全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（4）：765–772 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–12–17；修回日期：2014–02–26
基金项目：国家‘十二五’科技支撑计划项目（2011BAD11B01；2011BAD12B03）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目
（CARS-25）；山东省自主创新成果转化重大专项（2012ZHZX1A0409）；山东省蔬菜创新团队项目（SDAIT-02-022-08）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：qhshi@sdau.edu.cn；zhoubo2798@163.com）
肉桂酸降解真菌的筛选及其降解液对黄瓜种子
发芽的影响
孙 秀 1，王秀峰 1，魏 珉 1，王 芳 2，史庆华 1,*，周 波 2,3,*
（1 山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018；2 山东农业大学生命科学学
院，山东泰安 271018；3土肥资源高效利用国家工程实验室，山东泰安 271018）
摘 要：利用富集驯化培养、稀释涂布的方法，从连作黄瓜根际土壤中分离得到 1 株能降解肉桂酸
的真菌 2-4。该菌能够在以肉桂酸为唯一碳源的无机盐培养基上生长；经形态学、生理生化及分子等分类
方法鉴定其为黑曲霉（Aspergillus niger）。该菌不同培养时间的肉桂酸降解液对黄瓜种子发芽试验表明，
该菌可有效降解肉桂酸，从而缓解对黄瓜发芽的抑制作用，72 h 降解液处理的种子发芽率、发芽指数和
活力指数可分别达到对照的 100%、92.06%和 91.49%；胚根长、根表面积和根尖数达到对照的 84.19%、
87.55%和 82.64%，而胚轴长、鲜质量差异不显著。
关键词：黄瓜；肉桂酸；降解作用；黑曲霉；发芽
中图分类号：S 642.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）04-0765-08

Screening and Identification of Cinnamic Acid-degrading Fungis and the
Effect of Degradation Liquid on the Cucumber Germination
SUN Xiu1，WANG Xiu-feng1，WEI Min1，WANG Fang2，SHI Qing-hua1,*，and ZHOU Bo2,3,*
（1College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China；
2College of Life Science，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China；3National Engineering
Laboratory of High-efficiency Utilization in Soil and Fertilizer Resources，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：A fungi which is able to degrade cinnamic acid efficiently was isolated from cucumber
rhizosphere soil by using enrichment and dilution separation methods. This strain could use cinnamic acid
as the sole carbon source and was identified as Aspergillus niger by the morphological，biochemical
characteristics and molecule analysis. Seed germination treated with degradation liquid of different time
indicated that，this fungi could efficiently degrade cinnamic acid and alleviate the inhibition of cinnamic
acid on cucumber germination. Seed germination rate，germination index and vigor index could separately
reach 100%，92.06% and 91.49% compared with the controls in treatment with degradation liquid of 72 h.
Radicle length，radicle area and root tip number also reached 84.19%，87.55% and 82.64%，hypocotyl
length and fresh weight is not significant compared with the control.
Key words：cucumber；cinnamic acid；degradation；Aspergillus niger；germination

