表达载体。LR 反应产物转化大肠杆菌细胞后挑取单菌落扩大培养，提取质粒。质粒进行 PCR 检测
和酶切鉴定以验证表达载体构建的正确性。通过电转法将表达载体转入农杆菌 EHA105 中。
1.4 遗传转化体系的建立及优化
1.4.1 叶片分化对甘露糖敏感性的测试、叶盘法遗传转化及抗性苗筛选
将 20 ~ 25 d 苗龄的无菌苗叶片剪成小块，分别接种于甘露糖浓度（于立刚 等，2011）为 0、5、
10、15、20、25 g · L-1 的分化培养基中进行甘露糖敏感性测试。
利用含有目的基因的农杆菌通过叶盘法进行遗传转化。侵染浓度 OD600 值设置为 0.2、0.3、0.4、
0.5 和 0.6，侵染时间分别设置为 5、10、15 和 20 min。重复 3 次。
将侵染过的叶片接种在 MS 培养基上，28 ℃黑暗条件下共培养 2 d，转移到脱菌及筛选培养基
中进行抗性筛选（头孢霉素，cef）和诱导分化。露地菊的脱菌及筛选培养基为在再生体系筛选的最
佳不定芽培养基基础上，添加最适浓度的甘露糖以及头孢霉素，即 MS（蔗糖 20 g · L-1 + 甘露糖 10
g · L-1）+ NAA 1.0 mg · L-1 + BA 1.0 mg · L-1 + cef 300 mg · L-1。待不定芽长到 1 cm 以上时切下转入
MS 培养基并添加最适浓度甘露糖进行生根培养。
1.4.2 转化植株的 PCR和 Southern杂交检测
PMI 基因的 PCR 检测同于立刚等（2011）的方法。BrDFR 基因的 PCR 检测：引物 primer F 为
5′-TAATGGTAGCTCACAAAGAGAC-3′，pimer R 为 5′-TGCTTAGAAATTGAACCCGA-3′。PCR 扩增
条件为 94 ℃变性 2 min；94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1.5 min，共 30 个循环；72 ℃
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延伸 7 min；4 ℃保存。
CTAB 法提取转基因植株和对照植株总 DNA，经限制性内切酶 Hind Ⅲ酶切后琼脂糖凝胶电泳
分离；利用地高辛标记 PMI 和 BrDFR 基因片段制备探针，BrDFR 探针长度为 360 bp，PMI 探针长
度为 260 bp。参照《现代分子生物学模块实验指南》（李玉花 等，2007）中的方法进行 Southern
杂交。
2 结果与分析
2.1 露地菊‘神韵’组培再生体系的建立
‘神韵’茎段外植体培养 15 d 后，成活率在 77%以上。经过继代培养后获得了大量的无菌苗。
按照双因素随机试验设计，对露地菊‘神韵’的叶片外植体在 NAA/6-BA 不同浓度配比的 20 种培
养基中进行再生试验（图 1），接种 10 d 后叶片外植体在切口处均长出绿色的愈伤组织，再经过 14 d
培养后，有的处理在愈伤组织和叶片的中部或边缘分化出绿色的芽点，进而诱导分化形成小丛芽；1
个月后，小芽长至 1 ~ 2 cm。



图 1 不同浓度（mg · L-1）配比 NAA/6-BA 条件下露地菊‘神韵’叶片外植体分化情况
Fig. 1 The regeneration effect of‘Shenyun’blades explants on different
NAA/6-BA（mg · L-1）combinations


