全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（6）：1236–1244 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–12–13；修回日期：2014–04–10
基金项目：福建省科技厅区域重大项目（2010N3001）；福建农林大学园艺植物种质与高优生产技术创新团队项目（cxtd12013）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ynxtea@126.com，guixinchen@126.com；Tel：0591-83795093）
茉莉花香气相关基因 JsDXS 及其启动子的克隆
与表达分析
孙 君 1，陈桂信 1,*，叶乃兴 1,2,*，吕恃衡 1，刘志钦 3，黄 玮 1，林志达 1
（1 福建农林大学园艺学院，福州 350002；2 福建农林大学茶叶科技与经济研究所，福州 350002；3 福建农林大学生
命科学学院，福州 350002）
摘 要：以双瓣茉莉花瓣为材料，采用 RT-PCR 和 RACE 技术相结合的方法，获得茉莉花香气形成
限速酶即 5–磷酸脱氧木酮糖合成酶（Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase，DXS）基因（命名为 JsDXS）；
采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列；采用实时荧光定量 PCR 技术检测该基因在花瓣发育过程
中的表达动态。结果表明，JsDXS 全长 cDNA 为 2 505 bp，其中 ORF（Open Reading Frame）为 2 145 bp，
编码 714 个氨基酸，含有 TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-TK-like 和 Transketolase C 等保守功能结构域；分离
得到 JsDXS 基因上游调控序列 745 bp，其含启动子核心元件 TATA-box 及 T/GBOXATPIN2（茉莉酮酸酯
相关元件）、CIACADIANLELHC（生物钟相关元件）、MYCCONSENSUSAT（低温相关元件）等与花香
形成相关的重要顺式作用元件；荧光定量 PCR 分析表明，该基因在 18：00 时表达量较低，随着时间的推
移逐渐上调，到夜间 22：00 时表达量达到最高，逐渐又出现下调的趋势，直至凌晨 2：00 时表达量降到
最低，说明该基因的表达受生物钟的控制。
关键词：茉莉花；香气；5–磷酸脱氧木酮糖合成酶；启动子；顺式作用元件；表达分析
中图分类号：S 685.16 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1236-09

Cloning and Expression Analysis of Deoxyoxylulose-5-phosphate Synthase
Gene Related to Aroma from Jasminum sambac and Isolation of Its
Promoter
SUN Jun1，CHEN Gui-xin1,*，YE Nai-xing1,2,*，LÜ Shi-heng1，LIU Zhi-qin3，HUANG Wei1，and LIN
Zhi-da1
（1College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；2The Institute of Tea Science
and Technology and Economy，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；3College of Life Science，
Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）
Abstract：The full length cDNA sequence of Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase gene（JsDXS）
was cloned from Jasminum sambacby using RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends（RACE）
method. According to the 2 505 bp sequence，the promoter of JsDXS was isolated using Genome Walking
Method. The gene expression pattern in blooming was analyzed by the real-time PCR. Gene structure


6 期 孙 君等：茉莉花香气相关基因 JsDXS 及其启动子的克隆与表达分析 1237

analysis showed that the full length cDNA contained a 2 145 bp open reading frame（ORF），encoding a
protein of 714 amino acid. There were several conserved domains，such as TPP-DXS，TPP-PYR-DXS-
TK-like，Transketolase C，etc. One 745 bp sequence was found to be the promoter of JsDXS，which
contained many cis-acting elements，such as TATA-box，T/GBOXATPIN2（ related to jasmonate
signaling），MYCCONSENSUSAT（related to cold stress），CIACADIANLELHC（necessary for circadian
expression）. The real-time PCR analysis revealed that the gene expression at 18：00 was low and started to
increase and reached a maximum at 22：00，and then started to decrease and reached a minimum at 2：00.
This phenomenon perhaps illustrated that the expression of JsDXS was regulated by circadian.
Key words：Jasminum sambac；aroma；deoxyoxylulose-5-phosphate synthase；promoter；cis-acting
element；expression analysis

