全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（7）：1139–1146
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–03–02；修回日期：2010–05–19
基金项目：国家自然科学基金项目（30771756）
﹡ 通信作者 Author for correspondence（E-mail：dqr0723@163.com）
柿果实扩张蛋白基因 cDNA克隆及原核表达
常晓晓，饶景萍*，刘 乐
（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）
摘 要：以‘富平尖柿’（Diospyros kaki L.‘Fuping Jianshi’）果实不同发育时期提取的总 RNA为模
板，利用 RT-PCR结合 RACE技术扩增得到 5个扩张蛋白基因：成熟期 CDK-Exp3（1 168 bp），转色期
CDK-Exp4（1 120 bp）和 CDK-Exp5（1 018 bp），膨大期 CDK-Exp6（1 129 bp）和 CDK-Exp7（1 121 bp）；
5 个基因的开放阅读框（ORF）均为 765 bp，编码 254 个氨基酸；构建了 CDK-Exp3 原核表达载体
pET-CDK-Exp3，并转化于 E.coli BL21（DE3），SDS-PAGE检测结果显示表达了一个约 43 kD的蛋白。
关键词：柿；果实；扩张蛋白；基因；cDNA克隆；原核表达
中图分类号：S 665.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）07-1139-08

Cloning and Prokaryotic Expression of Expansin cDNA in Persimmon
Fruits
CHANG Xiao-xiao，RAO Jing-ping*，and LIU Le
（College of Horticulture，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）
Abstract：Using the total RNA from different stages of persimmon（Diospyros kaki L.‘Fuping
Jianshi’）fruit as the template，five expansin cDNA：CDK-Exp3（1 168 bp）from mature stage，CDK-Exp4
（1 120 bp）and CDK-Exp5（1 018 bp）from colour-changed stage，CDK-Exp6（1 129 bp）and CDK-Exp7
（1 121 bp）from fruit expanding stage were isolated by RT-PCR and RACE. The open reading frame of
the five genes was 765 bp and encoded a protein of 254 amino acid residues. The CDK-Exp3 was cloned
into pET-32a（+）vector to construct recombination prokaryotic expression vector pET-CDK-Exp3，and
which was transformed to E.coli BL21. Recombinant protein about 43 kD was expressed in pET-CDK-
Exp3 system and separated by SDS-PAGE electrophoresis.
Key words：persimmon；fruit；expansin；gene；cDNA clone；prokaryotic expression

柿果实采后极易软化，即使使用气调、冷藏技术也难以很有效地控制其软化进程，达到较为理
想的保鲜效果。果实成熟过程中质地软化的一个重要原因是细胞壁结构变化。扩张蛋白（Expansin）
被证明能使植物细胞壁松驰和加速缓解细胞壁张力，且是唯一具有这种功能的细胞壁蛋白质
（McQueen-Mason et al.，1992）。扩张蛋白主要有两类：α-Expansin和 β-Expansin，它们都是多基因
家族。α-Expansin的分子量为 25 ~ 27 kD，主要存在于双子叶和非禾本科单子叶植物中；β-Expansin
是一类糖蛋白，主要存在禾本科单子叶植物中，分子量为 30 kD（Brummell et al.，1999b）。Rose

