全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（8）：1213–1219
Acta Horticulturae Sinica
珠美海棠MzWRKY基因家族盐胁迫应答模式研
究
蒋阿维，张素维，孙杨吾，褚欣然，赵 宇，许雪峰，孔 瑾*
（中国农业大学农学与生物技术学院，北京市果树逆境生理与分子生物学实验室，北京 100193）
摘 要：对苹果属植物现有的 58个 WRKY 的 EST序列进行分析，得到了 37条 uniESTs。珠美海棠
（Malus zumi Mats）是耐盐的优良苹果砧木，能在土壤全盐含量为 0.6%的盐碱地上存活。根据已知的 37
条 uniESTs序列，通过半定量 RT-PCR研究了珠美海棠中MzWRKY基因家族的盐应答模式。28个MzWRKY
基因能检测到 RT-PCR的产物，其中 21个基因受盐诱导，1个受盐抑制。根据 MzWRKY基因盐应答模式
可将这些基因分为两组，基因表达模式的差异说明 MzWRKY在珠美海棠的盐应答中角色的多样性。
关键词：珠美海棠；WRKY转录因子；盐胁迫；半定量 RT-PCR
中图分类号：S 661 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）08-1213-07

Expression Analysis of WRKY Family in Response to Salt Stress in Malus
zumi Mats
JIANG A-wei，ZHANG Su-wei，SUN Yang-wu，CHU Xin-ran，ZHAO Yu，XU Xue-feng，and KONG
Jin*
（Laboratory of Stress Physiology and Molecular Biology for Fruit Tree，College of Agriculture and Biotechnology，China
Agricultural University，Beijing 100193，China）
Abstract：Sequence assembly from 58 Malus WRKY ESTs resulted in 37 uniESTs. Malus zumi Mats
is a salt-tolerant rootstock of apple，which could survive in 0.6% total salt content of land. Primers were
designed in M. zumi Mats according to the 37 uniESTs，semi-quantitative RT-PCR was applied to reveal
the expression patterns of MzWRKY gene family in response to salt stress. RT-PCR products of 28
MzWRKY genes were detectable, 21 MzWRKYs were up-regulated and 1 MzWRKY was down regulated
under salt stress. According to the peak hour，the MzWRKYs were classified into 2 groups. The different
expression patterns of MzWRKY genes suggested that WRKY proteins play various roles in response to salt
stress in M. zumi Mats.
Key words：Malus zumi Mats；WRKY transcription factor；salt stress；semi-quantitative RT-PCR

WRKY转录因子因其家族成员均含有保守的WRKYGQK七肽而得名。1994年在甘薯中克隆了
第一个WRKY（SPF1）转录因子，并发现 SPF1参与甘薯糖信号途径（Ishiguro & Nakamura，1994）。
WRKY在拟南芥、水稻、杨树中分别有 74、109和 104个成员（Pandey & Somssich，2009）。该家

收稿日期：2010–03–29；修回日期：2010–05–05
基金项目：国家自然科学基金项目（30600416）；北京市自然科学基金项目（5072027）；中央高校基本科研业务费专项（2009-2-06）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：jkong1973@yahoo.com.cn）
1214 园 艺 学 报 37卷
族成员都含有 1 ~ 2 个保守的 WRKY 结构域，由约 60 个氨基酸残基组成，包括一个高度保守的
WRKYGQK七肽和一个锌指结构（C2H2或 C2HC）。此外部分WRKY还含有亮氨酸拉链、丝氨酸
—苏氨酸富集区、谷氨酸富集区、脯氨酸富集区等转录因子中常见的氨基酸结构域，少部分WRKY
还含有病原体抗性基因所具有的 TIR（Tolland inter leukin-1 receptor）、NBS（Nucleotide binding site）、
LRR（Leucine-rich repeat）结构（Jebanathirajah & Pandey，2002）。WRKY通过特异结合靶基因启
动子中的 W盒（T）（T）TGAC（C/T），来调控靶基因的转录水平，参与植物对生物及非生物胁迫
的应答，调控植物生长发育、形态建成及多种代谢途径，行使其生物学功能。
近年来的研究表明，WRKY参与植物对盐胁迫的响应，如在拟南芥（Jiang & Deyholos，2009）、
Larrea tridentata（Zou et al.，2007）、水稻（Qiu et al.，2004）、番茄（Zhou et al.，2007）、小麦（Kawaura
et al.，2008）、大豆（Zhou et al.，2008）、遏蓝菜（Wei et al.，2008）等多个物种中发现WRKY参
与盐胁迫应答反应；在水稻中超表达 OsiWRKY（李南羿和郭泽建，2006）、在拟南芥中超表达
