全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（1）：55–60 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–05–21；修回日期：2010–09–21
基金项目：国家科技支撑计划项目（2007BAD07B03）；福建省蔬菜工程技术研究中心项目（2010N2004）；福建省自然科学基金项目
（2010J0111）；福建省属公益类科研院所基本科研专项（2010R1028-5）；福建省农业科学院博士科研启动基金项目（BS04）；福建省财政专
项—福建省农业科学院科技创新团队建设基金项目（STIFY06）
* 并列第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：fjvrc@163.com）
草莓八氢番茄红素脱氢酶基因 pds 的克隆及特
征分析
朱海生，李永平*，温庆放**，林 珲
（福建省农业科学院作物研究所，福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建省蔬菜工程技术研究中心，福州 350013）
摘 要：采用 RT-PCR 和 RACE 技术从草莓果实中克隆到草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因 pds，
该 cDNA 全长 2 043 bp，具有一个 1 704 bp 的完整开放阅读框（ORF），编码 568 个氨基酸。序列分析表
明，pds 编码的氨基酸序列与其它植物的 PDS 蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示，草莓 PDS 与
杏的 PDS 蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明 pds 基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量
RT-PCR 技术进行组织表达模式分析发现，pds 基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达，表达量为红果＞
粉红果＞白果＞花＞青果＞叶。
关键词：草莓；八氢番茄红素合成酶；类胡萝卜素；基因克隆
中图分类号：S 668.4 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）01-0055-06

Cloning and Characterization of pds Gene in Fragaria × ananassa
ZHU Hai-sheng，LI Yong-ping*，WEN Qing-fang**，and LIN Hui
（Crops Research Institute，Vegetable Research Center，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fujian Engineering
Research Center for Vegetables，Fuzhou 350013，China）
Abstract：The pds cDNA sequence was cloned from strawberry fruit using RT-PCR and RACE
techniques. The cDNA sequence consists of 2 043 bp with an intact open reading frame of 1 704 bp，
encoding a polypeptide of 568 amino acids. Homology analysis showed that the deduced PDS protein was
highly homologous to other PDS proteins from different species. Phylogenetic analysis also indicated that
PDS was close to PDS of apricot. Prokaryotic expression showed Recombinant pds was efficiently
expressed in Escherichia coli BL21. The semi-quantitative RT-PCR analysis revealed that pds can be
expressed in different strawberry tissues，and the expression level was differed in these tissues，the highest
expression level was detected in fruits at the red ripening stage，while moderate expression levels were
found in fruits at the pink ripening stage，white fruits，flowers and green fruits，the lowest level was present
in leaves.
Key words：strawberry；phytoene desaturase；carotenoids；gene cloning

56 园 艺 学 报 38 卷
