全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（5）：861–868 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–01–13；修回日期：2012–03–29
基金项目：辽宁省农业科技攻关项目（2011215003）；国家自然科学基金项目（31101524）；辽宁省教育厅高校科研项目（2008629）
* E-mail：yuexueliu007@yahoo.com.cn
草莓 LFY 同源基因的克隆及其表达分析
刘月学*，邹冬梅，李 贺，张志宏，马 跃，代红艳
（沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110866）
摘 要：以草莓（Fragaria × ananassa）品种‘花姬’为试材，通过 PCR 和 RACE 的方法克隆出 LFY
同源基因的 cDNA 全长序列，命名为 FaLFY（GenBank 收录号 JN788260），通过定量 PCR 的方法检测了
该基因在草莓植株各组织和花器官中的表达。结果表明 FaLFY 编码区长度为 1 236 bp，编码 412 个氨基
酸，与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性，其中与蔷薇科玫瑰的 LEAFY-1 同源性最高，达到 88%。
实时定量 RT-PCR 结果表明，在不同的组织、不同的花器官中 FaLFY 的表达量存在差异，其中在花芽中
的表达量最高，在营养生长的组织中基本不表达，在成熟花器官中同样不表达，说明该基因在草莓的成
花进程中发挥重要作用。
关键词：草莓；LFY；同源基因；分离；表达
中图分类号：S 668.4 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）05-0861-08

Isolation and Expression Analysis of LFY Homologue from Strawberry
LIU Yue-xue*，ZOU Dong-mei，LI He，ZHANG Zhi-hong，MA Yue，and DAI Hong-yan
（College of Horticulture，Shenyang Agriculture University，Shenyang 110866，China）
Abstract：The LFY homologue named FaLFY was isolated from strawberry（Fragaria × ananassa
‘Huaji’）with the method of RT-PCR and RACE. Its expression pattern in different tissues and floral
organs was checked with qRT-PCR. The CDS of FaLFY is 1 236 bp in length and it codes a predicted
protein of 412 amino acids. The amino acid identity compared with other LFY homologues is highly
conserved and shows the highest similarity（88%）with the LEAFY-2 of Rosa canina. The real-time
RT-PCR result showed that FaLFY mainly transcripts in reproductive tissues，especially in flower buds，
no transcription was detected in vegetative tissues，neither in the four whorls of flower organs. The results
showed that FaLFY play an important role in the processing of flowering in strawberry.
Key words：strawberry；LFY；homologue gene；isolation；expression

草莓花芽分化的时间、花芽分化的数量和质量都直接影响到果实上市时间及其质量和数量，造
成巨大的价格差异。目前多从生理角度和栽培角度来阐述外界因素对草莓花芽分化的影响（Taylor，
2000），对其成花的分子调控机理研究甚少。
通过对拟南芥等植物的研究发现 LEAFY（LFY）及其同源基因编码转录因子的激活蛋白，是花
形成的最早标记基因之一，它的表达是花形成的充分且必要的条件，起到基因开关的作用；其在从

