全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (10) : 1511 - 1518
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 02 - 12; 修回日期 : 2009 - 08 - 04
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA10211C9)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl @njau1edu1cn)
白菜亚硝酸还原酶基因 B cN iR的克隆及表达分析
孙菲菲 1, 2 , 蒋芳玲 1, 2 , 侯喜林 1, 23 , 李　英 1, 2 , 杨学东 1, 2
(1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095; 2 农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室 , 南
京 210095)
摘 　要 : 以白菜品种 ‘苏州青 ’自交系叶片 cDNA为模板 , 采用 RT2PCR、3′RACE和 5′RACE技术 ,
获得了编码亚硝酸还原酶基因 (N iR ) 的 cDNA全序列 1 852 bp, 包含有 1 749 bp的开放阅读框 , 编码 583
个氨基酸 , 命名为 B cN iR。所推导的氨基酸序列与拟南芥 N iR1、烟草 n ii2编码的氨基酸序列具有较高同源
性 , 分别为 83%和 76%。生物信息学分析表明 , BcN iR具有完整的 N iR蛋白结构 , 含血红素蛋白β - 化合
物区域 , 一个明显的西罗血红素 siroheme结合位点和 4Fe24S区域 , 可以在 SW iSS2MODEL数据库中搜索到
与之相近的三维结构。RT2PCR结果显示 , 该基因在叶片中的表达量远远高于根系 , 在以 0、10、20、30、
40 mmol·L - 1硝态氮各分别处理 0、2、4、6、8、12 h的试验中 , 30 mmol·L - 1处理 4 h可使 B cN iR的表达
量达到最大 ; 5和 10 mmol·L - 1铵态氮处理试验表明 , 高浓度的铵抑制该基因的表达。
关键词 : 白菜 ; 亚硝酸还原酶 ; 克隆 ; 基因表达
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1021511208
M olecular C lon ing and Character iza tion of N itr ite Reducta se Gene B cN iR
from Non2head ing Ch inese Cabbage
SUN Fei2fei1, 2 , J IANG Fang2ling1, 2 , HOU Xi2lin1, 23 , L I Ying1, 2 , and YANG Xue2dong1, 2
(1 S ta te Key Labora tory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, N an jing 210095, China; 2 Key Labora tory of Shouthern
V egetable C rop Genetic Im provem ent, M in istry of A gricu lture, N anjing 210095, Ch ina )
Abstract: The B cN iR gene was cloned using RT2PCR and 3′/5′RACE techniques with cDNA isolated
from non2heading Chinese cabbage [B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis (L. ) Makino ] , which was nitrate2
induced for 4 hours. The cDNA of B cN iR was 1 852 bp containing a 1 749 bp opening2reading frame (ORF)
encoding 583 am ino acids. Further comparison showed that B cN iR had high homology to A rabidopsis tha liana
N iR1 gene and N icotiana tabacum nii2 gene, were 83% and 76% , respectively. The p redicted BcN iR p rotein
was found to have a hemop rotein beta2compnent ( ferrodoxin2like) , a siroheme2binding site and 4Fe2 4S re2
gion. A sim ilar 3D structural were obtained from the SW iSS2MODEL database. Real2time PCR analysis
showed that, the exp ressions of B cN iR were awfully higher in leaves than that in roots. Furthermore, in nitrate
treatment experiments, both the maximum exp ressions of B cN iR in roots and leaves were induced by 30
mmol·L - 1 NO3 - - N at 4 h. 5 and 10 mmol·L - 1NH4 + - N treatments indicated that high level of NH4 + -
N treatment restrained the exp ression of B cN iR.