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黄瓜是设施栽培的主要蔬菜之一，连作障碍发生严重。通过茎叶挥发、淋溶、根系分泌以及植
株残茬的腐解等途径产生的化感物质的积累是黄瓜连作障碍发生的重要因素，酚酸类物质是目前报
道的蔬菜的主要化感物质（张淑香和高子勤，2000；吴玉光和肖强，2010）。当化感物质在土壤中累
积到一定程度后，不仅会对作物产生自毒作用，直接抑制作物生长，而且促进病原微生物的繁殖，
改变土壤微生物结构，导致土传病害加重（喻景权和杜尧舜，2000；Yu et al.，2003；马云华 等，
2005）。肉桂酸（CA）是黄瓜根系分泌产生的主要酚酸类物质之一，是很多化感研究中的模式酚酸
（吕卫光 等，2001；Ye et al.，2006；Wu et al.，2009；张韵，2009）。
近年来，利用假单胞菌、芽孢杆菌、木霉等作为植物根际促生菌或拮抗菌缓解连作障碍取得了
较大的进展，这些菌株的生物制剂也相继研发和应用（Zhang et al，2008；Ling et al.，2011； Li et al.，
2012）。另外，一些土著有益微生物能以酚酸物质为唯一碳源和能源生长。微生物降解被认为是酚酸
类物质在自然界中降解的一条有效途径，可通过降低作物根系土壤中酚酸浓度从而缓解其对作物产
生的自毒作用。因此，运用有益微生物进行生物降解酚酸物质的研究越来越受到重视（叶素芬，2004；
陈红歌 等，2006；Zhang et al.，2010；Chen et al.，2011）。
本试验中从黄瓜连作根际土壤中筛选出一株能降解肉桂酸的真菌，并利用其肉桂酸降解液处理
黄瓜种子，探究对肉桂酸的降解效果及降解中间产物有无毒性，为该真菌在缓解黄瓜连作障碍中的
应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 土样及试剂
土样采集于山东泰安市房村镇日光温室黄瓜连作地根际土。随机取黄瓜根系，收集根周围松散
的土壤，混合均匀后取约 100 g，置于无菌袋内带回实验室，4 ℃保存。肉桂酸（cinnamic acid）购
自天津市大茂化学试剂厂，分析纯。其它化学分析产品为国产试剂。黄瓜（Cucumis sativus L.）品
种为‘津研 4 号’。
1.2 培养基
无机盐培养基（MBM）：NH4NO3 1.0 g，MgSO4 · 7 H2O 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，
K2HPO4 1.5 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。
富集驯化、分离培养基：向上述无机盐培养基中加入肉桂酸，使其终浓度达到 0.5 ~ 2.0 mmol · L-1。
马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水 1 000 mL。
查氏培养基（CzA）：NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 · 7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4 · 7H2O
0.01 g，蔗糖 30 g，蒸馏水 1 000 mL。
以上液体培养基添加 2%琼脂则配成固体培养基，121 ℃灭菌 20 min，备用。
1.3 降解菌的分离筛选
采用梯度压力式富集驯化培养技术分离降解菌（王宗芹，2010）。取 10 g 土样加入到 90 mL 含
0.5 mmol · L-1 肉桂酸的无机盐培养基中，摇床（30 ℃，160 r · min-1）培养 4 d，以后每 4 d 从摇瓶
中取出 1 mL 土壤富集培养液加入到新的含肉桂酸无机盐培养基中，并相应提高肉桂酸浓度，驯化
梯度为 0.5 mmol · L-1→1.0 mmol · L-1→2.0 mmol · L-1。将最后 1 次的富集培养液稀释涂布于含 2.0
mmol · L-1 肉桂酸的无机盐培养基平板，不加肉桂酸的平板为对照。每个稀释浓度重复 3 次，于 30 ℃
恒温培养箱培养。待长出明显菌落后挑取真菌菌落于 PDA 平板分离纯化、含肉桂酸的无机盐平板中
4 期 孙 秀等：肉桂酸降解真菌的筛选及其降解液对黄瓜种子发芽的影响 767