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等（1997）研究发现，一个 Expansin基因 Le-Exp1在番茄后熟期有特异性表达，Brummell等（1999a）
人用反义 RNA技术，降低 Le-Exp1的表达，果实在后熟期保持相对较高的硬度，过量表达 Le-Exp1
至野生型的 3 倍，果实基质多糖半纤维素在绿熟期就开始发生降解，果实软化加速（Brummell &
Harpster，2001）。目前从其他果实中，如番茄（Rose et al.，1997，2000）、草莓（Civello et al.，1999）、
桃（Hayama et al.，2000，2001）、樱桃（Yoo et al.，2003）、苹果（Wakasa et al.，2003）、香蕉（陆
旺金，2003；Asha et al.，2007）、黄瓜（孙涌栋 等，2006）、葡萄（Ishimaru et al.，2007）、番木瓜
（牛艳梅 等，2007）、猕猴桃（Yang et al.，2007）、砂梨（宋长年 等，2008）等都克隆到了 Expansin
基因，这些基因有的与果实生长发育有关，有的与果实后熟软化相关。童斌等（2005）在柿果实的
不同发育时期也已克隆出两个 EXP cDNA片段。
从柿果实不同发育时期克隆扩张蛋白基因全长序列，对以后进一步研究扩张蛋白在柿果实成熟
的不同阶段、不同组织中的特异表达，分析其对柿果实软化的调控作用，探明柿果实成熟软化机理，
进而采用生物技术等方法有效控制柿果实成熟软化进程，延长保鲜期将起到重要作用。
1 材料与方法
1.1 材料
试材为中国完全涩柿‘富平尖柿’（Diospyros kaki L.‘Fuping Jianshi’）。果实于 2007年采自陕
西省富平县城南果园，在膨大期、转色期、成熟期分别采果，当天运回实验室，将果肉切成 0.5 cm3
大小的小块，立即以液氮速冻，置于–80 ℃备用。
1.2 总 RNA提取及 cDNA第 1链合成
采用改良热硼法（Wan & Wilkins，1994）提取不同时期柿果实总 RNA。
反转录反应参照 TaKaRa公司的M-MLV反转录酶（RNase H-）说明书，用 Olig（dT）18做引
物合成 cDNA第 1链。
1.3 RT-PCR扩增
根据已报道的 expansin氨基酸保守序列设计简并引物：上游引物序列为 5′-GSNCAYGCNACN
TTYAYGGNG-3′，下游引物序列为 5′-YTGCCARTTYTGNCCCCARTT-3′（N = A、C、G、T；Y = C、
T；N = G、C；R = A、G）。以第 1链 cDNA为模板进行中间片段扩增，25 µL反应体系：10 × PCR
Buffer 2.5 µL， MgCl2（25 mmol · L-1）2 µL，dNTP（10 mmol · L-1 each）0.5 µL，引物（10 µmol · L-1）
各 1.5 µL，cDNA 3 µL，Taq酶（5 U · µL-1）0.3 µL，ddH2O 13.7 µL；反应条件为：95 ℃ 3 min；
95 ℃ 1 min；59 ℃ 1.5 min；72 ℃ 1.5 min，共 35个循环，最后 72 ℃延伸 6.5 min。
PCR反应产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，与 pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，菌落 PCR鉴定后由上海生工生物技术有限公司测序。
1.4 3′ RACE和 5′ RACE
3′和 5′末端的克隆按照 TaKaRa公司的 RACE试剂盒进行巢式 PCR扩增，根据片段测序结果设
计 3′端和 5′端基因特异性引物，3′GSP1：TCACTGCCACTAACTTCTGC，3′GSP2：ATCTTGCTGAGC
CTGCCTTCCT；5′GSP1：TGTTCTGGACCCCTTGACTG，5′GSP2：GAAGGCAGGCTCAGCAAGAT；
PCR产物经回收、连接、转化、鉴定后由上海生工生物技术有限公司测序。
3′和 5′末端测序结果与片段拼接后得到全长序列，根据拼接序列设计引物：UP-P：AATATGGCCA
7期 常晓晓等：柿果实扩张蛋白基因 cDNA克隆及原核表达 1141

ATCCTGCAAC，DN-P：CAGCGATAGACTCTCAATGC，进行 PCR扩增，反应体系同片段的扩增，
克隆得到包含完整 ORF 的全长序列，与 PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌 DH5α，筛选阳性克隆
保存菌液并送样测序。
1.5 序列分析
采用 DNAstar软件进行 ORF分析；BLAST（http：www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST）进行序列相
似性分析；采用 ClustalW（http：// www.ebi.ac.uk/clustalw / index.html）、GeneDoc和 DNAstar软件
进行序列比对和进化树构建。
1.6 原核表达载体构建及诱导表达
根据从柿成熟果实扩增得到扩张蛋白基因全长 CDK-Exp3 的 ORF 序列 pET-32a（+）载体上的
酶切位点设计引物：EXPF01（5′-AAGGATCCATGGGGTGGCAAGGTGGC-3′）（划线部分为 BamH
Ⅰ酶切位点）；EXPR01（5′-AAACTCGAGTCAAAACTGGCTGCCCTC-3′）（划线部分为 XhoⅠ酶切
位点）。以 CDK-Exp3菌液为模版进行 PCR扩增：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，65 ℃ 1.5 min，72 ℃
1.5 min，35个循环；72 ℃延伸 6.5 min。
PCR产物经电泳检测回收，然后用 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切，回收酶切片段与经 BamHⅠ和 Xho
Ⅰ酶切的 pET-32a（+）载体质粒进行定向连接，得到重组表达质粒 pET-CDK-Exp3，转化大肠杆菌
BL21，PCR和双酶切检测后送测序验证。用 0.1 mmol · L-1异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）37 ℃诱导
表达 0、2、4、6 h，12%的 SDS-PAGE电泳检测。
2 结果与分析
2.1 中间片段扩增
分别以膨大期、转色期、成熟期柿果实总 RNA反转录产物为模板，用简并引物扩增中间片段，
3个时期都扩增得到 531 bp的片段，通过改变退火温度，转色期另外得到 501 bp的片段（图 1）。
图 1 柿果实 EXP基因的中间片段电泳图
M：DNA markerⅡ；1：成熟期；2：膨大期；
3、4：转色期。
Fig. 1 Electrophoresis of persimmon fruit EXP gene fragments
M：DNA markerⅡ；1：Mature stage；2：Expanding stage；
3，4：Colour-changed period.
图 2 柿果实 EXP基因 3′RACE电泳图
M：DNA分子量标准 DL2000；1：成熟期；2、3：膨大期；
4、5：转色期。
Fig. 2 Electrophoresis of EXP gene 3′RAC of persimmon Fruit
M：DL2000 DNA marker；1：Mature stage；2，3：Expanding stage；
4，5：Colour-changed period.
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2.2 RACE末端扩增
用 3′ RACE试剂盒和外侧特异性引物 3′ GSP1扩增得到柿果实 3个时期扩张蛋白基因的 3′末端，
膨大期两个：810 bp和 819 bp，转色期两个：810 bp和 708 bp，成熟期一个：811 bp（图 2）。
用 5′ RACE试剂盒和特异性引物 5′ GSP1、5′ GSP2扩增得到成熟期柿果实扩张蛋白基因的 5′
末端（457 bp），如图 3。根据测序得到的柿果实成熟期扩张蛋白基因的中间片段、3′末端及 5′末端，
拼接得到 1 168 bp的全长序列，命名为 CDK-Exp3（登录号为：FJ455264）。
2.3 扩张蛋白基因 cDNA全长扩增
用引物 UP-P 和 DN-P，分别以柿果实膨大期、转色期、成熟期总 RNA反转录产物为模板，扩
增得到包含完整 ORF的全长序列（902 bp），如图 4。
把转色期和膨大期的 3′末端序列分别与其含完整 ORF的全长序列拼接，得到 4个全长序列，转
色期：CDK-Exp4（1 120 bp，登录号为 FJ472608）和 CDK-Exp5（1 018 bp，登录号为 FJ472609），
膨大期：CDK-Exp6（1 129 bp，登录号为 FJ472610）和 CDK-Exp7（1 121 bp，登录号为 FJ478171）。