八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是影响类胡萝卜素合成的限速酶之一，参与线状类胡萝卜素生物
合成。该酶催化八氢番茄红素脱氢生成 9，9’–二顺式–ζ–胡萝卜素，再经由ζ–胡萝卜素脱氢
酶（ZDS）和类胡萝卜素异构酶（CRTISO）生成番茄红素，进而合成其它下游类胡萝卜素（朱长甫
等，2004）。该酶编码的基因（pds）与八氢番茄红素合酶基因（psy）、ζ–胡萝卜素脱氢酶基因（zds）
等协调作用，在转录水平上调节花或成熟柑橘果实中类胡萝卜素的积累（Kato et al.，2004）。
草莓（Fragaria × ananassa Duch.）中含有较丰富的类胡萝卜素（宋新娜和汪之顼，2007），目
前关于草莓类胡萝卜素生物合成途径中相关基因的分离和鉴定、各种代谢酶的结构和功能以及类胡
萝卜素积累特点和代谢机制的研究国内外较少报道。草莓类胡萝卜素生物合成途径中的 pds 基因分
离和鉴定的研究国内外至今未见报道，PDS 在草莓类胡萝卜素生物合成途径中具体作用和功能目前
还不清楚。本研究中克隆并分析了草莓 pds 基因，为进一步研究八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的调
控功能奠定分子基础，对揭示 pds 基因在草莓类胡萝卜素合成及果色形成中的作用具有重要理论意
义，为进一步创制高类胡萝卜素含量新种质资源、开展类胡萝卜素品质育种提供了可能。
1 材料与方法
1.1 草莓总 RNA 的提取和 cDNA 的克隆
试验于 2008—2010 年在福建省农业科学院作物研究所进行。供试材料为草莓（Fragaria ×
ananassa Duch.）品种‘丰香’。
采用 Trizol 说明书并参照王关林和方宏筠（2002）的方法加以改进提取总 RNA。按大连宝生物
有限公司的 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒的方法合成 cDNA 第一链，逆转录引
物 AP 序列为 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17-3′。
根据 GenBank 中其他 pds 基因（AY822065、AB046992、AF251014、AY494790 和 M88683）序
列设计一对保守区简并引物，上游 P1：5′-ATTGCTGGTGCAGGTTTGGC-3′，下游 P2：5′-GAACC
ATGC/tTTCTCCTGAAG-3′。
根据草莓 pds 基因保守区克隆测序结果，设计 3′端正向引物 P3，引物序列为：5′-GCCAGCACCC
TTAAATGGAATA-3′。与通用引物 AUAP 配对进行 PCR 扩增，AUAP 序列为：5′-GGCCACGCGT
CGACTAGTAC-3′。
在已获得的草莓 pds 基因测序的基础上，设计两个 5′端反向引物，分别为 P4：5′-TAAGGGTGCT
GGCAGAACTT-3′和 P5：5′-AGGGAAATCAAACCGGCTGAACTCT-3′。以 P4 为引物合成 cDNA 第
1 链，cDNA 第 1 链加同聚物尾，在加尾的基础上进行 cDNA 第 2 链的合成，以合成完的 cDNA 第
2 链为模板，以 P5 和 AUAP 为引物进行 PCR 扩增。
根据获得的 pds 基因 cDNA 全长，设计 ORF 引物 P6 和 P7，进行 pds cDNA ORF 克隆，验证已
获得的序列，引物的序列分别为 P6：5′-ATGTCGCACTGGGCTTCTGTCTCT-3′，P7：5′-CCTCTAATT
ATAGTTTTAGGTGTCA3′。
PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化连接到 pMD18-T 载体上转化，挑取阳性克
隆，PCR 检测后送至测序，获得 pds 基因全长序列，利用生物信息学数据库和互联网上的软件分析。
1.2 pds 基因原核表达载体构建及表达
根据 pds cDNA 全序列的编码区、原核表达载体 pET-32a（+）的多克隆位点和翻译蛋白移码问
题，设计一对特异引物用于 pds 基因完整开放阅读框的扩增，分别在 5′和 3′引入 BamHⅠ和 XhoⅠ
1 期 朱海生等：草莓八氢番茄红素脱氢酶基因 pds 的克隆及特征分析 57

酶切位点，PCR 扩增产物经 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切，回收 pds 基因片段。原核表达载体 pET-32a
（+）质粒用 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切，回收载体片段。将 pds 基因片段和 pET-32a（+）的载体片段
在 T4 连接酶的作用下 16 ℃连接过夜，连接产物转化感受态 E. coli DH5α，涂在含有 Amp 的 LB 平
板上，挑取单菌落分别以 PCR、酶切和测序进行验证，将鉴定为阳性的重组表达质粒 pET-pds 转化
表达宿主菌 E. coli BL21（DE3）进行原核表达，经 SDS-PAGE 检测蛋白表达情况。
1.3 pds 基因的表达情况
对草莓结果期的叶、盛开的花、绿果、白果、粉红果和红果的总 RNA 进行定量，合成 cDNA
第 1 链。运用半定量 RT-PCR 检测 pds 的表达量，以草莓 18S rRNA 为内参。pds 引物为 P8：5′-ATGT