茉莉花[Jasminum sambac（L.）Ait]是木犀科（Oleaceae）素馨属（Jasminum）茶用香花植物。
茉莉花茶质量的优劣取决于花朵的质量，尤其是花朵中香气释放量与持续时间。前人对茉莉花品种
形态特征和香气特性做了大量研究（郭友嘉 等，1993，1994；张丽霞 等，2002；叶乃兴 等，2007；
杨江帆，2008；李鹤，2012），发现茉莉花香气成分中含芳樟醇、法呢烯、石竹烯、橙花叔醇、依
兰油烯、萜品醇等萜类化合物，烯萜类物质为茉莉花香气中最多的一大类。DXP（1–脱氧–D–木
酮糖–5–二磷酸）途径是 1 条类萜物质前体合成途径，提供萜类物质生物合成的基本骨架异戊烯基
焦磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（Dimethy lallyl diphosphate，DMAPP）。
DXS（5–磷酸脱氧木酮糖合成酶）在该途径中以丙酮酸和磷酸甘油醛为底物，生成 DXP，是该途
径中第 1 个限速酶，是萜类物质代谢工程的重要靶点（Estévez et al.，2001；潘夕春 等，2007），
对茉莉花萜烯类物质的形成具有重要作用。
DXS 最早从大肠杆菌中分离出来（Sprenger et al.，1997），在植物中最早得到 DXS 的是拟南芥
Arabidopsis thaliana 和胡椒薄荷 Mentha piperita（Lange et al.，1998），随后又从番茄 Solanum
lycopersicum（Lois et al.，2000）、甜叶菊 Stevia rebaudiana（Totté et al.，2003）、菊花 Chrysanthemum
morifolium（Kishimoto & Ohmiya，2006）、橡胶 Hevea brasiliensis（Seetang-Nun et al.，2008）、阳
春砂 Amomum villosum（Yang et al.，2012）等多种植物中克隆到，Muñoz-Bertomeu 等（2006）将拟
南芥 DXS 转入薰衣草（Lavandula angustifolia）后，其单萜烯精油的含量显著提高，子一代仍然具
有转基因亲本的特性，且形态和生长习性等均无变化。
本研究中以开放的双瓣茉莉花瓣为材料，采用 RT-PCR 和 RACE 技术，分离得到 JsDXS 全长
cDNA，对该基因进行生物信息学分析，找出 JsDXS 的功能结构域。采用染色体步移技术，分离 JsDXS
上游的启动子序列，发现启动子中含有多个与生物钟相关等顺式作用元件。采用荧光定量 PCR 技术，
分析 JsDXS 在花不同发育时期的表达模式，为将来深入研究 JsDXS 在茉莉花香气释放中的功能奠定
基础，以期为生产上调控茉莉花香强度和释香时间提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 茉莉花瓣总 RNA 及茉莉花基因组 DNA 的提取
茉莉花供试材料为双瓣茉莉花，于 2012 年 6 月取自福建农林大学茉莉花种质资源圃。
采用改良 CTAB 法提取茉莉花瓣总 RNA（郑鸿昌，2012）；采用 Biospin 植物基因组 DNA 提取
试剂盒（杭州博日科技有限公司 cat#BSC13S1）提取茉莉花基因组 DNA。
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1.2 JsDXS 保守区、5′RACE、3′RACE及全长 ORF 的 PCR 扩增
以茉莉花总 RNA 为模板，参考郑鸿昌（2012）的方法，合成双链 cDNA，于–20 ℃保存备用。
根据已报道的油橄榄（Olea europaea）、丹参（Salvia miltiorrhiza）、连翘（Forsythia suspense）、金
鱼草（Antirrhinum majus）等 DXS 基因序列，用 DNAMAN 设计出保守区简并引物。DXS-R：
5′-TGGGA(T/C)GT(C/T)GG(T/C)CA(C/T)CAG(G/T)(C/T)-3′；DXS-F：5′-GC(T/C)TC(G/A)TC(A/T)GA
(A/T)GGAGCCAT-3′。PCR 扩增体系：2.5 µL 10× Ex-Taq，Buffer（Mg2+ Plus），4 µL dNTPs（2.5
mmol · L-1），1 µL 模板，0.5 µL DXS-R，0.5 µL DXS-F，0.2 µL Ex-Taq 酶（5 U · µL-1），补 ddH2O 至
25 µL 体系。95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 30 s，53 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 90 s，35 个循环，最后
72 ℃延伸 10 min 进行 PCR 扩增。根据保守区克隆结果分别设计特异性 5′RACE 和 3′RACE 引物
（Primer Premier 5 软件）。5-DXS：5′-AGTAGTTCGTGTATGACTGAGTTGGTGC-3′；3-DXS：
5′-CATGCAAAGGGCTTATGACCAGGTAGTGC-3′ 。将保守区 PCR 体系中引物改为 0.5 µL
5-DXS/3-DXS，0.25 µL 接头引物 L4M，并补 ddH2O 至 25 µL，并将保守区 PCR 扩增程序中的退火
温度提高至 55 ℃进行 PCR 扩增。将获得的全长 cDNA，在其 ORF 两端设计特异引物（qDXS-R：
5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′；qDXS-F：5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′）
扩增全长序列。
1.3 JsDXS 启动子的分离
依据加拿大 Bio S & T Inc 的 Genome Walking kit 试剂盒，从起始密码子下游 200 bp 内设计 3 条
巢式引物（Primer Premier 5.0 软件）。DXS-a：5′-GTGAGTGATACTCTGCTCTTTCCGACAAGG-3′；
DXS-b：5′-CCCTGCTGCCCTCTTTCTTACCTGCTTA-3′；DXS-c：5′-AAACCCACTGTCTTGCTCAA
ATTCCCAG-3′。以茉莉花基因组 DNA 为模板，参照试剂盒说明书，以巢式引物和试剂盒配套引物
进行 3 轮 PCR 扩增。
1.4 PCR 产物纯化回收及克隆
将 1.2 和 1.3 所得 PCR 产物纯化回收并克隆至 pMD18-T 载体（TaKaRa），16 ℃连接过夜后进
行转化测序（北京六合华大基因有限公司）。
1.5 序列分析
JsDXS 基因序列通过在线 NCBI 的 Blast 功能进行氨基酸序列同源性比较；通过 Protparam 软件
对基因的分子量、等电点进行预测，初步分析目的基因的功能；通过 SignalP 4.1 进行信号肽预测；
通过 ProtComp Version 9.0 进行亚细胞定位预测；通过 TMpred 进行蛋白质跨膜结构的预测；通过在
线 SOPMA 预测蛋白质二级结构。
启动子序列通过在线 PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）及
Place 软件（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）预测其顺式作用元件（刘志钦 等，
2013）。
1.6 荧光定量 PCR 表达分析
分别提取 18：00、20：00、22：00、0：00、2：00 时的茉莉花瓣总 RNA，用逆转录试剂盒（TaKaRa）
反转录成 cDNA，稀释 10 倍作模板。以茉莉花 Actin 基因为内参（ActinⅠ：5′-CACTGCTGAGCGGG
AAATTGT-3′，ActinⅡ：5′-GATCCTCCAATCCAGACACTGT-3′）（欧雪凤，2012）。运用 Primer Premier
5.0 软件，按照荧光定量 PCR 引物设计原则，设计荧光定量 PCR 引物（rtDXS-R：5′-GTTGCTGTAA
6 期 孙 君等：茉莉花香气相关基因 JsDXS 及其启动子的克隆与表达分析 1239