2.4 序列分析
序列分析表明，柿果实扩张蛋白基因的 ORF为 765 bp，编码 254个氨基酸残基，具有扩张蛋白
的保守序列（如 HFD基元）和不变残基，即 N端有 8个半胱氨酸残基，C端有 4个色氨酸残基（图
5）；预测分子量 27 150.36 D，等电点 7.587。
柿果实 CDK-Exp3 推导的氨基酸序列与 CDK-Exp4、CDK-Exp5、CDK-Exp6、CDK-Exp7、
CDK-Exp1、CDK-Exp2 的同源性分别为 99.2%、99.2%、98.4%、98.8%、82.5%、80.5%；与杏、樱
桃、梨、苹果、桃、李、草莓、黄瓜、番茄的同源性分别为 82.3%、81.5%、81.4%、79.9%、79.8%、
79.8%、79.1%、71.3%、65.7%；CDK-Exp4 与 CDK-Exp5 的氨基酸序列同源性为 100%，但二者的
核苷酸序列在 3′端非编码区相差 102 bp；CDK-Exp6和 CDK-Exp7的氨基酸同源性为 98.8%。
进化树分析（图 6）表明，柿果实扩张蛋白基因与杏、樱桃、梨、苹果、桃、李、草莓等果实
的亲缘关系较近，与黄瓜、番茄等果实亲缘关系较远。

图 3 柿果实成熟期 EXP基因 5′RACE电泳图
M：DNA分子量标准 DL2000。
Fig. 3 Electrophoresis of EXP gene 5′RACE of mature
persimmon fruit
M：DL2000 DNA marker.

图 4 柿果实 EXP基因的全长电泳图
M：DNA分子量标准 DL2000；1：膨大期；
2：转色期；3：成熟期。
Fig. 4 Electrophoresis of full-length EXP gene
M：DL2000 DNA marker；1：Expanding stage；
2：Colour-changed period；3：Mature stage.
7期 常晓晓等：柿果实扩张蛋白基因 cDNA克隆及原核表达 1143

图 5 柿果实扩张蛋白（CDK-Exp3、4、5、6、7、1、2）与其它果实氨基酸序列多重比较
方框中为保守序列，阴影部分为不变残基。
Fig. 5 Alignment of deduced amino acid sequence of persimmon fruit expansin with related fruit species
The conserved regions are in the frame，and invariant residues are shaded.