划线驯化多次。挑取单一菌落接种于 PDA 培养基斜面，30 ℃培养 48 h 以上，4 ℃保存。
1.4 降解菌的鉴定
接种降解真菌于 PDA、CzA 和含肉桂酸的 MBM 培养基平板上 30 ℃培养 7 d，观察菌落培养
特征；取少量菌体，于光学显微镜和电镜下观察真菌菌丝有无隔膜，分生孢子及孢子头类型，分生
孢子梗、顶囊、小梗等的特点；同时进行了不同碳氮源利用、接触酶、氧化酶、明胶水解等生理生
化试验（魏景超，1979；齐祖同，1997）。
利用试剂盒法提取真菌基因组 DNA。以提取到的 DNA 为模板，PCR 扩增真菌 rDNA-ITS 全序
列。PCR 引物为 ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
PCR 反应体系：模板 DNA 2.0 μL、上下游引物各 1.0 μL、2.5 mmol · L-1 dNTP 2.0 μL、5 U · μL-1 Taq
polymerase 1 μL、10× PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol · L-1 Mg2+ 2 μL、ddH2O 13.5 μL。PCR 反应条件：
94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 50 s，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，循环 34 次；72 ℃后延
伸 10 min。4 ℃保温（Henry et al.，2000）。
将 PCR 产物用 1%凝胶进行电泳 35 min，用 EB 染液进行后染 15 min，然后在凝胶成像仪上进
行显影成像，检测是否扩增出目的条带。扩增产物送往北京六合华大基因科技股份有限公司进行测
序，将测得的序列提交到 NCBI 的 GenBank，通过 BLAST 程序进行同源性比对，并利用 MEGA5.05
软件构建系统发育树。
1.5 肉桂酸降解液对黄瓜种子发芽的影响
用移液管向保存肉桂酸降解真菌的 PDA 斜面加入 5 mL 灭菌无机盐培养基，然后用接种环将菌
株孢子刮起，再用移液管吹吸数次，混匀，洗液倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，在 160 r · min-1
的摇床中充分振荡 30 min，制得单孢子悬液，通过血小球计数板控制孢子浓度在 1 × 107 cfu · mL-1，
作为接种液备用（王宗琴，2010）。
取单孢子悬液 2 mL，接种于 100 mL 含 2.0 mmol · L-1肉桂酸的无机盐液体培养基中摇床培养（30
℃，160 r · min-1），分别于 0、24、48 和 72 h 取肉桂酸降解液，清水作空白对照。所有处理按 0.8%
量加入琼脂粉，分装于组培瓶中，121 ℃灭菌 20 min。将‘津研 4 号’黄瓜种清水浸种 6 h，4%次
氯酸钠消毒 15 min，无菌操作台接入不同处理组培瓶，每瓶 15 粒种子，每个处理接种 4 瓶，3 次重
复。28 ℃避光条件下萌发。
以种子露白 ≥ 1/2 种子长为萌发标准，24 h 统计发芽势，48 h 统计发芽率，发芽势（率，%）=
（发芽种子数/供试种子数）× 100。发芽指数 = ∑（Gt / Dt），活力指数 = S × ∑（Gt/Dt），Gt 为 t
天的发芽数，Dt 为发芽日数，S 为胚根和胚芽的鲜质量（李延 等，2010）。发芽 4 d 时测量幼苗的
胚轴和胚根长度及鲜质量。胚根平铺于透明硬塑料膜上，用 NUScan700 平板扫描仪进行扫描，记
录幼苗的根表面积和根尖数（张江红 等，2007）。
数据整理采用 Microsoft Excel（Office 2003）软件完成；采用 DPS 软件对数据进行方差分析及
最小显著差异性检验（Duncan’s 新复极差法，P < 0.05）。
2 结果与分析
2.1 肉桂酸降解真菌的获得
以肉桂酸为唯一碳源，经富集驯化、分离纯化，共分离得到肉桂酸降解真菌 15 株，均能在含
肉桂酸的无机盐培养基平板上传代培养。其中真菌 2-4 生长较快，菌落分布较多，在液体发酵降解
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体系中表现较高的降解速率，72 h 已基本将肉桂酸降解完全。将降解真菌 2-4 接种于 PDA 斜面，4 ℃
保存，用于进一步鉴定。
2.2 降解真菌 2-4 的鉴定
2.2.1 形态学及生理生化特性
将降解真菌 2-4 接种于 3 种培养基上 30 ℃培养 7 d，其形态学特征如图 1 所示：在 PDA 平板
上，菌落厚绒状，黑褐色，有晕圈，中央部分凸起有少量白色絮状物，反面无色；在 CzA 平板中菌
落暗褐色，边缘白色不规则，反面黄褐色，有皱褶；在含肉桂酸的 MBM 平板中菌落稀疏，黑褐色，
孢子量少。