8 期 许志茹等：露地菊离体再生体系建立及 BrDFR 基因遗传转化 1521

图 2 LR 质粒电泳图
Fig. 2 Electrophoretogram of the LR plasmid
经过一段时间的培养后，大多数处理均可诱导外植体分化出不定芽，其中 NAA 1.0 mg · L-1 +
6-BA 1.0 mg · L-1 时，不定芽的再生率最高，达到 90%以上，所以该处理可以作为露地菊‘神韵’叶
片外植体理想的分化体系。将 300 个不定芽接种到 MS 基本培养中 10 d 后开始生根，1 个月后生根
率达 99.3%，根系发达，平均每个植株的生根数达到 20 条，为后续的转基因试验提供了良好试材。
2.2 pCAMBIA1301-PMI-DFR 表达载体的构建结果
根据 Gateway 手册，利用‘津田’芜菁
BrDFR 基因获得 BP 反应产物后进行 LR 反应。
LR 反应产物转化大肠杆菌 Top10 感受态细胞，
挑取阳性单克隆扩大培养后提取质粒进行电泳
检测（图 2）。在载体构建过程中，LR 质粒与
BP 质粒均具有卡那霉素抗性。由于 BP 反应载
体长度明显小于 LR 反应载体长度，所以推测
泳动速度慢的质粒是 LR 反应的阳性克隆。图
2 中箭头标示的两个质粒泳动速度慢，初步认
为这两个质粒是正确的 LR 质粒，而其他质粒
是 BP 质粒。
对这两个重组质粒进行酶切检测（图 3）。经过 SacⅠ和 XbaⅠ双酶切后，重组的 LR 质粒
pCAMBIA1301-PMI-BrDFR可以得到 2 489 bp的条带和大于 10 000 bp的大片段，对照 pCAMBIA1301-
PMI 植物表达载体可以得到 3 039 bp 的条带和大于 10 000 bp 的大片段，酶切试验结果与预期一致。























以酶切验证正确的质粒为模板，利用 BrDFR 基因特异性引物进行 PCR 检测，结果如图 4 所示，
pCAMBIA1301-PMI-BrDFR 表达载体 PCR 扩增条带大小约为 1 100 bp，与预期结果一致。综合分析
酶切检测和 PCR 检测结果，由此确定 BrDFR 基因已经整合到携带 PMI 标记基因的表达载体上，获
得了 pCAMBIA1301-PMI-BrDFR 表达载体（图 5）。
图 3 LR 重组质粒酶切结果
M：Marker；1、2：pCAMBIA1301-PMI-BrDFR 载体；
3：pCAMBIA1301-PMI 对照载体。
Fig. 3 Enzyme digestion identification of the LR
recombination plasmid
M：Marker；1，2：pCAMBIA1301-PMI-BrDFR vector；
3：pCAMBIA1301-PMI control vector.
图 4 LR 重组质粒 PCR 结果
M：DL 2000 marker；1、2：PCR 产物。
Fig. 4 PCR identification of the LR recombination plasmid
M：DL 2000 marker；
1，2：PCR production.

1522 园 艺 学 报 40 卷
表 2 农杆菌侵染浓度和侵染时间对‘神韵’抗性愈伤组织
生成的影响
Table 2 Effect of infection concentration and time of Agrobacterium
on the resistant callus production rate of‘Shenyun’
侵染浓度/
OD600
concentration
侵染时间/
min
Infection
time
农杆菌污染程度
The contamination
degree of
Agrobacterium
抗性愈伤组织生成
率/%
The production rate
of resistant callus
0.2 5 无 None 0
10 无 None 0.2
15 低 Low 0.3
20 高 High 0.2
0.3 5 无 None 0.2
10 低 Low 0.6
15 较高 Higher 0.5
20 高 High 0
0.4 5 无 None 1.0
10 低 Low 5.0
15 高 High 0.6
20 高 High 0
0.5 5 低 Low 2.0
10 高 High 2.2
15 高 High 0.2
20 高 High 0
0.6 5 低 Low 1.2
10 高 High 0.5
15 高 High 0
20 高 High 0




图 5 表达载体 pCAMBIA1301-PMI-DFR
Fig. 5 Expression vector structure of pCAMBIA1301-PMI-DFR
2.3 甘露糖浓度对露地菊‘神韵’叶片分化的影响
将露地菊‘神韵’无菌苗叶片剪成小块后接种到不同的甘露糖和蔗糖配比浓度的分化培养基中，
通过观察不定芽的分化情况确定甘露糖的临界耐受浓度。结果表明，露地菊‘神韵’叶片外植体对
甘露糖的临界耐受浓度为 10 g · L-1（表 1）。10 g · L-1 的甘露糖浓度既可有效淘汰非转化植株，也
可避免甘露糖浓度过大对外植体造成伤害。