GmWRKY45（Zhou et al.，2008）和 OsWRKY45（Qiua & Yu，2009）等均能提高转基因植株的耐盐
性。
珠美海棠（Malus zumi Mats）能在土壤全盐含量为 0.6%（100 mmol · L-1）的盐碱地上生长（顾
逎良 等，1996），是一种耐盐性很强的优良苹果砧木。但其耐盐机理的分子生物学研究很少有报道，
只有珠美海棠盐胁迫下微列阵（microarray）研究的初步报道（刘佳 等，2009）。目前数据库中没有
珠美海棠 MzWRKY基因序列信息。对苹果属植物现有 WRKY 的 EST序列进行序列比对分析，通过
半定量 RT-PCR分析珠美海棠 MzWRKY基因家族的盐胁迫应答模式。本文首次报道 WRKY在乔木
珠美海棠中参与盐应答。
1 材料与方法
1.1 材料培养与处理
试验于 2008—2009年在中国农业大学进行。珠美海棠（M. zumi Mats）组培苗在生长培养基（MS +
0.5 mg · L-1 BA + 0.5 mg · L-1IBA）上生长到茎木质化后转移至生根培养基（1/2MS + 1.0 mg · L-1
IBA），待根长 3 ~ 4 cm后转移到半营养液中，2周后移入完全营养液。日光灯恒定光源，光强 1 500
lx，光照 12 h · d-1，温度 24 ~ 28 ℃。苗高 5 ~ 6 cm时用 150 mmol · L-1 NaCl进行胁迫处理，处理 0、
1、2、4、8、12和 24 h后分别收集根与叶，液氮速冻后置于–80 ℃冰箱保存备用。
1.2 RNA提取和cDNA合成
采用 CTAB法提取植物 RNA，经 DNase I消化去除 DNA。取 0.5 µL RNA，通过 1%的琼脂糖
凝胶电泳检测 RNA完整性；取 1 µL RNA用 UnicPC-2102型紫外分光光度计测定 260、280 nm的光
密度值，计算 OD260/OD280的比值，估算 RNA 的纯度，并通过 OD260的值计算每个样 RNA 含量。
每个样品取 4 µg RNA，按照 Promega M-MLV说明书合成单链 cDNA，于–20 ℃保存。
1.3 EST分析及引物合成
从 NCBI EST 库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索苹果属植物 WRKY 的 EST 序列，用
DNAMAN 软件进行序列拼接，得到的 uniESTs 在 NCBI blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST/） 中进行同源比对，根据 uniESTs序列，用 Primer Premier 5在推测的不同外显子区设计基
因特异引物（表 1）。
8期 蒋阿维等：珠美海棠MzWRKY基因家族盐胁迫应答模式研究 1215
1.4 珠美海棠MzWRKY基因的半定量RT-PCR
半定量 RT-PCR以单链 cDNA为模板，引物为 MzWRKY基因特异引物 （表 1） 及内参 MzACTIN
引物（上游引物 5′-CAATGTGCCTGCCATGTATG-3′；下游引物 5′-CCAGCAGCTTCCATTCCAAT-
3′），同时以 DNA为模板扩增各 MzWRKY 基因作为阳性对照。根据引物 Tm值和基因丰度差异，扩
增各 MzWRKY基因退火温度 53 ~ 57 ℃，产物长度 300 ~ 500 bp，循环数 26 ~ 40圈（表 1），扩增
MzACTIN用 27个循环。PCR体系为：2 × PCR Mix 5 µL，正、反向引物（10 mmol · L-1） 各 0.5 µL，
cDNA 0.4 ~ 0.9 µL，加 ddH2O至 10 µL。PCR程序为：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，53 ~ 58 ℃ 30 s，
72 ℃ 30 s，27 ~ 40个循环；72 ℃ 10 min。取 4 µL PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 珠美海棠MzWRKY基因盐应答模式分析
用Gel-Pro analyzer凝胶定量分析软件读取RT-PCR产物电泳条带的光密度值，根据基因 RT-PCR
产物与同批 MzACTIN的光密度比值，计算各基因的转录值。对基因转录值提高 1倍以上或降低 1/2
以下的基因，按基因表达峰值出现的时间分类。
2 结果与分析
2.1 苹果EST序列分析
在 NCBI上检索得到的 58条苹果属植物的 WRKY EST序列，经 DNAMAN 软件进行拼接后，
得到 37个 uniESTs，包括 12个 contigs和 25个 singlets。根据后期基因盐应答模式的研究，对 37个
uniESTs进行命名（表 1）。
在 NCBI blast中进行序列相似性比对发现，16个MzWRKY基因含有编码WRKY结构域的基序：
MzWRKY3、MzWRKY9、MzWRKY11、MzWRKY12、MzWRKY13、MzWRKY15、MzWRKY16、MzWRKY17、
MzWRKY18、MzWRKY21、MzWRKY22、MzWRKY23、MzWRKY24、MzWRKY28、MzWRKY29、
MzWRKY30；15个 MzWRKY基因通过同源比对，在同源基因中能找到编码WRKY结构域的基序：
MzWRKY1、MzWRKY2、MzWRKY4、MzWRKY6、MzWRKY7、MzWRKY10、MzWRKY19、MzWRKY20、
MzWRKY25、MzWRKY26、MzWRKY27、MzWRKY31、MzWRKY32、MzWRKY33、MzWRKY34；6 个
MzWRKY基因含有编码 LRR的基序，与 TIR-NBS-LRR基因的同源性高，其中MzWRKY5、MzWRKY8、
MzWRKY35、MzWRKY36、MzWRKY37与 AtWRKY19、MzWRKY14与 AtWRKY52有一定相似性。
表 1 扩增珠美海棠MzWRKY基因的引物序列及扩增条件
Table 1 Primer sequences and PCR parameters of MzWRKY cDNA fragments amplification
基因
Gene
登录号
Accession No.