图 1 降解真菌 2-4 形态特征观察
Fig. 1 The morphological observation of 2-4 strain

取少量菌体，于光学显微镜和电镜下观察，如图 2 所示：菌丛呈黑褐色，顶囊大球形，小梗双
层，分生孢子大量，孢梗茎大小为 1 200 ~ 2 500 µm × 12 ~ 20 µm；孢子大小 2.73 ~ 4.54 µm，球形
或近球形。


图 2 降解真菌 2-4 显微（左）和扫描电镜（右）观察
Fig. 2 The microscopic（left）and scanning electron microscopy（right）observation of 2-4 strain

生理生化特性如表 1 所示，降解真菌 2-4 对表中所列碳源都能利用，在葡萄糖、麦芽糖、蔗糖
上生长最好；既能利用硝态氮，又能利用铵态氮，且有机氮源比无机氮源生长好；V-P、接触酶和
氧化酶试验表现出阴性反应，其他生理生化试验为阳性反应。
根据以上菌落培养、显微特征和生理生化特性，参照《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）和中
国真菌志（齐祖同，1997）进行对比分析，降解真菌 2-4 符合曲霉属的生长特性，可初步鉴定为半
知菌亚门（Fungi Imperfecti）丝孢纲（Hyphomycetes）丛梗孢目（Hyphomycetales）丛梗孢科
（Moniliaceae）曲霉属（Aspergillus）。
4 期 孙 秀等：肉桂酸降解真菌的筛选及其降解液对黄瓜种子发芽的影响 769

图 3 降解真菌 2-4 rDNA-ITS 序列 PCR 扩增产物电泳图
1、2：PCR 扩增产物；M：DNA marker DL2000。
Fig. 3 The electrophoregram of the rDNA-ITS sequence of
PCR product of 2-4 strain
1，2：PCR products；M：DNA marker DL2000.
表 1 降解真菌 2-4 生理生化试验结果
Table 1 Results of physiological and biochemical tests of 2-4 strain

2.2.2 分子鉴定
肉桂酸降解真菌 2-4 PCR 扩增产物电泳图
见图 3，其大小在 500 ~ 750 bp 之间；测序结
果表明，rDNA-ITS 全序列 593 bp。该菌保藏
于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物
中心，保藏编号为 CGMCC6758，其基因序
列已提交到 NCBI 的 GenBank 上，登录号为
KJ101598。
肉桂酸降解真菌 2-4 的基因序列与
GenBank 中相关序列 BLAST 比对，与已发表
的相关曲霉属（Aspergillus sp.）菌株的序列同
源性为 99%；利用 MEGA5.05 软件构建以曲霉
属 rDNA-ITS 序列为基础的系统发育树如图 4 所示，肉桂酸降解真菌 2-4 与黑曲霉（Aspergillus niger
DQ196196）的进化距离最近。结合形态学及生理生化特性，最终将肉桂酸降解真菌 2-4 鉴定为曲霉
属黑曲霉（Aspergillus niger）。


图 4 2-4 菌株基于曲霉属 rDNA-ITS 序列的系统发育树（括号内为基因登录号）
Fig. 4 Phylogenetic tree of 2-4 strain based on Aspergillus rDNA-ITS sequence（Accession numbers in parentheses）

2.3 降解真菌 2-4 肉桂酸降解液对黄瓜种子发芽的影响
2.3.1 种子发芽
降解真菌 2-4 肉桂酸降解液对黄瓜种子发芽结果见图 5，0 h 降解液（即含 2.0 mmol · L-1 的肉桂
酸）显著抑制了黄瓜种子的萌发，而随着降解时间的增加，降解液对黄瓜种子的抑制效果逐渐降低。
碳源
Carbon source
生长状况
Growth