TAGGCGATGGTG-3′，rtDXS-F：5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′）。参照 SYBR Prime
ScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa）说明书，进行荧光定量 PCR 扩增体系：cDNA 模板 1 µL，2×SYBR
Premix Ex-TaqTM 5 µL，上下游引物（10 µmol · L-1）各 0.2 µL，用 RNase-free H2O 补足至 10 µL。95
℃预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃复性 34 s，共 40 个循环。每份样品设 3 次重复。
试验数据应用 Microsoft Excel 2003 软件，采用 2-ΔΔCt 法计算其相对表达量；应用 SPSS 软件对
结果进行差异显著性分析。应用 Microsoft Excel 2003 软件作柱状图。
2 结果与分析
2.1 JsDXS 克隆及序列分析
茉莉花瓣总 RNA，28S 与 18S 亮度比约为 2︰1，总 RNA 较完整，可进行 RT-PCR 扩增等后续
试验。通过 RT-PCR 和 RACE 技术得到保守区 PCR 产物、5′RACE 和 3′RACE 的 PCR 产物，最终克
隆得到保守区 1 181 bp、5′RACE 片段 1 411 bp 和 3′RACE 片段 883 bp。利用特异性引物扩增其 ORF，
测序后其精确长度为 2 145 bp（图 1）。


图 1 茉莉花总 RNA 及从茉莉花中分离的 JsDXS 电泳图
M：Marker DL2000；1：总 RNA 电泳图；2：保守区扩增产物；3：5′RACE 扩增产物；4：3′RACE 扩增产物；
5：JsDXS ORF 全长扩增产物；6：JsDXS 启动子扩增产物。
Fig. 1 Result of RNA and amplification product of JsDXS from Jasminum Sambac
M：Marker DL2000；1：Result of RNA；2：Amplification product of conserved region；3：Amplification product of 5′RACE；
4：Amplification product of 3′RACE；5：Full-length amplification product of JsDXS ORF；
6：The promoter product of JsDXS .