表 1 甘露糖浓度对露地菊‘神韵’叶片外植体不定芽分化的影响
Table 1 Mannose concentration on buds differentiation of‘Shenyun’
甘露糖/（g · L-1）
Mannose
接种外植体数
Number of explant
出芽外植体数
Number of buds
总芽数
Total number of all buds
分化率/%
Differentiation rate
增殖系数
Proliferation
0 61 56 448 91.8 8.0
5 60 45 234 75.0 5.2
10 60 40 132 66.7 3.3
15 58 0 0 0 0
20 60 0 0 0 0
25 60 0 0 0 0

2.4 农杆菌侵染浓度和侵染时间对露地菊‘神
韵’叶片分化的影响
农杆菌的侵染浓度和侵染时间是影响转化
效率的重要因素。菌液浓度过高会使叶盘褐化
甚至死亡；侵染时间过长，叶片外植体会由于
农杆菌毒害而缺氧软腐，失去分化能力。菌液
浓度过低，侵染时间过短，则减少了 T-DNA
的整合几率，从而降低转化率。
用不同浓度的农杆菌菌液对叶片外植体进
行不同时间的侵染。从表 2 可以看出，侵染露
地菊‘神韵’外植体的最适菌液浓度 OD600 =
0.4，侵染时间为 10 min。
2.5 转化植株的获得及分子检测
露地菊‘神韵’的叶片外植体在含有甘露
糖的脱毒筛选培养基上生长 15 ~ 30 d 后，叶片
边缘出现愈伤组织，进而在叶片四周可以诱导
产生不定芽。不定芽生长到一定大小后转至添
加了最适浓度甘露糖的 MS 培养基中进行生根
培养（图 6）。
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图 6 露地菊‘神韵’转化植株的获得
Fig. 6 The regeneration progress of‘Shenyun’transformed plants


以甘露糖筛选获得的‘神韵’抗性植株和野生型植株（wild type）的总 DNA 为模板，去离子水
为阴性对照，pCAMBIA1301-PMI-BrDFR 质粒为阳性对照，利用 PMI 全长基因引物进行 PCR 检测。
PCR 结果显示（图 7），只有 1、3、4、7 号抗性植株和阳性对照扩增出了约 1 100 bp 的目的条带。
选择 PMI 基因引物有扩增条带的抗性植株进行 BrDFR 基因的 PCR 检测（图 8），扩增后 1、3、4、
7 号抗性植株均有目的大小的片段产生；野生型‘神韵’植株阴性对照无扩增产物出现。综合分析
PMI 和 BrDFR 基因的 PCR 检测结果，初步认为 1、3、4、7 号抗性植株的基因组上已经整合了外源
BrDFR 基因。







利用 Hind Ⅲ酶切经过 PCR 验证获得的阳性转化植株的总 DNA，分别用 PMI 探针和 BrDFR 探
针进行 Southern 杂交检测。杂交结果如图 9 和 10 所示，4 号和 7 号转化植株基因组酶切产物可以同
图 7 PMI 基因 PCR 检测结果
M：Marker；1 ~ 7：抗性植株；8：阳性对照；
9：阴性对照；10：野生型植株。
Fig. 7 PCR detection of PMI gene
M：Marker；1–7：Resistant plant；8：Positive control；
9：Negative control；10：Wild type.
图 8 DFR 基因 PCR 检测结果
1、3、4、7：抗性植株；M：Marker。
Fig. 8 PCR detection of DFR gene
1，3，4，7：Resistant plant；M：Marker.
1524 园 艺 学 报 40 卷
时检测到 PMI 基因和 BrDFR 基因的杂交信号（图中箭头所示），说明外源 BrDFR 基因已经成功整
合到露地菊‘神韵’的基因组中，其拷贝数分别为 1。