氮源
Nitrogen source
生长状况
Growth
其他指标
Other indexes
生长状况
Growth
葡萄糖 Glucose 良好 Good 硫酸铵 （NH4）2SO4 中等 General V-P –阴性 Negative
麦芽糖 Maltose 良好 Good 氯化铵 NH4Cl 中等 General 吲哚试验 Indole test + 阳性 Positive
蔗糖 Sucrose 良好 Good 硝酸铵 NH4NO3 中等 General 甲基红试验 MR test + 阳性 Positive
乳糖 Lactose 差 Poor 硝酸钠 NaNO3 中等 General 接触酶试验 Catalase test –阴性 Negative
甘露醇 Mannitol 中等 General 酵母粉 Yeastpowder 良好 Good 氧化酶试验 Oxidase test –阴性 Negative
山梨醇 Sorbitol 差 Poor 蛋白胨 Peptone 良好 Good 硝酸盐还原 Nitrate reduction + 阳性 Positive
可溶性淀粉 Soluble starch 中等 General 牛肉膏 Beef extract 良好 Good 明胶水解 Gelatin liquefaction + 阳性 Positive
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从表 2发芽指标看，0 h和 24 h降解液处理对种子发芽势产生 100%抑制作用，发芽率虽然达到 81.11%
和 96.67%，但是胚芽生长明显受抑制；而 72 h 降解液处理的种子发芽率与无肉桂酸的清水对照相
同，达 100%，发芽指数和活力指数指标接近对照，分别达到了对照水平的 92.06%和 91.49%。


图 5 降解真菌 2-4 肉桂酸降解液对黄瓜种子发芽的影响
Fig. 5 The effect of degradation liquid of 2-4 strain on the cucumber seed germination


表 2 降解真菌 2-4 肉桂酸降解液对黄瓜种子发芽的结果
Table 2 The result of degradation liquid of 2-4 strain on the cucumber seed germination
降解时间/h
Degradation time
发芽势/%
Germination potential
发芽率/%
Germination rate
发芽指数/（buds · d-1）
Germination index
活力指数/（buds · d-1）
Vigor index
对照 Control 71.12 ± 6.89 a 100.00 ± 0.00 a 23.17 ± 1.03 a 7.05 ± 0.31 a
0 0 d 81.11 ± 9.81 b 11.25 ± 0.94 d 0.83 ± 0.07 e
24 0 d 96.67 ± 3.65 a 12.25 ± 0.27 d 1.21 ± 0.03 d
48 22.22 ± 8.07 c 97.78 ± 3.44 a 15.67 ± 1.21 c 3.32 ± 0.26 c
72 58.89 ± 5.02 b 100.00 ± 0 a 21.33 ± 0.75 b 6.45 ± 0.23 b
注：同列不同小写字母表示处理间达 P < 0.05 水平显著差异，每个处理 3 次重复。
Note：Different small alphabets represent significant difference at P < 0.05 level in the column. Each treatment repeated three times.

2.3.2 幼苗生长
从表 3 可以看出，0 h 降解液处理（即含 2.0 mmol · L-1 的肉桂酸）显著抑制了胚根和胚轴的生
长发育。随着降解时间的增加，黄瓜幼苗鲜质量、胚根和胚轴长、根尖数及根表面积均呈显著升高
的趋势；72 h 处理对黄瓜胚根比对胚轴的影响大，胚根长、根表面积和根尖数达到对照的 84.19%、
87.55%和 82.64%，胚轴长、鲜质量与对照差异不显著。