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营养生长转入生殖生长的过程中发挥重要作用，并且正向调节随后的花器官特征基因如 AP1、AG
等的启动（Weigel & Meyerowitz，1993；Weigel & Nilsson，1995；Wagner et al.，1999）。研究表明
LFY 同源基因的组成型表达可以诱导一年生或多年生植物的提早开花（Weigel & Meyerowitz，1993;
Pena et al.，2001），除在野生草莓 EST 中有过报道外（Mouhu et al.，2009），目前栽培草莓中未
见相关基因的研究报道。
草莓成花条件与模式植物拟南芥差异很大，如在光照需求方面，拟南芥是长日照植物，而大部
分栽培草莓的成花需要短日照（Wiseman & Turnbull，1999；Heide & Sønsteby，2007）；GA 在拟
南芥成花中起诱导作用，而在草莓上则表现出抑制成花，促进匍匐茎抽生（Avigdori-Avidov et al.，
1977；Chroma & Himelrick，1984）。这说明草莓的成花分子机制与拟南芥存在一定的差异。为深
入了解草莓成花的机制，有必要分离与成花相关的重要基因，开展其分子机理方面的研究。
鉴于 LFY 及其同源基因在高等植物的成花过程中的重要作用，进行栽培草莓中该同源基因的分
离及相关研究，以期为深入了解草莓的成花分子机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
草莓（Fragaria × ananassa）栽培品种‘花姬’栽培于沈阳农业大学草莓试验园，常规栽培管
理。取幼嫩叶片，用改进的 CTAB 法提取 DNA 并纯化，作为 DNA 模板；用改进的 CTAB 法提取花
芽总 RNA 作分离基因的 RNA 模板；再分别取叶片、叶芽、花芽、幼蕾、成花及萼片、花瓣、花药、
匍匐茎，用 CTAB 法抽提其总 RNA，用作其表达分析的 RNA 模板。于 2010 年 1—5 月间进行取样，
每份样品约 1 ~ 5 g，重复 3 次。所用试材取回后用液氮速冻，然后于–80 ℃超低温冰箱中保存。
1.2 方法
1.2.1 总 DNA与 RNA的提取
总 DNA 与总 RNA 的提取采用 CTAB 法（肖敏 等，2005；李贺 等，2009）。利用 1.0%琼脂
糖凝胶电泳检测总 DNA 与 RNA 的完整性，用 DU800 核酸蛋白分析仪（Beckman Coulter，USA）
检测核酸的纯度。
1.2.2 基因片段的克隆
在比较其他物种上已克隆的花分生组织特征基因 LFY 同源基因序列的保守区后，设计 1 对简并
引物（表 1），以草莓基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增。
PCR 反应体系为：10 × PCR 缓冲液 2.5 μL、dNTP 混合物（各 2.5 mmol · L-1）2.0 μL、上游引
物（10 μmol · L-1）1.0 μL、下游引物（10 μmol · L-1）1.0 μL、模板 DNA 1.0 μL、Taq 酶（5 U · μL-1）
0.25 μL，加灭菌双蒸水至总体积 25 μL。扩增程序：94 ℃变性 5 min 后，按 94 ℃ 40ｓ；60 ℃ 60ｓ；
72 ℃ 60ｓ进行 35 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min 结束。
1.2.3 RACE方法获得 FaLFY cDNA序列
参照 Invitrogen 5′RACE SYSTEM VERSION 2.0 试剂盒说明书的步骤进行 5′RACE，相应药品及
接头引物均购自 TaKaRa 公司。
利用TaKaRa的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒进行 3′RACE，根据试剂盒的方法得到 cDNA
模板，结合巢式 PCR 进行。3′RACE 扩增 PCR 反应体系：10 × PCR 缓冲液 2 µL；dNTPs（各 2.5
mmol · L-1）1.6 µL；3′-RACE-Ready cDNA 模板 0.5 µL；上游引物：0.5 µL；下游引物 M13 Primer M4：
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0.5 µL；Taq 酶 0.2 µL；加无菌水至 20 µL，PCR 反应程序按说明书操作。5′RACE 与 3′RACE 所用
特异引物根据扩增获得的片段编码区设计，通用引物由试剂盒提供，具体序列见表 1。
1.2.4 FaLFY全长序列的获得
综合 RACE 等 PCR 结果，根据拼接得到的序列分析后设计一对用来扩增该基因编码区全长的
特异 PCR 引物（表 1）。
该基因编码区 cDNA 全长的扩增以花芽总 RNA 反转录后得到的第一链 cDNA 为模板，进行特
异 PCR 扩增，反应体系为 1 μL cDNA 加入 ExTaq DNA 聚合酶 0.2 μL，缓冲液 2 μL，dNTPs 1.6 μL，
正反向引物各 1 μL，最后用水补足到 20 μL。PCR 反应程序为 94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 1 min，
72 ℃ 1.5 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。用含 EB（0.5 μg · mL-1）的 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增
产物。反转录参照 PrimeScript 1 Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）的方法进行。
该基因编码区 DNA 全长的扩增以基因组 DNA 为模板，其它条件与步骤同上。
1.2.5 序列测定和分析
利用 DNA 凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收扩增片段，与 pGM-T 载体连接，然后转化大肠
杆菌 TOP10 感受态细胞，通过蓝白斑筛选 PCR 鉴定阳性克隆，测序工作委托华大基因公司进行。
DNA 凝胶回收试剂盒购自 AXYGEN 公司，pGM-T 载体购自天根公司，其它药品为国产分析纯。利
用 NCBI BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对测序结果进行检索 DNAMAN6.0 进行序
列分析和氨基酸翻译，用 Clustal X1.83 进行多序列比对，MEGA4 软件 1 000 次重复计算构建 NJ 树。
1.2.6 实时定量RT-PCR
取各试材的总 RNA，以 Oligo-d（T）为引物，用 AMV 反转录酶进行反转录，参照 PrimeScript
1 Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）方法进行。用反转录后的 cDNA 作模板。为了提高荧光信号
的特异性，设计实时定量 PCR 特异引物（LFY-F1 和 LFY-R1）（表 1），扩增长度 195 bp。