Key words: B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis (L. ) Makino; N iR gene; cDNA; cloning; exp ression
自然界中硝酸盐和亚硝酸盐广泛分布于水体、土壤、空气和植物中。研究表明硝酸盐和亚硝酸盐
在人体内会产生不利作用 : 一方面 , 硝酸盐经生物转化生成亚硝酸盐等产物 , 降低血液的载氧能力 ,
导致高铁血红蛋白血症 ( Phillip s, 1971) ; 另一方面 , 亚硝酸盐还可与人体中次级胺 (仲胺、叔胺、
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氨基酸 ) 反应 , 在胃腔中 (pH 3) 形成强力致癌物 ———亚硝胺 , 从而诱发消化系统癌变 ( Kelley &
Duggan, 2003)。在了解了蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐积累规律的基础上 , 正在尝试一些新的措施控制
蔬菜种植和加工中硝酸盐和亚硝酸盐的生成 , 如合理施肥 (高艳波 等 , 2005; 孙治强 等 , 2005)、
选择适宜的采收期 (Am r & Hadidi, 2001)、进行食前处理 ( Taisser et al. , 1986) 等 , 而选育低硝酸
盐和亚硝酸盐含量的蔬菜品种已经作为蔬菜品质育种的一个新目标 , 因此利用植物基因工程培育高硝
酸还原酶和高亚硝酸还原酶的蔬菜品种也成为育种家广泛关注的问题。
亚硝酸还原酶 (N itrite reductase, N iR) 是植物硝态氮同化过程中一个十分重要的酶 , 该酶催化
NO2
- 还原为 NH4 + , 以 NADPH为电子供体完成 , 在白色体中完成 , 在硝酸盐降解生成铵这一过程中
起到承前启后的作用。在一些高等植物中已陆续克隆了 N iR基因 , 但是做全序列分析的很少 , 在白菜
上至今没有任何报道。本研究中克隆了白菜亚硝酸还原酶基因 B cN iR的全长 cDNA, 对其核苷酸和氨
基酸序列以及蛋白结构进行了分析 , 并通过 RT2PCR法 , 在转录水平上研究该基因在 NO3 - - N 和
NH4
+
- N 两种不同形态氮素条件下以及 NO3 - - N不同浓度和时间处理下的表达变化 , 在分子水平上
揭示氮素条件和 B cN iR基因表达的关系。
1　材料与方法
111　试验材料
白菜 [B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis (L. ) Makino ] 品种 ‘苏州青 ’自交系由南京农业大学
园艺学院白菜课题组提供。种子经双蒸水浸泡 4 h后在 25 ℃培养过夜 , 将露白的种子播种于蛭石 +
珍珠岩的穴盘中 , 出苗后浇去离子水 , 7 d后浇 1 /4 Hoagland营养液 , 以长有 3片真叶的幼苗作为试
验材料。营养液配方用 1 /2 浓度 Hoagland 营养液配方 (连兆煌 , 1994 ) , 并加以改进 , NO3 - 以
Ca (NO3 ) 2和 KNO3为氮源 , NH4 +以 (NH4 ) 2 SO4为铵源。硝态氮营养液的组成成分 (mg·L - 1 ) 如
下 : Ca (NO3 ) 2 ·4H2 O 590、KNO3 253、KH2 PO4 68、MgSO4 ·7H2 O 347、H3BO3 1143、MnSO4 ·4H2 O
1107、ZnSO4 ·7H2O 0111、CuSO4 ·5H2 O 0104、 (NH4 ) Mo7 O24 ·4H2O 0101、Na2 Fe2 EDTA (乙二胺
四乙酸铁钠盐 ) 12, 硝态氮的浓度依次为 0、10、20、30、40 mmol·L - 1。铵态氮营养液配方中去掉
Ca (NO3 ) 2 ·4H2 O 和 KNO3 , 以 (NH4 ) 2 SO4作为氮源 , 并以 CaCl2和 KCl补足营养液中 Ca2 +和 K+的
量 , 其他组分与硝态氮营养液相同 , 铵态氮的浓度为 5和 10 mmol·L - 1。为了维持营养液中 NO3 - 和
NH4
+的浓度及离子平衡 , 用 011 mmol·L - 1 KOH和 HCl调节 pH值至 615～618。分别用上述 7种营
养液 (硝态氮浓度分别为 0、10、20、30、40 mmol·L - 1 , 铵态氮浓度分别为 5、10 mmol·L - 1 ) 处
理幼苗 , 在 4 h时同时采集对照及各处理的根系及叶片 , 保存于 - 70 ℃冰箱。
另外 , 使用 NO3 - - N终浓度为 30 mmol·L - 1的营养液对幼苗进行处理 , 分别在处理 0、2、4、
6、8、12 h时同时采集对照与各处理幼苗的根系和叶片 , 作为试验材料。考虑到光照对基因表达的
影响 , 在每一个处理过程中都给予持续的光照。
112　RNA、D NA的提取和 cD NA第一链的合成
总 RNA的提取按照 RNA提取试剂盒 ( Simp ly P Total RNA Extraction Kit, B ioflux公司 ) 说明书进
行。取 2μg总 RNA用于 cDNA第一链的合成 [ TaKaRa RNA PCR Kit (AMV ) Ver1211, TaKaRa ] , 用
RNase消化 cDNA 产物。
113　B cN iR基因全长的克隆与序列分析
参照拟南芥、烟草 N iR保守区设计引物 N iR2F和 N iR2R (表 1)。以 50 mmol·L - 1 KNO3溶液诱导
4 h叶片 cDNA为模板扩增 B cN iR 基因的中间保守片段 , 扩增产物在 112%琼脂糖凝胶中进行电泳 ,
用凝胶成像分析系统进行拍照及分析。