CGCACTGGGCTTCTGTCTCT-3′，P9：5′-GACATGGCAATAAACACCTCAGTAG-3′；18S rRNA 引
物为 18SQF：GTAGTCATATGCTTGTCT，18SQR：GAATGATGCGTCGCCAGCACAAAGG。PCR
扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28 个循环。PCR 产物于 1.5%琼脂糖凝
胶电泳，用 UVP 公司的 GDS8000 凝胶成像系统拍照并对 PCR 条带进行密度扫描分析。
2 结果与分析
2.1 草莓 pds 基因的克隆
根据 GenBank 中其他 pds 基因序列设计一对简并引物，P1 和 P2，以草莓果肉总 RNA 逆转录的
cDNA 第 1 链为模板，PCR 扩增获得了一个大约 600 bp 的特异产物。对该片段进行回收纯化，经连
接、转化、筛选阳性克隆、重组质粒 PCR 鉴定、测序，得到一个近 600 bp 的 cDNA 序列。经 BLAST
分析，认为所获得的序列是草莓 pds 的保守序列。
根据所获得的草莓 pds 保守区序列，设计 3′RACE 的特异性引物 P3，以通用引物 AUAP 为反式
引物，进行 3′端 RACE PCR，扩增出 1 500 bp 左右的特异条带。测序结果表明该序列长 1 344 bp，
与保守区有 300 bp 的重叠区段，实际大小 1 044 bp。该序列在终止密码子后有长 236 bp 的 3′端非编
码区，其中包括一个含 22 个腺苷酸的 poly（A）。经 BLAST 检索认为它是草莓 pds 的 3′端序列。
根据 pds 保守区和 3′端测序结果，设计了 1 个 5′RACE 的特异反向引物 P4，进行 cDNA 第 1 链
的合成，之后对 cDNA 第 1 链加同聚物尾合成第 2 链。同时在 P4 的上游设计另一条特异反式引物
P5，用于 PCR 扩增。5′RACE 试验扩增信号很强，在首轮扩增便获得了清晰的特异性条带，750 bp
左右，测序得到一个 729 bp 的 cDNA 片段。该片段与保守区 cDNA 有 291 bp 的重叠区段，扣除重
叠序列和加同聚物尾序列，实际大小为 400 bp，在序列的 5′端包含一个 100 bp 的 5 段非编码区。经
BLAST 检索认为它是草莓 pds 的 5′端序列。
2.2 草莓 pds 基因 cDNA ORF 克隆及全长序列分析
根据草莓 pds 保守区序列、5′端、3′端序列结果，拼接出全长 cDNA，设计 ORF 引物 P6 和 P7
进行 PCR 扩增，目的片段符合预期 1 704 bp 大小，确证了草莓 pds 基因序列。该 cDNA 全长 2 043 bp，
具有完整的开放阅读框（第 101 ~ 1 804 个碱基），共 1 704 个碱基，编码 568 个氨基酸，编码产物
的分子量为 63.376 kD，理论等电点为 7.19。含有 100 bp 的 5′非编码区和 263 bp 的 3′非编码区。该
cDNA 序列已登录 GenBank，登录号为：FJ795342。
将获得的草莓 pds 基因全长 cDNA 及其编码的蛋白质序列登录到 NCBI 网站，用 BLAST 进行
核苷酸和蛋白质同源性检索，发现该序列与杏（AY822065.1）、番木瓜（DQ666830.2）、柚（EU798285.1）
和葡萄柚（AF364515.1）等 cDNA 序列的同源性分别为 83%、83%、82%和 82%。该序列完整的开
58 园 艺 学 报 38 卷
放阅读框推导的氨基酸序列与杏（AAX33347.1）、葡萄柚（AAK51545.1）、柚（ACE79168.1）、番
木瓜（ABG77271）等的氨基酸序列一致性分别为 87%、86%、86%、81%，相似性达 92%、93%、
93%、88%。
用 DNAMAN5.0 软件分析植物 PDS 蛋白的系统进化（图 1），发现草莓 PDS 与杏的 PDS 蛋白亲
缘关系比较近，聚为同一类。
图 1 草莓 PDS 与其他植物 29 个 PDS 蛋白的系统进化分析
Fig. 1 Phylogenetic analysis of PDS in strawberry with 29 other plant PDSs
2.3 原核表达载体 PET-pds 鉴定及表达
原核表达载体 PET-pds 用 BamHⅠ和 XhoⅠ进行双酶切鉴定，结果如图 2，切出大小约为 1.7 kb
的片段，与预期大小一致，说明原核表达载体 PET-pds 构建成功。
通过 SDS-PAGE 电泳及考马斯亮蓝染色发现，在 1 mmol · L-1 IPTG 诱导表达 4 h 和 8 h 后，携
带重组质粒 PET-pds 的 E.coli 菌株中存在一条约 84 kD 的明显蛋白条带，而携带空质粒 pET32a（+）的
细菌中无相应蛋白条带（图 3）。
由于融合蛋白中 His 标签及质粒序列带来的氨基酸约为 21.0 kD，因此所表达的蛋白条带大小与
PDS 蛋白预测的 63.2 kD 基本一致。
1 期 朱海生等：草莓八氢番茄红素脱氢酶基因 pds 的克隆及特征分析 59

图 2 pET-pds 重组质粒 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切鉴定
M：λ-EcoT14 digestⅠ ；1：质粒 pET-pds。
Fig. 2 Restriction endonuclease analysis of recombinant
plasmids by BamHⅠand XhoⅠ
M：λ-EcoT14 digestⅠ ；1：pET-pds.
