全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2010 37 5 689 696
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–01–14；修回日期：2010–04–30
基金项目：农业部公益性行业科研专项（nyhyzx07-30）；国家自然科学基金项目（30971984）；广东省重大科技专项（2006B20101003）
菠萝愈伤组织中体细胞胚起源过程的组织细胞
学观察
何业华1,*，方少秋1,2，马 均1，胡中沂1，卢 敏1，彭 兵1
（1华南农业大学园艺学院, 广州 510640；2汉江集团博远置业有限责任公司，湖北丹江口 442700）
摘 要：以菠萝（Ananas comosus）‘神湾’品种为材料，采用石蜡切片法对其愈伤组织中球形胚
形成过程进行了组织细胞学观察。结果表明，非胚性愈伤组织转入到MS + 4.0 mg · L-1 2,4-D + 0.5 mg · L-1
6-BA培养基培养后，愈伤组织中先出现一些胚性细胞；然后单个胚性细胞分裂形成一个由多细胞组成的
原胚。原胚细胞分生能力强，与周围的母体组织之间形态差异显著，界限明显，其下部形成一个类似胚
柄的结构。随着原胚不断生长，其形状由长椭圆形发展成倒卵形，最后逐渐形成表面较光滑、外观近球
形的球形胚，并在‘胚柄’基部与母体组织连接处形成离层。与此同时，球形胚内出现细胞分化。菠萝
体细胞胚发生具有内、外两种起源方式，另外愈伤组织中体细胞胚发生普遍存在着不均匀、不同步和次
生胚等现象。
关键词：菠萝；胚性细胞；体细胞胚；起源；组织细胞学
中图分类号：S 668.3 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）05-0689-08

Histocytology Observation on the Somatic Embryogenesis in Ananas
comosus Callus
HE Ye-hua1,*，FANG Shao-qiu1,2，MA Jun1，HU Zhong-yi1，LU Min1，and PENG Bing1
（1College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China；2Hanjiang Group，
Boyuanzhiye Co.Ltd.，Danjiangkou，Hubei 442700，China）
Abstract：Histocytology study was done by paraffin section method on the globular embryogenesis in
pineapple（Ananas comosus）. The results showed that the non-embryonic callus were cultured on the MS
medium contained 4.0 mg · L-1 2,4-D and 0.5 mg · L-1 6-BA, embryogenic cells appeared in it. Then the
single embryogenic cells formed a proembryo composed of many cells through cell division. The cells of
proembryo had strong division ability, and there were distinct difference in shape and obvious boundary
between them/it and the surrounding tissues. A suspensor-like structure was formed on the bottom of the
proembryo. Along with the constant growth of the proembryo, its shape converted from long-ellipse to
obovate, at last it evolved as a globular embryo with smooth surface, and there were absciss layer in the
joint of the bottom of suspensor and matrix tissue. At the same time, cell differentiation appeared in the
globular embryo. Pineapple somatic embryogenesis has two original modes，endogenous origin and
exogenous origin. Additionally, there were ubiquitous uneven，desynchronization and secondary embryos

* E-mail：heyehua@hotmail.com
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phenomenon during somatic embryogenesis in pineapple callus.
Key words：pineapple；Ananas comosus；embryogenic cell；somatic embryos；origin；histocytology