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　10期 孙菲菲等 : 白菜亚硝酸还原酶基因 B cN iR的克隆及表达分析 　
　　采用 Invitrogen公司 3′/5′RACE System ( ver2
sion 210) 试剂盒克隆基因的末端序列 , 根据获得
的基因中间保守片段设计 3′/5′特异引物。设计两
条正向嵌套引物 N iR3′GSP1和 N iR3′GSP2, 分别
与通用引物 3′AUAP进行巢式 PCR扩增。第一轮
PCR产物稀释 10倍作为模板进行第二轮巢式扩
增。设计 5′端特异反转录引物 N iR5′GSP1, 设计
5′端扩增特异引物 N iR5′GSP2 和 N iR5′GSP3,
N iR5′GSP2与 5′AAP进行第一轮 PCR反应 , 产物
稀释 10倍作为模板 , N iR5′GSP3以和 5′AUAP进
行第二轮巢式扩增。将所得的中间序列与 3′端和
5′端序列拼接得到基因全长。克隆 B cN iR 基因引
物见表 1, 所有引物均由上海英骏生物科技公司
合成。
表 1　B cN iR基因特异引物
Table 1　Pr im ers for the clon ing of B cN iR
引物
Primer
number
引物序列
Primer sequence
N iR2F 5′2TGGGAAGTTTATGATGAGG23′
N iR2R 5′2GGGTTGACTCCGAAATAG23′
N iR3′GSP1 5′2GATGTTCTTCCACTCTGCGG23′
N iR3′GSP2 5′2GAGGAAAACTGACGGAGACAAG23′
N iR5′GSP1 5′2GCGAGAGAAGGTTCGTGTAAGG23′
N iR5′GSP2 5′2TCCCAACAGGGTTCCTCACG23′
N iR5′GSP3 5′2GGCACATCAGGCAACACAAC23′
3′AP 5′2GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT23′
3′AUAP 5′2GGCCACGCGTCGACTAGTAC23′
5′AAP 5′2GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGiiGGGiiGGGiiG23′
5′AUAP 5′2GGCCACGCGTCGACTAGTAC23′
　　扩增的特异片段按照 V itagene DNA凝胶回收试剂盒 ( genebase公司 ) 的使用说明进行回收。回
收的目的片段连接到 pMD192T载体 ( TaKaRa)。连接产物转化感受态大肠杆菌 JM109, 进行蓝白斑筛
选 , 挑取白斑接种于 3 mL LB (含 100μg·L - 1氨苄青霉素 ) 液体培养基中。37 ℃ 200 r·m in - 1振荡
培养过夜。在相同条件下进行 PCR扩增 , 琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小 , 阳性克隆由上海英
骏生物科技公司测序。氨基酸序列的同源性比较采用 DNAman完成。开放阅读框 (ORF) 在 NCB I网
站上用 ORF finder分析 , 功能位点用 InterProScan、NCB I分析 , 并通过 PROSITE、 SW ISS2MODEL等
网站对其进行结构域分析。
114　实时定量 PCR反应
采用实时定量 PCR法对 B cN iR基因的表达进行分析。内标基因选用白菜 actin基因 , 引物为 : 正
向 5′2GTTGCTATCCAGGCTGTTCT23′和反向 5′2AGCGTGAGGAAGAGCATAAC23′, PCR产物长度为 118
bp (孙淑斌 等 , 2006)。目的基因 B cN iR 的引物委托大连宝生物公司设计并合成 , 分别为 : 正向 5′2
TCCTCCTCCACCATGACTTC23′和反向 5′2TCTGAGCGGCGACGAC23′, PCR产物长度为 109 bp。
本试验在南京农业大学园艺学院 Roter Gene 3000 RT2PCR仪 ( Gene公司 ) 上进行。采用ΔΔCt
( Schm ittgen et al. , 2000) 法进行基因相对表达分析 , 同时在根系和叶片中检测 B cN iR 基因的表达 ,
以对照根系中基因的表达作为标准 , 数值设为 1, 其余样本为相对于标准 1的相对表达值 , 每个样品
设置 3次重复。使用 TaKaRa公司的 SYBR Prem ix Ex TaqTM试剂盒 , 按照操作说明进行。反应体系为
25μL反应混合物 , 每个引物最终浓度为 400 nmol·L - 1。热启动程序为 : 95 ℃变性 2 m in; 95 ℃ 10
s, 56 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 共 40个循环。每个样品设 3次重复 , 试验数据用 Roter Gene 610 ( Gene公
司 ) 和 Excel软件分析。
2　结果与分析
211　白菜 B cN iR基因 cD NA全长的克隆及序列分析
以白菜 50 mmol·L - 1 KNO3溶液诱导 4 h的叶片的 cDNA为模板 , 利用特异引物 N iR2F和 N iR2R
进行 PCR扩增 , 扩增出了一条约 850 bp左右的单一条带 (图 1, A )。根据此中间片段的测序结果设
计了 3′/5′RACE的引物 , 分别经过两轮巢式 PCR扩增 , 得到了一条约 850 bp和一条约 400 bp左右的
条带 (图 1, B和 C) , 与预期片段大小基本相符。