图 3 PDS 在大肠杆菌中表达的 SDS-PAGE 电泳图
M：蛋白质分子量标准；K：pET32a（+），IPTG 1 mmol · L-1，8 h；
1，2：pET-pds，IPTG 1 mmol · L-1，4 h 和 8 h。
Fig. 3 SDS-PAGE of the expressed PDS in E. coli
M：Marker；K：pET32a（+）transformed bacterial cells induced
respectively for 8 h by 1 mmol · L-1；1，2：pET-pds transformed
bacterial cells induced respectively for 4，8 h by 1 mmol · L-1.
图 4 pds 基因在不同器官中的表达
1：花；2：叶；3：青果；4：白果；5：粉红果；6：红果。
Fig. 4 pds gene expression in different organs
1：Flowers；2：Leaves；3：Green fruits；4：White fruits；
5：Pink fruits；6：Red fruits.
表 1 草莓 pds 基因和内参基因条带完整光密度比值
Table 1 The integrated optical density（IOD）ratio of pds
gene of strawberry and control gene
IOD 花
Flowers
叶
Leaves
青果
Green
fruits
白果
White
fruits
粉红果
Pink
fruits
红果
Red
fruits
pds 35679 23569 28459 40684 42652 48385
18S rRNA 57797 56783 58078 60597 62809 59967
pds/
18S rRNA
0.617 0.415 0.490 0.671 0.679 0.807

2.4 草莓 pds 基因组织表达分析
半定量 RT-PCR 分析结果（图 4）表明，在草莓叶、花、绿果、白果、粉红果和红果中均有 pds
基因的表达，说明该基因为组成型表达，在花中表达量高于叶中表达量，伴随着果实的成熟，表达
量相应增加，在红果中表达量最高。利用 UVP 公司的 GDS8000 凝胶成像系统对 PCR 条带进行密度
扫描分析，得到 pds 基因和内参 18S rRNA 基因条带完整光密度比值（表 1），pds 基因在草莓不同
组织和器官中的表达量为红果＞粉红果＞白果＞花＞青果＞叶。

3 讨论
在高等植物中，类胡萝卜素是在质体中通过类异戊二烯途径合成的（Lichtenthaler et a1.，1997）。
近年来，对类胡萝卜素合成关键限速反应研究的比较多，同时对相关的4种酶做了较多的研究，包括：
牻儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（GGPS）及其基因、八氢番茄红素合成酶（PSY）及其基因，八氢番
茄红素去饱和酶（PDS）及其基因、ζ–胡萝卜素脱氢酶（ZDS）及其基因（黄彬城 等，2006）。
PDS催化八氢番茄红素连续两次脱氢生成 ζ–胡萝卜素，然后在ZDS催化下，ζ–胡萝卜素脱氢生成
链孢红素继而进一步脱氢生成番茄红素（Breitenbach & Sandmann，2005），PDS是类胡萝卜素合成
途径中的重要限速酶。Chamovitz 等（1991）从抗达草灭的组囊藻突变体中分离到发生点突变的pds
基因，随后以正常pds基因为探针分离到大豆和番茄（Pecker et al.，1992）的pds基因。如今从杏
（AY822065.1）、柚（EU798285.1）、葡萄柚（AF364515.1）、番木瓜（DQ666830.2）、柚（EU798285.1）、
万寿菊（AF251014.1）、橙（AY669082.1）、辣椒（X680l7）、黄花龙胆草（AB028666）、甘薯（王
飞，2007）、中国水仙（陈段芬 等，2008）等植物中都已分离到该基因，这些基因的cDNA长1.9 ~ 2.3
60 园 艺 学 报 38 卷
kb，编码566 ~ 582个氨基酸。其中番茄pds基因转录区包括15个外显子和14个内含子，长7.7 kb（Bartleyet
& Scolnik，1994，1995），以单拷贝形式存在（Corona et al.，1996）。
本研究中成功克隆了草莓pds基因全长，该cDNA全长2 043 bp，具有完整的开放阅读框（第101 ~
1 804个碱基），共1 704个碱基，编码568个氨基酸。该序列完整的开放阅读框推导的氨基酸序列与
杏（AAX33347.1）、葡萄柚（AAK51545.1）、柚（ACE79168.1）、番木瓜（ABG72807.2）等的氨基
酸序列一致性分别为87%、86%、86%、81%，相似性达92%、93%、93%、88%。用DNAMAN5.0
软件分析植物PDS蛋白的系统进化，发现草莓PDS与杏的PDS蛋白亲缘关系比较近。通过半定量
RT-PCR分析发现pds基因在成熟红果中表达量最高，其次是花，表达量最低的是叶，推测pds在草莓
果实类胡萝卜素积累和花的显色中可能起着重要作用。本研究后期将pds基因转化草莓，通过基因过
量表达技术，验证其在草莓类胡萝卜素合成中的功能，为分子水平上进行草莓品质改良奠定基础。

References
Bartley G E，Scolnik P A. 1994. Molecular biology of carotenoid biosynthesis in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol，45：287–301.