体细胞胚起源于非合子细胞，具有类似合子胚的发育过程、遗传上相对稳定和发生普遍等特点，
研究其发生过程不仅有利于揭示细胞分化、发育、形态建成与合子胚发育等的机理，也可为进一步
优化体细胞胚发生体系，拓展其在植物育种中的应用提供细胞学依据。在离体培养条件下，非胚性
细胞接受诱导信号后转变成胚性细胞，再经分裂和分化先后形成原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚，
最后发育为成熟胚（Dodds & Roberts，1995）。其中，从非胚性细胞至球形胚形成是体细胞胚发生
的关键时期，探讨这一时期的特点和规律，对提高体细胞胚的发生率和同步化程度有重要意义
（Umehara & Kamada，2005）。
已有的菠萝体细胞胚研究报道都集中在优化体细胞胚诱导条件和建立体细胞胚发生体系等方面
（Sripaoraya et al.，2003；Firoozabady & Moy，2004；何业华 等，2007），迄今尚未见有关菠萝胚
性细胞分化和体细胞胚发生初期等组织细胞学方面的研究报道。
本研究中通过石蜡切片与显微观察对愈伤组织中球形胚产生过程进行了观察，旨在探索菠萝体
细胞胚起源和发生规律，为菠萝体细胞胚发生体系优化打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为菠萝品种神湾（Ananas comosus‘Yellow Mauritius’) 的无菌苗。
1.2 方法
参照何业华等（2007）的方法进行。
1.2.1 愈伤组织诱导和增殖
于超净工作台中，将无菌苗（高 3 ~ 5 cm）叶片带基部茎皮撕下，在MS + 2.0 mg · L-1 6-BA + 2.5
mg · L-1 NAA培养基上诱导非愈伤组织，4 周后切下非愈伤组织转到增殖培养基（MS + 3 mg · L-1
6-BA + 2 mg · L-1 NAA）上，每 4 周继代 1 次。
1.2.2 体细胞胚的诱导和发育
将增殖培养基上的非愈伤组织切成约 3 mm × 3 mm × 3 mm 小块，接种于菠萝体细胞胚诱导培
养基（MS + 4 mg · L-1 2,4-D + 0.5 mg · L-1 6-BA）上，于黑暗条件下培养 40 d，进行体细胞胚诱导并
获得胚性愈伤组织。
将胚性愈伤组织转入MS + 0.5 mg · L-1 6-BA + 1 mg · L-1NAA培养基中光培养 30 d，以促进其上
的体细胞胚发育成熟。
1.2.3 体细胞胚发生过程的组织形态学观察
将非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织及不同发育时间的体细胞胚浸于 FAA 中固定 48 h，依次进
行冲水、媒染、染色、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、脱蜡、封片等程序，然后进行石蜡
切片。
最后将切片置于 Olympus BH-2 双筒显微镜观察胚性细胞形成与分裂、体细胞胚发生与发育等
过程。
5 期 何业华等：菠萝愈伤组织中体细胞胚起源过程的组织细胞学观察 691
2 结果与分析
2.1 菠萝愈伤组织在体细胞胚诱导前后的组织细胞学观察
叶基在MS + 2.0 mg · L-1 6-BA + 2.5 mg · L-1 NAA 上诱导得到的愈伤组织呈大团块状（直径 2 ~ 3
mm），白色（暗培养下）或浅绿色（光培养下），生长迅速，表面光洁，质地坚实（图 1，A）；转
入含 2,4-D的体细胞胚诱导培养基中培养约 20 d后，表层产生一些淡黄色小颗粒（直径 1 mm左右），
颗粒之间较松散（图 1，B）。


图 1 非胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养后的变化
A. 非胚性愈伤组织外观；B. 胚性愈伤组织外观；C. 非胚性愈伤组织内部结构；
D. 胚性愈伤组织内部结构。
Fig. 1 Changes of non-embryonic callus after somatic embryo induction culture
A. Appearance of non-embryonic callus；B. Appearance of embryonic callus；
C. Internal structure of non-embryonic callus；
D. Internal structure of embryonic callus.

对这些团粒分别进行石蜡切片观察，前者（大团块）的细胞体积较大（直径约 20 ~ 30 μm）、形
状不规则、胞质淡、液泡大、染色较浅，从细胞的形态上判断为非胚性愈伤组织（图 1，C）；将这
些非胚性愈伤组织转入含 2,4-D 的体细胞胚诱导培养基培养约 20 d 后，愈伤组织中出现一些体积较
小（直径约 10 ~ 15 μm）、形状较规则、排列紧密、胞质浓、核大、染色较深、具有旺盛的分生能力
的胚性细胞，为胚性愈伤组织（图 1，D）。

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2.2 菠萝愈伤组织中体细胞胚起源过程的组织细胞学观察
经大量切片观察发现，菠萝体细胞胚既可起源于胚性愈伤组织表层细胞，也可起源于其内部细
胞，且以愈伤组织内部起源为主，其起源过程如下。
在体细胞胚诱导培养基中，其愈伤组织表层个别细胞在外源激素的作用下向外分裂形成单个突
出于外表的胚性细胞（图 2，A）；该胚性细胞垂周分裂形成两个子细胞（图 2，B）；随后继续不断
分裂，形成由数个至数百个细胞组成的小型原胚突起（图 2，C ~ E），长度 30 ~ 200 μm。
原胚由形小、核大、胞质浓厚、排列紧密的分生细胞组成，具有旺盛的分裂能力，持续分裂使
原胚不断增大，其形状也逐渐由长椭圆形变成一个胚体上大下小、顶部平缓的倒卵形。
与此同时，胚体下部的薄壁细胞横向分裂较慢，使原胚基部形成一个类似胚柄的结构；而与‘胚
柄’连接处的母体细胞逐渐停止分裂而形成与原胚细胞区分明显的离层（图 2，D、E）。
随后原胚生长转为以胚体横向膨大为主，顶部生长加速，逐渐形成表面较光滑、顶部圆而突出，
外观近球形的球形胚（图 2，F）。
从切片上看，球形胚中的细胞已不像原胚那样均匀一致，呈现一些深色区域，表明已出现了进
一步的细胞分化，显示其开始进入体细胞胚形态分化期。