将两片段克隆、测序后发现 , 3′RACE的扩增片段与中间片段的 3′端具有 88 bp的重叠区 , 且含
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有 15 bp的 poly (A ) 结构 , 5′RACE的扩增片段与中间片段的 5′端具有 186 bp的重叠区 , 表明所克
隆的片段正是白菜 B cN iR的 3′末端和 5′末端序列。对克隆到的中间片段和 RACE产物进行拼接 , 结果
表明 : 该 cDNA全长为 1 852 bp, 含有 1 749 bp的完整开放阅读框 (图 2) , 编码 583个氨基酸的蛋
白 , 将此基因命名为 B cN iR , 登录号为 EU499384。
图 1　B cN iR基因的 PCR扩增结果
A: B cN iR 特异片段的电泳检测结果 (1: B cN iR特异片段 PCR产物 ; M: DNA标准分子量 M Ⅲ) ;
B: 3′RACE扩增产物的电泳检测结果 (1: 3′RACE巢式 PCR扩增产物 ; M: DNA标准分子量 DL2000) ;
C: 5′RACE扩增产物的电泳检测结果 (1: 5′RACE巢式 PCR扩增产物 ; M: DNA标准分子量 DL2000)。
F ig. 1　Electrophoresis results of B cN iR gene fragm en ts
A: Electrophoresis result of B cN iR gene fragment (1: Electrophoresis result of B cN iR fragment; M: DNA markerM Ⅲ) ;
B: Electrophoresis result of 3′RACE p roduct (1: The nested PCR p roduct of 3′RACE; M: DNA marker DL2000) ;
C: Electrophoresis result of 5′RACE p roduct (1: The nested PCR p roduct of 5′RACE; M: DNA marker DL2000) .
序列分析表明 , 该基因在启始密码子 ATG的 2 3位为 A , 符合 Kozak规律 , 在 3′端有 polyA尾 ,
这些都符合有效翻译的基因全长 cDNA的特征。
基于 ProtParam和 Vector NTi Suite 610, B ioEdit, ClustalW等数据库和软件的预测和分析 , B cN iR
预测计算的等电点 (p I) 为 6122, 分子量大小约为 651022 kD。
TMHMMv210跨膜分析表明 B cN iR 没有跨膜结构 , 与疏水分析的结果是一致的。分析结果表明
B cN iR在膜上没有功能 , 因此可能存在细胞质 , 这与 B cN iR的功能符合。
212　推测的白菜 BcN iR氨基酸序列及其二级结构和三维结构分析
由 ncbi站点的 ORF分析推测的白菜 B cN iR 基因编码的 N iR 的氨基酸序列进行 Motif搜索
( http: / / au1expasy1org/ tools/ scanp rosite / ) 和蛋白结构域 ( http: / / www1ebi1ac1uk / interProScan / ) 分
析。结果表明 : 所推导的氨基酸序列具有完整的 N iR结构 , 含血红素蛋白β - 化合物区域 ( hemop ro2
tein beta2compnent, ferrodoxin2like: aa116～186, aa375～444) , 一个明显的西罗血红素结合位点 ( siro2
heme2 binding site: aa500～516)、4Fe24S区域 (4Fe24S region: aa194～354, aa 451～567)。
由白菜 B cN iR基因 cDNA序列推测的 N iR氨基酸序列与其他植物 N iR氨基酸序列进行同源性比较
(图 3)。白菜 N iR的氨基酸序列与拟南芥 N iR1 (A rabidopsis tha liana N iR1 NM _106425) 和烟草 nii2
(N icotiana tabacum n ii2 AB103507) 同源性较高 , 分别达到 83%和 76% , 而与其他植物的 N iR基因同
源性很低 , 均低于 40%。
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　　TOPiTS ( http: / /www1Embl2heidelberg1de /p redictp rotein /p redictp rotein1 htm l)、 SOMPA ( http: / /
np sa2pbil1 ibcp1fr / cgi2bin /np sa automat1p lpage = /NPSA / np sa_news1 htm l) 等数据库及网站被用来进行
B cN iR二级结构分析 , 结果表明 B cN iR由 130个螺旋 , 121个延伸链和 332个自由卷曲连接 , 不存在
跨膜结构域。
SW iSS2MODE ( http: / / swissmodel1expasy1org/ /SW iSS2MODEL1htm l) 分析发现数据库中和 B cN iR
同源的三维结构图 (图 4)。
图 2　B cN iR的 cD NA核苷酸序列及其翻译的氨基酸序列
方框中为起始密码子和终止密码子。
F ig. 2　Nucleotide and am ino ac id sequence of B cN iR
Initial and term inal codons were in the boxes.