表 3 降解真菌 2-4 肉桂酸降解液对黄瓜幼苗生长的结果
Table 3 The result of degradation liquid of 2-4 strain on the growth of cucumber seedlings
降解时间/h
Degradation time
胚根长/cm
Radicle length
胚轴长/cm
Hypocotyl length
鲜质量/g
Fresh weight
根表面/cm2
Radicle area
根尖数
Root tip number
对照 Control 8.29 ± 0.69 a 7.65 ± 0.23 a 0.30 ± 0.01 a 7.15 ± 0.32 a 374.74 ± 6.20 a
0 0.81 ± 0.05 e 0.84 ± 0.07 d 0.07 ± 0.01 d 1.68 ± 0.15 e 67.60 ± 5.13 e
24 1.52 ± 0.21 d 1.45 ± 0.11 c 0.10 ± 0.01 c 2.32 ± 0.04 d 87.14 ± 6.23 d
48 3.95 ± 0.42 c 6.93 ± 0.46 b 0.21 ± 0.03 b 3.86 ± 0.16 c 167.34 ± 2.47 c
72 6.98 ± 0.38 b 7.85 ± 0.75 a 0.30 ± 0.02 a 6.26 ± 0.29 b 309.67 ± 4.93 b
注：同列不同小写字母表示处理间达 P < 0.05 水平显著差异，每个处理 3 次重复。
Note：Different small alphabets represent significant difference at P < 0.05 level in the column. Each treatment repeated three times.
3 讨论
有关酚酸降解研究中，大部分菌株是从污水或非黄瓜连作土壤筛选，得到的不一定是黄瓜根际
中土著微生物，而且曲霉的研究报道较少。曲霉属真菌是自然界分布最普遍的腐生菌类之一，是一
4 期 孙 秀等：肉桂酸降解真菌的筛选及其降解液对黄瓜种子发芽的影响 771

种环境友好微生物。对曲霉属黑曲霉降解性能方面，更多的是各种纤维素及有机磷农药等降解的研
究，而关于黑曲霉在酚酸降解和黄瓜连作障碍克服中的应用尚未见报道（徐升 等，2004；王志龙 等，
2013）。本研究中从黄瓜日光温室连作根际土中分离筛选得到了 1 株肉桂酸降解真菌 2-4，经形态学、
生理生化及分子等多相分类法鉴定为曲霉属黑曲霉（Aspergillus niger）。该真菌能以肉桂酸为唯一碳
源生长，且液体发酵中具有较高的降解肉桂酸的能力，为其应用于酚酸类物质的生物降解提供了良
好的菌种资源；同时本实验室对该菌降解特性研究结果表明，其可在较宽的温度、pH 值和肉桂酸浓
度条件下生长，还可以广谱降解其他酚酸类物质，具有较强的环境耐受力。
种子萌发及种子萌发后的生长是植物生长发育过程中的关键阶段，许多研究结果表明植物种子
萌发及萌发后的生长阶段要比其他生长发育阶段对化感物质更为敏感，肉桂酸对不同种子的发芽率
及萌发后生长都存在显著的抑制作用（张韵，2009）。因此，本研究中利用肉桂酸降解液处理黄瓜种
子，通过种子发芽进一步验证了筛选获得的肉桂酸降解真菌 2-4 对肉桂酸的降解效果，同时为在黄
瓜生产中的后续应用提供理论依据。试验处理中，为消除菌体吸附作用造成肉桂酸降解液浓度降低
的影响，未将菌体和降解液分离，而是通过高压灭菌法使菌体失活，一起处理黄瓜种子。试验结果
表明，降解真菌 2-4 的 0 h 降解液（即含 2.0 mmol · L-1 肉桂酸）对黄瓜种子的萌发表现出显著抑制
作用，而随着降解时间的增加，24、48 和 72 h 降解液处理对黄瓜种子萌发及幼苗生长的抑制作用
逐渐降低，72 h 降解液处理的发芽指标、幼苗生长量等都基本恢复到无肉桂酸的清水对照水平，因
此该菌对肉桂酸具有良好的降解效果且降解产物无明显毒性，但要保证其应用后的安全性，还应对
其降解肉桂酸的途径及机制作进一步研究。
综上所述，通过微生物代谢途径降低酚酸累积的问题是可行的，利用该降解真菌黑曲霉进一步
研制开发酚酸降解专用微生物菌肥，缓解黄瓜连作障碍可能会有较高的应用价值。但由于土壤环境
的复杂性，该菌在土壤中的定殖能力及根系周围原位降解酚酸的效果，还需进一步验证。

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