表 1 引物序列
Table 1 Primers used in this study
用途 引物 序列（5′→3′）
Use Primer Sequence（5′→3′）
FaLFY 基因片段的分离 LFYPF GARGTGGCGCGCGTGGSAARAAGAA
Isolation of FaLFY fragments LFYPR CAGAGYTTGGTGGGMACRTACCA
3′RACE LFYF-1 GARGTGGCGCGCGTGGSAARAAGAA
Rapid amplification of cDNA 3′ ends LFYF-2 TACGAGCAGTGCCATCAGTTTCT
LFYF-3 GAGCGAACTACATCAACAAGCCG
M13 Primer M4 GTTTTCCCAGTCACGAC
5′RACE LFY-R-1 CCTGTAGCACGCCTGCCTCCACG
Rapid amplification of cDNA 5′ ends LFY-R-2 TCCACGCCCCGATGTTCTCT
LFY-R-3 GGCTTGTTGATGTAGTTCGCTC
LFYR-4 CTACTCCTATGCCCACCACCT
LFYR-5 CCTCTCTTGTTGCACCGGCTC
LFYR-6 CTCCTCAAGTCGTCTCTTCTCAG
LFYR-7 CTCCGCTATTCTTGCCGCCGTGT
FaLFY CDS 全长扩增 LFYQF ATGGATCCAAACGCGTTCACT
Amplification of full-length CDS of FaLFY LFYQR TCAGTAGGGAAGCGGATCAGT
FaLFY 实时定量 RT-PCR LFY-F1 AGGGTATTGATGGTGATG
Real-time RT-PCR of FaLFY LFY-R1 CGTAGAGATGGAAGAGGTAA
18S 实时定量 RT-PCR 18S-F GTAGTCATATGCTTGTCT
Real-time RT-PCR of 18S 18S-R GAATGATGCGTCGCCAGCACAAAGG

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琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，LFY-F1 和 LFY-R1 只扩增出预期大小的片段，而且没有引物二
聚体。实时定量 PCR 的反应体积为 20 μL，包括 1 μL cDNA（RNA 为 2 μg），10 μL 2.5 × Mix，浓
度为 10 μmol · L-1 的正反向引物各 1 μL，剩余体积用超纯水补足至 20 μL。每个反应重复 3 次。定
量 PCR 反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 个循环。定量 PCR 试剂 2.5 ×
real Master Mix（Cat#FP202-02）购自天根公司。使用 BIO-RAD 公司 CFX96 定量 PCR 仪，八联排
管完成 PCR 反应。以草莓 18S rRNA 作为内参基因，清水模板为阴性对照，采用 2-△△CT法计算相对
表达量的高低。
2 结果与分析
2.1 草莓 LFY 基因片段的分离
在对 NCBI 的 EST 数据库中栽培草莓 EST 数据进行检索时未发现与 LFY 同源基因有关的信息。
在比较其他物种已克隆的花分生组织特征 LFY 同源基因序列的保守区后设计了 1 对简并引物，以草
莓基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，得到一条长约 1 000 bp 的特异条带（图 1，A）。测序结果
表明，该片段长度是 986 bp，与野生草莓、苹果及烟草等的 LFY 同源基因都有一定的同源性，表明
该片段是 LFY 的同源基因片段。

图 1 草莓 LFY 基因扩增结果
A：FaLFY 特异片段扩增产物；B：3′RACE 扩增产物；C：5′RACE 第 1 次扩增产物；D：5′RACE 第 2 次扩增产物；E：5′RACE 第 3 次
扩增产物；F：FaLFY 编码区全长扩增产物；G：FaLFY DNA 全长扩增产物；M 为 DL2000 marker。
Fig. 1 Products of amplification of LFY gene from strawberry
A：Amplification product of FaLFY fragment；B：3′RACE amplification product；C：The first amplification product of 5′RACE；D：The second
amplification product of 5′RACE；E：The third amplification product of 5′RACE；F：Full-length amplification product of FaLFY CDS；
G：Full-length amplification product of FaLFY DNA sequence；M is DL2000 marker.
5 期 刘月学等：草莓 LFY 同源基因的克隆及其表达分析 865

