全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（增刊）：2552 http: // www. ahs. ac. cn
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收稿日期：2011–09–21
基金项目：云南省应用基础研究面上项目（2010ZC053）
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NO3-胁迫下菠菜 SSH 文库的构建及 EST 分析
徐慧妮*，何小钊，王 康，陈丽梅，李昆志
（昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650224）
土壤次生盐渍化是设施蔬菜生长的主要障碍因子，设施土壤的盐分组成特点为阴离子主要是
NO3-，约占阴离子总量的 67% ~ 76%，阳离子主要是 Ca2+和 K+。菠菜（Spinacia oleracea L.）在我
国南北方的设施中广泛种植，是典型的喜硝蔬菜，也是耐盐性较强的蔬菜。为了解蔬菜对 NO3-胁迫
应答的分子机制，构建了菠菜 NO3-胁迫下的正向抑制消减杂交（SSH）cDNA 文库，并对获得的表
达序列标签（EST）进行分析，为从分子水平揭示土壤次生盐渍化对蔬菜的伤害机制，解决土壤次
生盐渍化问题提供理论依据。
供试材料为‘益农菠菜’。将菠菜种子按常规方法浸种催芽，两片子叶展平后，转入营养液槽中
培养，待植株长到六叶时进行胁迫处理。对照营养液中 NO3-为 10 mmol · L-1，NO3-胁迫处理浓度为
100 mmol · L-1[NO3-由 Ca(NO3)2 · 4H2O 和 KNO3 各提供一半]。菠菜根系在对照和 NO3-胁迫条件下
处理 0 min、10 min、0.5 h、1 h、3 h、6 h、24 h 后取样，液氮速冻，保存于–80 ℃。RNA 的提取
采用 Trizol Reagent（Invitrogen）的方法。以对照营养液处理的菠菜幼苗根系为消减方（driver），以
100 mmol · L-1 NO3-处理不同时间后的菠菜根系为检验方（tester），根据 Clotech PCR-SelectTM cDNA
Subtraction Kit（Clontech，USA）试剂盒的说明书进行文库构建。将 SSH 产物进行 T/A 克隆，转化
大肠杆菌后挑选阳性克隆组成 SSH cDNA 文库。通过 PCR 扩增文库中每个克隆的插入片段，分析
克隆插入片段的有无及片段的大小，进而判断所构建文库的质量是否符合要求。对文库中插入片段
在 200 ~ 1 500 bp 的克隆进行单向测序，分析测序结果，并在 GenBank 中进行 BlastX 比对，推测 EST
的可能功能。对部分基因进行 RT-PCR 分析验证文库的可靠性。
从菠菜根系提取的总 RNA 经 1%甲醛琼脂糖变性凝胶电泳检测，出现清晰的 28S 和 18S rRNA
两条带，说明总 RNA 结构完整、未降解，完全可以满足 cDNA 文库的构建。菠菜 cDNA 第一链的
产物检测结果呈弥散状，大小主要集中在 500 ~ 2 000 bp 之间，符合建库要求。本研究共挑取了 798
个阳性克隆组成 SSH cDNA 文库。用 PCR 扩增检测文库中各克隆插入 cDNA 的大小，结果显示，
插入 cDNA 片段的长度在 200 ~ 1 500 bp 之间，平均值约为 500 bp。挑选 260 个克隆进行测序，一
共获得 211 个有效的 EST。对 EST 进行 BlastX 比对及功能注释，发现已知的基因参与到代谢、细
胞救援及防御、细胞转运、信号转导、蛋白合成、DNA 和 RNA 代谢、转录、细胞骨架等途径，说
明菠菜对 NO3-胁迫应答的复杂性。随机挑选 11 个基因进行半定量 RT-PCR 分析，结果表明所选的
11 个基因在 NO3-胁迫后均上调表达，说明该文库的可靠性。

关键词：菠菜；NO3-胁迫； SSH；RT-PCR
中图分类号：S 636.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）S-2552-01