将保守区、5′RACE 和 3′RACE 序列拼接，得到茉莉花 DXS 基因 cDNA 全长 2 505 bp（图 2），
包含 1 个完整的阅读框（232 ~ 2 380 bp），编码 714 个氨基酸，该基因含有起始密码子 ATG、终止
密码子 TAA、16 个 A 的 Poly A 尾巴和 AATAAA 加尾信号，并含有保守功能结构域 TPP-DXS、
TPP-PYR-DXS-TK-like 及 Transketolase-C。其相对分子量：76 768.0，分子式：C3396H5412N950O1010S33，
等电点：7.08，不稳定系数：39.28，属于稳定蛋白；带负电氨基酸总和（Asp + Glu）：73，带正电
氨基酸总和（Arg + Lys）：72；脂溶指数：90.90。其蛋白质二级结构中 38.74%为 α 螺旋，14.97%为
延伸链，7.13%为 β 转角，39.16%为无规则卷曲。无信号肽，亚细胞定位在细胞质，其蛋白质无跨
膜结构。
与其他植物氨基酸序列同源性为：丹参（Salvia miltiorrhiza）88%，橡胶树（Hevea brasiliensis）
87%、穿心莲（Andrographis paniculata）87%、杜仲（Eucommia ulmoides）87%、可可（Theobroma
cacao）86%、阳春砂（Amomum villosum）86%、檄树（Morinda citrifolia）72%、甜叶菊（Stevia rebaudiana）
72%、欧洲云杉（Picea abies）71%。
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图 2 JsDXS 基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
ATG：起始密码子；TAA：终止密码子；AATAAA：聚腺苷酸化加尾信号；TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-TK-like、Transketolase-C：保守域。
Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the JsDXS
ATG：Start anticodon；TAA：Terminate anticodon；AATAAA：The polyadenylation signal；
TPP-DXS，TPP-PYR-DXS-TK-like，Transketolase-C：Conserved domain.

2.2 启动子分离及顺式作用元件分析
将启动子 PCR 扩增产物（图 1）克隆测序，得到上游启动子调控序列 745 bp（图 3），含有与
茉莉酮酸酯相关元件T/GBOXATPIN2，脱落酸相关元件ABRE，生物钟相关元件CIACADIANLELHC，
低温相关元件MYCCONSENSUSAT，热激相关元件HSE，光响应相关元件GATABOX、SORLIP1AT、
TCT-motif，水杨酸相关元件 TCA-element，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶相关元件 CACTFTPPCA1，花粉
特异性相关元件 POLLEN1LELAT52，胚乳表达相关元件 Skn-1 motif 等。
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图 4 茉莉花开放过程中 JsDXS 基因表达分析
不同字母代表不同时刻间存在显著差异（P < 0.05）。
Fig. 4 Express analysis of JsDXS during blooming
The results with same letters are not significantly different at
P < 0.05 according to Duncan’s multiple-range test.

图 3 茉莉花 DXS 基因启动子序列及部分顺式作用元件
ABRE：脱落酸相关元件；CACTFTPPCA1：参与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反应；CIACADIANLELHC：生物钟相关元件；GATABOX、
SORLIP1AT、TCT-motif：光响应相关元件；HSE：热激相关元件；IBOXCORE、REBETALGLHCB2I：光敏色素调节元件；MYCCONSENSUSAT：
低温相关元件；POLLEN1LELAT52：花粉特异性相关元件；Skn-1 motif：胚乳表达相关元件；TCA-element：水杨酸相关元件；
T/GBOXATPIN2：参与茉莉酮酸酯反应相关元件。
Fig. 3 The promoter sequence of JsDXS and partial cis-acting elements
ABRE：Involved in the abscisic acid responsiveness；CACTFTPPCA1：Involved in phosphoenolpyruvate carboxylase responsiveness；
CIACADIANLELHC：Necessary for circadian expression；GATABOX，SORLIP1AT，TCT-motif：Related to light；
HSE：Involved in heat stress responsiveness；IBOXCORE，REBETALGLHCB2I：Involved in phytochrome regulation；
MYCCONSENSUSAT：Related to cold；POLLEN1LELAT52：Responsible for pollen specific activation；
Skn-1 motif：Required for endosperm expression；TCA-element：Involved in salicylic acid responsiveness；
T/GBOXATPIN2：Play a key role in jasmonate signaling.