2.2 草莓 LFY 基因 cDNA 和 DNA 序列全长的获得与分析
基于已获得的草莓 LFY 同源基因片段，设计 3 条巢式引物进行 3′RACE，得到 1 条约 750 bp 的
特异谱带（图 1，B），克隆后测序结果表明该片段有效长度为 554 bp，其中包含 15 个碱基的 polyA
尾巴和 3′端接头引物序列，说明已经到达 3′末端。再利用 3′RACE 所得序列为基序设计的 3 个巢式
引物进行 5′RACE 扩增，得到 1 条约 600 bp 的特异谱带（图 1，C），克隆后测序结果表明该片段
长度为 451 bp，除去接头引物序列后得到一条长度为 425 bp 的序列片段，但没有到达起始密码子位
置。再以第 1 次 5′RACE 所得序列为基序设计巢式引物，又依次进行了第 2 次与第 3 次 5′RACE 扩
增，分别得到一条 600 bp 和 300 bp 左右的特异谱带（图 1，D 和图 1，E），克隆后测序分别得到
628 bp 和 299 bp 的序列，除去接头引物序列后在 5′端 93 bp 处发现起始密码子。
利用 5′RACE 和 3′RACE 得到的序列进行拼接，得到 1 条完整的 cDNA 序列，长度为 1 534 bp。
在此基础上在 5′端和 3′端分别设计引物进行 cDNA 编码区全长的特异扩增，获得大于 1 000 bp 的特
异谱带（图 1，F）。克隆后测序结果表明该条带长度为 1 239 bp，其序列与拼接序列编码区全长的
同源性为 100%。最终获得 1 534 bp 的草莓 LFY 同源基因序列，该序列的编码区（coding sequence，
CDS）长度为 1 236 bp，编码 412 个氨基酸，5′端和 3′端分别有 93 bp 和 202 bp 的非翻译区。该草莓
LFY 同源基因在 CDS 长度与其他蔷薇科植物在长度上相近，但是与玫瑰的 LFY 同源基因同源性最
高，达到 88%，将克隆出的草莓 LFY 同源基因定名为 FaLFY（GenBank 收录号：JN788260）。
利用基因组 DNA 为模板进行基因全长特异 PCR 扩增，得到了长为 2 kb 多的条带（图 1，G），
测序结果表明，FaLFY DNA 编码区序列长为 2 250 bp，有 3 个外显子，2 个内含子。与 NCBI 数据
库收录的其它物种已知 LFY 同源基因的 DNA 序列结构比较（图 2），内含子/外显子数量与犬蔷薇、
苹果、大豆等中的 LFY 同源基因相同。各同源基因间外显子大小差异不大，但内含子大小差异较大。

图 2 FaLFY 与其它物种同源基因的 DNA 序列结构比较
LFY-2：犬蔷薇 LFY 同源基因；LFY-1：大豆 LFY 同源基因；AFL2：苹果 LFY 同源基因。
Fig. 2 Gene structures of FaLFY and other LFY homologues
LFY homologues from Rosa canina（LFY-2），Glycine max（LFY-1）and Malus × domestica（AFL2）.