Bartley G E，Scolnik P A. 1995. Plant carotenoids：Pigments for photoprotection，visual attraction，and human health. Plant Cell，7：1027–1038.
Breitenbach J，Sandmann G. 2005.（zeta）-Carotene cis isomers as products and substrates in the plant poly-cis carotenoid biosynthetic pathway to
lycopene. Planta，220 (5)：785–793.
Chamovitz D，Pecker I，Hirschberg J. 1991. The molecular basis of resistance to the herbicide norflurazon. Plant Mol Biol，16：967–974.
Chen Duan-fen，Peng Zhen-hua，Gao Zhi-min. 2008. Cloning and expression analysis of PDS gene in Narcissus tazetta var. chinensis. Molecular
Plant Breeding，6 (3)：574–578. (in Chinese)
陈段芬，彭镇华，高志民. 2008. 中国水仙八氢番茄红素脱氢酶基因（PDS）的克隆及表达分析. 分子植物育种，6 (3)：574–578.
Corona V，Aracri B，Kosturkova G，Bartley G E，Pitto L，Giorgetti L，Scolnik P A，Giuliano G.. 1996. Regulation of a carotenoid biosynthesis
gene promoter during plant developmen. Plant J，9：505–512.
Huang Bin-cheng，Ji Jing，Wang Gang，Zheng Yang-xia. 2006. Advances of carotenoid in plants. Tianjin Agricultural Sciences，12 (2)：13–17.(in
Chinese)
黄彬城，季 静，王 罡，郑阳霞. 2006. 植物类胡萝卜素的研究进展. 天津农业科学，12 (2)：13–17.
Kato M，Koma Y，Matsumoto H，Sugiura M，Hyodo H，Yano M. 2004. Accumulation of carotenoids and expression of carotenoid biosynthetic genes
during maturation in citrus fruit. Plant Physio1，134 (2)：824–837.
Lichtenthaler H K，Schwender J，Disch A，Rohmer M. 1997. Biosynthesis of isoprenoids in higher plants chloroplasts proceeds via a mevalonate
independent pathway，FEBS Lett，40 (3)：271–274.
Pecker I，Chamovitz D，Linden H，Sandmann G，Hirschberg J. 1992. A single polypeptide catalyzing the conversion of phytoene to ζ-carotene is
transcriptionally regulated during tomato fruit ripening. Proc Natl Acad Sci USA，89：4962–4966.
Song Xin-na，Wang Zhi-xu. 2007. Carotenoids contents of use food. Foreign Medical Sciences（Section of Hygiene），34 (3)：182–187. (in Chinese)
宋新娜，汪之顼. 2007. 美国的食物类胡萝卜素含量数据. 国外医学卫生学分册，34 (3)：182–187.
Vittorio Corona，Benedetto Aracri，Georgina Kosturkova，Glenn E Bartley，Letizia Pitto，Lucia Giorgetti，Pablo A Scolnik，Giovanni Giuliano.
1996. Regulation of a carotenoid biosynthesis gene promoter during plant development. Plant J，9：505–512.
Wang Fei. 2007. Clone of full-length cDNA of phytoene desaturase（gene pds）gene in sweet potato（Ipomoea batatas L.）. Journal of Anhui
University of Science and Technology：Natural Science，27 (1)：55–58. (in Chinese)
王 飞. 2007. 甘薯类胡萝卜素合成酶基因 pds 全长 cDNA 的克隆. 安徽理工大学学报：自然科学版，27 (1)：55–58.
Wang Guan-lin，Fang Hong-jun. 2002. Plant gene engineering. Beijing：Science Press. (in Chinese）
王关林，方宏筠. 2002. 植物基因工程. 北京：科学出版社.
Zhu Chang-fu，Chen Xing，Wang Ying-dian. 2004. Carotenoid biosynthesis in plants and application of its relative genes in gene engineering. Journal
of Plant Physiology and Molecular Biology，30 (6)：609–618. (in Chinese)
朱长甫，陈 星，王英典. 2004. 植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因工程中的应用. 植物生理与分子生物学学报，30 (6)：609–618.