2.3 相对荧光定量 PCR 表达分析
以茉莉花 Actin 为内参，采用实时荧光定
量 PCR 对茉莉花开放过程中 JsDXS 的表达进
行了分析，结果（图 4）表明，其表达量在
18：00 时较低，随着时间的推移，呈现上调趋
势，在 22：00 时达到最高，随后呈现下调趋势，
在 2：00 时最低。
3 讨论
DXS 是 DXP 途径的第一个酶，也是第一
个关键酶。研究表明，超量表达 DXS 可提高单
萜化合物、类胡萝卜素、萜类化合物和萜类吲
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哚生物碱的含量（Bouvier et al.，1998；Chahed et al.，2000；Lois et al.，2000）。本试验中克隆得到
茉莉花 JsDXS 全长 cDNA 2 505 bp，与同属植物丹参相似度最高为 88%，与其他植物如橡胶树（87%）、
穿心莲（87%）、杜仲（87%）、可可（86%）、阳春砂（86%）也有很高的同源性，与檄树（72%），
甜叶菊（72%），欧洲云杉（71%）同源性的也较高。JsDXS 含有功能保守域 TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-
TK-like、Transketolase-C，其中 Transketolase-C 认为是分子调控结合位点（Lindqvist et al.，1992；
Nikkola et al.，1994），说明 DXS 在长期进化中较保守。前人对 DXS 表达模式的研究多以不同组织
器官（空间）为对象，其表达的节律性（时间）还鲜有报道。本研究中得出茉莉花瓣 JsDXS 的表达
量在 18：00 时较低，随着时间的推移，呈现上调趋势，在 22：00 时达到最高，随后出现下调趋势，
在 2：00 时最低。在整个花开放的过程中，JsDXS 表达与茉莉花香强度呈现一定的关联，与李鹤（2012）
报道的双瓣茉莉花萜烯类香气物质在 17：00—03：00 这个时间段内所表现的趋势相一致，与茉莉花
香相关 CDS 和 HPL 基因的表达模式（欧雪凤，2012）也一致。
本研究中利用染色体步移方法分离得到 JsDXS 上游调控序列，其包含多个与茉莉生长发育及开
花密切相关的顺式作用元件。其中，T/GBOXATPIN2（Boter et al.，2004）与茉莉酮酸酯相关，而茉
莉酮酸酯类，包括茉莉酮酸（Jasmonic Acid，JA）和它的甲基酯（Methyl Jasmonate，MeJA）是许
多花和果实中芳香物质的成分之一（薛炳烨和姚胜蕊，1999）。王鑫威等（2011）、魏洁书等（2013）
对雨生红球藻及阳春砂 DXS 的研究表明 MeJA 对 DXS 表达有促进作用，茉莉酮酸酯与 DXS 及茉莉
花开花的相关性还需进一步深入研究探讨。茉莉花属于夜晚开花植物，DXS 上游调控序列中发现的
与生物钟相关元件 CIACADIANLELHC（Piechulla et al.，1998）及低温相关元件 MYCCONSENSUSAT
（Chinnusamy et al.，2003；Lee et al.，2005）可能诱导茉莉花在低温的夜晚开花。此外，该启动子
还含有与光响应相关元件 GATABOX、SORLIP1AT（Hudson & Quail，2003；Jiao et al.，2005），光
敏色素调节元件 IBOXCORE（Terzaghi & Cashmore，1995）、REBETALGLHCB2I（Degenhardt & Tobin，
1996）等，其具体与茉莉花开花及香气物质合成相关的元件还需进一步通过点突变来验证。JsDXS
是否调控茉莉花开花及花香物质合成还需对该基因进行转基因功能鉴定，构建启动子缺失载体和启
动子表达载体来研究启动子核心元件和组织表达部位。

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