2.3 FaLFY 编码蛋白聚类分析及其序列特征
将克隆得到的 FaLFY 的 cDNA 序列推导出的氨基酸序列与其他物种的 LFY 同源基因所编码的
氨基酸通过 DNAMAN 进行同源性分析，发现草莓的 FaLFY 与其他植物的 LFY 同源基因所编码的
氨基酸同源性大多在 70%以上，特别是与蔷薇科的玫瑰同源性最高，达 88%。另外与其他植物，不
论是模式植物的烟草、金鱼草及矮牵牛等，还是枇杷、苹果、榅桲树等木本植物中 LFY 同源基因都
有一定的同源性（图 3）。
用 CLUXTAL1.8、MEGA4 方法对上述包括 FaLFY 在内 13 个基因的氨基酸序列进行系统进化
分析，绘制进化树，结果（图 4）显示，FaLFY 首先与蔷薇科的玫瑰 LFY 同源基因编码蛋白聚在一
起，然后与其他蔷薇科植物类似同源基因编码蛋白聚在一个分支上，这与普通分类的结果一致。由
此可见由该基因与其同源基因编码蛋白聚类分析而得到的系统进化树比较可靠。
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图 3 FaLFY 与其它 LFY 同源基因编码的氨基酸序列比对
FaLFY：草莓；LEAFY-1：玫瑰；CoLFY-2：榅桲树；EjLFY-2：枇杷；LEAFY2：大豆；FL2、NFL2：烟草；flo：金鱼草；
AFL1、AFL2：苹果；CMFL：菊花；LjLFY：百脉根；PpLFY-2：梨。
Fig. 3 Alignment of deduced amino acids of FaLFY and other LFY-like genes
FaLFY：Fragaria × ananassa；LEAFY-1：Rosa canina；CoLFY-2：Cydonia oblonga；EjLFY-2：Eriobotrya japonica；LEAFY2：Glycine max；
FL2，NFL2：Nicotiana tabacum；flo：Antirrhinum majus；AFL1，AFL2：Malus × domestica；CMFL：Chrysanthemum × morifolium；
LjLFY：Lotus japonicus；PpLFY-2：Pyrus pyrifolia.

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图 4 FaLFY 与其它 LFY 同源蛋白的聚类分析
节点处数字代表自展值（%）。
Fig. 4 Phylogenetic tree of the predicted LFY houmologous proteins from different species
The numbers next to the nodes indicate bootstrap values（%）.

2.4 FaLFY 表达模式的分析
实时定量 RT-PCR 检测结果（图 5）表明，FaLFY 在花芽中的表达量最高，其次是幼蕾。在营
养生长的组织中基本检测不到其表达，但在匍匐茎的芽中有少量的表达。在花的不同发育阶段，从
花芽形成开始，FaLFY 的表达量逐渐降低，至花完全展开的成熟花状态时，表达量降至零，在所有
四轮花器官中都不表达。

图 5 FaLFY 在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中的表达
1. 幼叶；2. 老叶；3. 匍匐茎芽；4. 匍匐茎；5. 花序茎；6. 花芽；7. 花蕾；8. 成熟花；9. 幼果；
10. 萼片；11. 花瓣；12. 雄蕊；13. 子房。
Fig. 5 Expression pattern of FaLFY in different tissues，organs and different growth stages of flowers
1. Young leaf；2. Old leaf；3. Stolon bud；4. Stolon stem；5. Inflorescence stem；6. Floral bud；7. Little flower；8. Mature flower；
9. Young fruit；10. Sepal；11. Petal；12. Stamen；13. Ovary.
3 讨论
前人研究认为 LFY 同源基因在所有的陆生植物中都存在，并且结构上相对保守，具有两个明显
特征：一是都含有 3 个外显子和 2 个内含子，二是在氨基酸结构上包含有 2 个高度保守的区域（N–
端和 C–端）（Maizel et al.，2005）。该类同源基因在蛋白初级结构上的稳定和保守性说明它们可能
在不同的物种中具有相似的功能。在拟南芥中，LFY 基因在整合诸如植物激素、光周期、低温等外
源和內源信号促进成花方面发挥了极其重要的功能（Chae et al.，2008）。很多植物中的该同源基因
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都在花序分生组织转变为花分生组织和成花诱导过程中发挥作用（Weigel et al.，1992；Weigel &
Nilsson，1995；Moyroud et al.，2010）。本研究表明，在草莓中分离得到的 FaLFY 基因在核酸和蛋
白水平上都与其它该类同源基因类似，包含有典型的内含子/外显子分布特征以及在 N–端和 C–端
的高度保守区域，这一序列特征表明该基因很可能与其它物种中的 LFY 同源基因类似，在草莓的成
花过程中发挥重要作用。
qRT-PCR 结果表明 FaLFY 主要在成花初期的花芽中表达量最高，说明其在促进花形成过程中发
挥作用；随着花器官的形成，表达量降低乃至不表达。FaLFY 在草莓匍匐茎上的芽中有一定的表达
量，匍匐茎上的芽不会形成花，进一步发育会形成小苗，在该组织中检测到 FaLFY 的表达说明该基
因可能需要达到一个阈值后才能诱导成花。在其它物种中也有类似的报道（Rottmann et al.，2000）。

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