3 讨论
相关报道表明，DFR 基因的异位表达可以改变转基因植株的花色。如豆类模式植物蒺藜苜蓿
（Medicago truncatula）的 MtDFR1 基因在烟草中过量表达可导致烟草的花色加深（Xie et al.，2004）。
蓝色花的夏堇栽培品种中内源 F3’H 和 F3’5’H 基因的敲除可以获得灰粉色花的株系，这种处理降低
了花青素和飞燕草色素的含量，同时增加了花葵素含量。这些植株中如果表达玫瑰的 DFR 基因，则
可以提高花葵素含量，产生深粉色花。利用天竺葵的 DFR 代替玫瑰的 DFR 基因，也可以使花瓣的
粉色加深（Nakamura et al.，2010）。这些研究结果为利用‘津田’芜菁 BrDFR 基因遗传转化露地
菊、丰富露地菊花色的研究奠定了理论基础。
露地菊‘神韵’离体再生体系的建立是进行遗传转化的前提。目前利用农杆菌介导技术向菊花
中转入外源基因已经被广泛应用。尽管如此，遗传转化效率仍取决于栽培品种的差异和再生程序的
优化（da Slilva et al.，2013）。刘军等（2004）指出，菊花遗传转化存在基因型依赖性、转化效率低、
再生困难、重复性差和转化细胞不易成苗等问题。因此，不同菊花品种再生和遗传转化体系的建立
是实现菊花大规模分子育种亟待解决的首要问题。参考前人的研究数据（王关林 等，2004），本研
究中通过不同的激素配比确定了露地菊‘神韵’的最佳离体再生条件。同时进行了甘露糖浓度测试
及农杆菌侵染时间等转化条件的优化。在此基础上，利用‘津田’芜菁 BrDFR 基因构建甘露糖筛选
的非抗生素型植物表达载体，通过农杆菌介导遗传转化露地菊‘神韵’，期望获得花色更丰富、环
境友好型的露地菊新品种。
以往的研究通常利用抗生素和除草剂等抗性基因作为植物遗传转化研究的标记基因，如 nptII、
hpt 和 Bar 等。由于携带抗性基因的转基因植物对自然环境存在潜在威胁，因此近年来，有的研究
人员在转化时使用标记基因，而在得到阳性转化植株后再通过各种技术手段去除标记基因（Lutz et
al.，2006；Kittiwongwattana et al.，2007）；还有一些研究者则利用双 T-DNA 载体系统有效地培育
无选择标记的转基因植物（辛翠花 等，2008；孙磊 等，2008；Sun et al.，2009）。目前，磷酸甘
露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase，PMI）作为有效的正向选择体系的安全标记基因，已
经在果树、水稻、棉花及番茄的遗传转化筛选中得到了应用。在甘露糖筛选体系中，转化细胞能够
图 9 PMI 探针的 Southern 杂交检测结果
M：Marker；1、3、4、7：转化植株。
Fig. 9 Southern blot result of PMI probe
M：Marker；1，3，4，7：Transformation plant.
图 10 DFR 探针的 Southern 杂交检测结果
1、3、4、7：转化植株。
Fig. 10 Southern blot result of DFR probe
1，3，4，7：Transformation plant.
8 期 许志茹等：露地菊离体再生体系建立及 BrDFR 基因遗传转化 1525

利用甘露糖作为碳源正常生长和再生，而未转化细胞则不能利用甘露糖从而抑制正常生长，以此可
以达到筛选阳性转化植株的目的（Ballester et al.，2008；王鸿和郝燕，2011），同时获得具有环境
安全性的新品系。安全标记基因 PMI 应用于菊花的遗传转化则刚刚起步。
本试验的研究结果表明，‘津田’芜菁 BrDFR 基因的非抗生素筛选的表达载体已经构建成功，
遗传转化露地菊‘神韵’后经 PCR 和 Southern 杂交验证显示，BrDFR 基因已经整合到露地菊‘神
韵’的基因组中。‘津田’芜菁 BrDFR 基因是否可以改变‘神韵’的花色形成还有待进一步的相关
试验验证。另外，露地菊品种‘神韵’组织培养体系的建立，也为通过转基因技术手段改变露地菊
花色、培育露地菊新品种奠定了基础。

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