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图 6 柿果实扩张蛋白（CDK-Exp3、4、5、6、7）与其它果实氨基酸序列同源性进化分析
Fig. 6 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino acid sequences homolog of
persimmon fruit expansin with related fruit species
2.5 原核表达
将重组表达质粒 pET-CDK-Exp3，做 PCR并进行 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切检测（图 7），测序后
证实重组质粒的外源基因插入正确。
重组质粒转化到大肠杆菌 BL21后，用 0.1 mmol · L-1IPTG 37 ℃诱导 0、2、4、6 h后，提取大
肠杆菌总蛋白进行 SDS-PAGE分析。结果（图 8）显示，插入有外源片段的重组质粒 pET-CDK-Exp3
经 IPTG 诱导后，能够表达 1 条约 43 kD 的特异蛋白带，随着诱导时间的增加表达量增大，而
pET-32a（+）空载体未表达此条带。
图 7 pET-CDK-Exp3的 PCR和双酶切检测
M：DL 2000 DNA marker；1：PCR检测；2：酶切检测。
Fig. 7 PCR and restriction enzyme digestion analysis of
pET-CDK-Exp3
M：DL 2000 DNA marker；1：PCR analysis；2：Restriction enzyme
digestion analysis.
图 8 pET-CDK-Exp3在大肠杆菌 BL21中的 SDS-PAGE
1 ~ 4：IPTG诱导 0、2、4、6 h；5：IPTG诱导 6 h pET-32a（+）；
M：蛋白质 marker。
Fig. 8 SDS-PAGE of expression of pET-CDK-Exp3 in BL21
1–4：IPTG induced 0，2，4，6 h；5：IPTG induced 6 h of
pET-32a （+）；M：Protein marker.
7期 常晓晓等：柿果实扩张蛋白基因 cDNA克隆及原核表达 1145

3 讨论
扩张蛋白具有组织特异性，并且受发育阶段的调节；同一组织器官中往往含有数种不同的扩张
蛋白分子，它们的表达时期和表达强度各不相同；即使是处于某一特定生长发育时期的组织或器官
中，也会有数种扩张蛋白同时存在（Brummell & Harpster，2001；Harrison et al.，2001）。扩张蛋白
主要有两类：α-Expansin和 β-Expansin，它们都是多基因家族（Brummell et al.，1999b）。果实中的
扩张蛋白主要是 α-Expansin，根据表达时期的不同有人将它们分为两类：一类与果实的生长膨大有
关，另一类与果实完熟有关，两类蛋白质的一级结构具有很高的相似性，但它们在蛋白质的高级结
构和功能上存在差异（Rose & Bennett，1999）。
从柿果实成熟期、转色期、膨大期分别获得扩张蛋白基因 CDK-Exp3、CDK-Exp4和 CDK-Exp5、
CDK-Exp6和 CDK-Exp7的 cDNA序列，推导的氨基酸序列与其他扩张蛋白一样，在 N端具有保守
的 Cys残基，C端具有保守的 Trp残基，中部具有 HFD等一系列保守域；而保守的 Cys残基和 Trp
残基以及 HFD保守域是扩张蛋白的种性特征（Li et al.，2002）；CDK-Exp3、CDK-Exp4、CDK-Exp5、
CDK-Exp6、CDK-Exp7的氨基酸同源性在 98%以上。它们与童斌等（2005）克隆出来的 CDK-Exp1、
CDK-Exp2片段的氨基酸同源性在 80%左右。其它果实中，如番茄 LeExp3、4、5、6、7及草莓 FaExp3、
4、6、7主要存在于生长中的果实（Brummell et al.，1999b；Harrison et al.，2001），与果实的生长、
细胞的膨大有关；而番茄 LeExp1、草莓 FaExp2和 FaExp5、桃 PchExp1则专一性地表达于完熟的果
实中（Rose et al.，1997；Civello et al.，1999；Hayama et al.，2000），它们可能与完熟期间果实细胞
壁的修饰有关。
从柿果实发育的不同时期克隆到了扩张蛋白基因不同的 cDNA序列，同一时期的扩张蛋白基因
在进化树关系中聚为一类，它们参与柿果实从膨大到成熟的生长过程；而它们是否专一地表达于不
同的时期还需要进一步做该蛋白的表达研究。之前我们课题组从柿果实膨大期和成熟期分别获得了
一个扩张蛋白基因 cDNA片段，但是它们与本试验所克隆的扩张蛋白基因 cDNA全长序列相似性仅
为 70%，氨基酸序列相似性约为 80%，表明它们应该不是本试验所获得的全长序列中的片段，所以
在柿果实膨大期和成熟期应该还能克隆出其他的扩张蛋白基因全长序列，这还需进一步研究。
本试验中对 CDK-Exp3的 ORF去除信号肽后，构建了重组表达载体 pET-CDK-Exp3，转化大肠
杆菌 BL21，经 PCR和双酶切检测后，表达 1条约 43 kD的特异蛋白带。柿果实扩张蛋白基因原核
表达载体 pET-CDK-Exp3 的构建，为进一步进行蛋白纯化、体外活性分析以及分子机制的研究奠定
了基础。

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