图 2 菠萝体细胞胚在愈伤组织表层的起源过程
A． 愈伤组织表面形成的单个胚性细胞（箭头所指）；B. 胚性细胞分裂形成两个子细胞；
C ~ E. 原胚；F. 球形胚。
Fig. 2 Original process of somatic embryo on the surface of pineapple callus
A. Single embryonic cell formed on the surface of callus (marked by arrow)；
B. The embryonic cell divided into two daughter-cells；
C-E. Proembryo；F. Globular embryo.


5 期 何业华等：菠萝愈伤组织中体细胞胚起源过程的组织细胞学观察 693
位于愈伤组织内部的单个胚性细胞（图 3，A）启动分裂形成两个子细胞（图 3，B）；两个子细
胞继续分裂形成 4 个细胞（图 3，C）至更多个细胞组成的多细胞原胚（图 3，D ~ F）；这些原胚与
周围的薄壁细胞逐渐形成明显边界（图 3，D ~ F）；原胚细胞继续分裂并向愈伤组织表层方向生长，
其周围的薄壁细胞逐渐解体消失（图 3，G、H），最后突破愈伤组织表层细胞（图 3，I），成为突出
于母体组织的原胚（图 3，J），此时它仍通过“胚柄”与母体组织连接。但由内起源产生的原胚表
面不像外起源产生的原胚光滑，表面还附着部分残留的细胞碎片（图 3，J）。

图 3 菠萝体细胞胚在愈伤组织中的内起源过程
A. 位于愈伤组织内部的单个胚性细胞； B. 单个胚性细胞分裂形成的两个细胞；
C. 进一步分裂为 4 个细胞；D ~ F. 由数个至数百个细胞组成的原胚；
G、H. 原胚由愈伤组织深处逐渐向外生长；I. 原胚突破愈伤组织；
J. 刚从愈伤组织内部生长出来的原胚。
Fig. 3 Endogenous origin process of pineapple somatic embryo
A. Single embryonic cell in the internal of callus；B. Two daughter-cell formed by single embryonic cell；
C. Further division to four daughter-cells；D-F. Proembryo composed of several to several hundreds cells；
G，H. The proembryo which was gradually growing to the surface from the inside of callus；
I. Proembyo breaked through the callus；J. Proembryo which just came out of the callus.

2.3 菠萝愈伤组织体细胞胚发生的多样性观察
菠萝体细胞胚发生具有不均匀性，在胚性愈伤组织的 1 个显微视野中有时可同时观察到数个发
育程度不同的多细胞原胚（图 4，A）。体细胞胚可以是 1 个相对独立的胚性细胞发育成为 1 个体细
胞胚（图 2，A、C；图 3，A、J）；也可由相距较近（图 4，B、C）甚至相邻（图 4，D、E）的几

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个胚性细胞形成 1 个分化中心，同时或先后分化出数个体细胞胚，这些体细胞胚的‘胚柄’基部彼
此相连，使体细胞胚发生表现出丛生性。
这些体细胞胚分化中心即可形成于胚性愈伤组织内部（图 4，B、D），也可形成于胚性愈伤组
织表层（图 4，C、E），有时一个视野中还可观察到 2 个体细胞胚分化中心（图 4，C）。另外，在一
些发育成熟的体细胞胚上还可观察到次生胚的产生（图 4，F）。

图 4 菠萝体细胞胚发生的多样性
A. 愈伤组织中多个相对独立的多细胞原胚（箭头指示位置，下同）；B. 2 个原胚已突破愈伤组织表层（内起源）；
C. 多个相邻的球形胚同时起源于愈伤组织表层并形成一个分化中心，方框内为一个新的外起源分化
中心已形成（右下角为其放大图）；D. 由一个内起源分化中心产生的 3 个原胚；
E. 由一个外起源分化中心产生的 2 个原胚；
F. 成熟体细胞胚基部又产生的次生胚。
Fig. 4 Diversity of somatic embryogenesis in pineapple
A. Relatively independent multi-cell proembryos in callus (marked by arrowhead)；B. Two proembryos break through the surface
of callus (endogenous origin)；C. Differentiation centre composed of several adjacent globular embryo which origin
from the surface layer of callus at the same time, the block showed a new exogenous origin differentiation
centre has formed (the lower right corner showed its enlarged drawing)；D. Three proembryos formed
by a same endogenous origin differentiation centre；E. Two proembryos formed
by a same exogenous origin differentiation centre；
F. Secondary embryo formed on the bottom of
the mature somatic embryo.