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213　不同氮素条件对 B cN iR基因表达的影响
由图 5～图 7可见 , 叶片中 B cN iR基因的转录明显高于根系 , 几乎是根系的 4倍之多。在不同水
平的 NO3 - - N处理下根系和叶片中 B cN iR基因都是在 30 mmol·L - 1 NO3 - - N浓度下达到最大表达
量 , 根系中相对于对照增加了 118倍 , 叶片中也增加了 3倍 , 40 mmol·L - 1下的表达量较 30 mmol·
L - 1有少许下降 (图 5)。以含 30 mmol·L - 1 NO3 - - N的营养液对白菜根系和叶片的 B cN iR基因持续
诱导 , 无论在根系还是叶片 B cN iR的表达都是在 4 h达到最大值 , 6 h时虽然有所下降 , 但是下降幅
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度很小 , 在 12 h叶片中仍然有很高的表达量 , 几乎达到对照的 217倍 (图 6)。NH4 + - N 诱导对
B cN iR基因的表达有一定的抑制作用 , 在 5 mmol·L - 1 NH4 + - N诱导条件下 , 根系和叶片中该基因的
表达量下降了约 20% , 在 10 mmol·L - 1 NH4 + - N处理下 , 下降了约 50% (图 7)。
3　讨论
本试验条件下 , 30 mmol·L - 1 NO3 - - N 诱导 4 h可使 B cN iR 基因的表达达到高峰 , 高于 30
mmol·L - 1NO3 - - N或长于 4 h的诱导时间都不能再提高 B cN iR 的表达 (图 5, 图 6) , 这可能是由
于 , NO3 - - N刺激 B cN R基因的表达从而增加了酶蛋白的合成 , 使硝酸盐的同化效率增加 , 进而产生
了较多的氮代谢产物 , 如 NH4 + 、谷氨酰胺、天冬酰胺等 , 这些代谢产物的积累对 B cN R基因的表达
产生了反馈抑制作用 ( Glass & Siddiqi, 1995; Krapp et al. , 1998; Kronzucker et al. , 1999; Fraisier et
al. , 2000; V idmar et al. , 2000 ) , 同时也对 B cN iR 基因的表达产生了反馈抑制作用。Andrea等
(2000) 也认为 , 谷氨酰胺和 (或 ) 天冬酰胺在体内积累对 N R 基因表达有负调控作用。因此 , 10
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mmol·L - 1的 NH4 + - N处理降低了 B cN iR基因的表达 (图 7)。Sun等 (2008) 报道 , 白菜叶片中硝
酸还原酶基因 B cN R在 30 mmol·L - 1 NO3 - - N诱导下 4 h后基因表达量达到最大值 , 而 NH4 + - N处
理抑制了该基因的表达 , 本研究中 B cN iR与其 B cN R在叶片中表现出几乎相同的表达模式 , 这意味着
它们在各自的启动子区共享一个调节元件 , 这与 Back等 (1991) 在菠菜上的报道一致。本研究克隆
的白菜 B cN iR基因为进一步分离该基因的启动子序列 , 构建其植物表达载体 , 以及为利用基因工程手
段创造低亚硝酸盐含量的白菜新品种奠定了基础。
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