3 讨论
体细胞胚在愈伤组织中起源位置因植物种类不同而异，文冠果体细胞胚是由胚性愈伤组织的外
层细胞发育而来（顾玉红 等，2004），伊贝母体细胞胚则是由愈伤组织内部起源（王仑山 等，1989），
而魔芋愈伤组织的内部和表面都观察到有体细胞胚的发生（黄丹枫和刘佩英，1994）。本研究通过大
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量胚性愈伤组织切片表明，菠萝体细胞胚同时存在着内起源与外起源两种方式，初步统计约 80％以
上是以内起源方式发生的。
体细胞与其周围组织之间生理上的隔离是其进行体细胞胚发生的前提条件（Steward et al.，
1958）。芹菜在多细胞原胚阶段胚体周围有一层细胞构成“边缘细胞层”，后来此层细胞退化解体，
在体细胞胚与周围组织间形成缝隙（Zee & Wu，1980）；石刁柏体细胞胚在多细胞原胚阶段跟周围
的细胞形成较为清晰的细胞界线（丁鑫 等，2007）。本研究观察到菠萝胚性愈伤组织中的胚性细胞
与非胚性细胞在形态上就已有较大差别，很容易区分；在由 2 个至数个细胞组成的早期原胚中，胚
体与其周围细胞界限还不十分明显，彼此紧密相邻，可能存在胞间连丝和物质交换（图 3，B ~ D）；
但到原胚阶段的中后期（图 3，H），由于周围细胞已退化和解体，原胚已不能从周围组织中吸收营
养物质，主要依靠位于其基部‘胚柄’与母体组织相连，‘胚柄’可能在供给体细胞胚营养中发挥着
重要作用。因此，随着原胚的不断生长发育，形态与生理上的相对隔离逐渐显现出来，其独立性也
增强。至球形胚阶段，内起源的胚体已完全脱离母体组织，仅靠“胚柄”基部与母体组织相连，且
连接处的离层相当明显（图 2，F；图 3，J），甚至有部分球形胚已与母体完全脱离。而突出于愈伤
组织之外单个体细胞仅靠与母体组织相连的一面进行物质交换，大部分表面裸露，隔离现象更加明
显，因此外起源的球形胚由突出于愈伤组织之外单个体细胞产生，此时该细胞仅靠与母体组织相连
的一面进行物质交换，大部分表面裸露；进入原胚阶段后也只有“胚柄”基部与母体组织相连，与
其周围组织之间生理上的隔离现象更加明确。
按照细胞全能性，每个细胞都具有体细胞胚发生的潜力（Steward et al.，1958）。但在一个胚性
愈伤组织颗粒中，并非其中每个细胞都能直接发生体细胞胚。胡萝卜胚性细胞团中，中央的细胞液
泡大、核小，外围细胞是核大、液泡小而分散的分生细胞，将胚性细胞团转移到不含生长素的培养
基上，在它们的外层就会形成许多体细胞胚（Steward et al.，1964）。在菠萝胚性愈伤组织颗粒中也
存在着这两类细胞，但核大、液泡小的分生细胞在内部和表层都有可能出现，它们具有很强的胚性，
每个强胚性分生细胞经分裂几乎都会形成一个原胚。而菠萝非胚性愈伤组织颗粒中都是由非胚性细
胞组成，当非胚愈伤组织转移至含 2,4-D 的体细胞胚诱导培养基培养时会先后零星出现一些胚性细
胞。这表明各个细胞接受生长调节物质（2,4-D 等）诱导转变成胚性细胞的能力存在差异，从而导
致了这种不均匀和不同步现象的出现。
值得注意的是在菠萝胚性愈伤组织颗粒内部和表层都会形成一些体细胞胚分化中心，而诱导体
细胞胚分化中心形成对提高体细胞胚发生量具有重大意义。菠萝体细胞胚发生中表现的不均匀性、
不同步性以及次生胚的形成等都反映其发生的多样性。但本试验大量观察表明菠萝体细胞胚都是单
细胞起源，且具明显的胚柄结构、离层和双极性，与多细胞起源的拟原球茎和不定芽有着根本区别
（何业华 等，2008）。
体细胞胚发生是一个复杂的基因表达过程，其生理生化和形态学变化受许多基因调控。因此，
要弄清造成体细胞胚发生初期的这种差异性的机理，还有赖于对非胚性细胞向胚性细胞转变过程中
起重要作用相关基因表达调控研究（Schmidt et al., 1997）。

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