上游引物 5′–3′
Forward primer
下游引物 5′–3′
Reverse primer
退火温度/℃
Anneal
temperature
循环数
Cycles
MzWRKY1 GO502058 AGGCAATGTTTCTGGTGAGG GCCTGGTGCTGAAGATTG 55 36
MzWRKY2 GO561746，
DT040989
TGACTCCTTCTCCTACCTCCTC AAGCATTTCTTTCAGCCTCT 53 34
MzWRKY3 DT002302 GAATGGGATTGAAGGACC CTTGAGACTGCTGTTGTTGA 55 31
MzWRKY4 DT002887 CCGACGAGATTCCGACCAAC GCCATCGGTAGCCATCATCT 55 30
MzWRKY5 GO547781 CCTTGCCTATTTGTTGTCTT TAATGGCTGTTGGAGACTTG 51 32
MzWRKY6 GO500903 GAACTGGATGATGCCAAAGC ATCGTCTTCGGCGTCTTA 53 40
MzWRKY7 GO546566 CACGATACTCGTTTGAATGAC CTAGTGCGTCTGGTTCCA 53 30
MzWRKY8 GO525780 GCCTTAGGACAACCTCTGAT ATGCCCACTCCCTCCAAG 55 30

1216 园 艺 学 报 37卷
续表 1
基因
Gene
登录号
Accession No.
上游引物 5′–3′
Forward primer
下游引物 5′–3′
Reverse primer
退火温度/℃
Anneal
temperature
循环数
Cycles
MzWRKY9 GO498871,DT04
3808,DR992119
GTTGTTCAGCAGGCTACGAT CTCTTGGAGCAATGGCACT 55 30
MzWRKY10 EZ878972 TGCTGCTACTGACAAATGG CCTGTGGGCTGTTGTTG 57 30
MzWRKY11 CV627700，
CO723222
GGCAACTTCAGGTCAGTAGAG GCACCCTTCAACTGAGCAC 57 36
MzWRKY12 FE969653 TGCATCGGTGCGAACATA CCGTGCCAATGATAGTCG 53 28
MzWRKY13 GO499623 AACCCCTGAAACCACTGC CCACTTCTTGTCTTCCGTCA 57 34
MzWRKY14 GO517111 GGATGGGTGTTACCGTGAT GCAGAGGGAAGTCAGACATAC 57 33
MzWRKY15 DR998023,
DR993009,
DR990752
CTGAGACAGAAGAGGGTTG CCGAGTCAGTCCGAGTT 55 34
MzWRKY16 GO530901,GO53
1040,GO526785，
DT043192
ATGGTTGCCTCGGTTGAT AGTGGAGGTGCAACGTATG 51 36
MzWRKY17 GO516755，
GO565343，
GO539764
AACGAACCTGAGGCGAAAAG AATGGTTAGGCAATGGCAAG 53 30
MzWRKY18 GO535736 CATGACAAAGAGCGAAGTTG AAGGCGAAGAGGAGTTGTTA 55 30
MzWRKY19 GO512183 AGCAGAACCAGCACCAAG GGTCAACGACGACATAAACG 55 30
MzWRKY20 GO544291 CCCTGCCTCACTATCCCT TTAGCCAAAGTTGGTGATGC 55 30
MzWRKY21 GO557531,
GO514603
ATGCCCAGGTGGACTAAG ATGGCACGGTGACACTGT 57 28
MzWRKY22 DT002891 CCACAGCCAATACTGATAGG TTGGAGGTTGAGGCTTCG 55 35
MzWRKY23 GO520175,GO53
5081,GO538119,
GO555359
GCTGGTTCATCCCGAAAGAG TGCAGGCGCAGAATGGTAC 57 30
MzWRKY24 GO546794,
EZ878974，
DT040936，
DR999455
AACAGATTATGAGCGACCAGG CGGCAGCGGGATTTGA 55 33
MzWRKY25 GO562085 CGACTCTTCGGATTCTCA TTTCCGTTTCACCTTCCA 51 33
MzWRKY26 GO556310,GO52
1230
ATAGCCGCTCCGATTTGT CATGAGAGGTTGTCCAGCAA 53 30
MzWRKY27 GO546748 GTTTCACTGCCATCAGCCTA CGCTCCTGTTTCCATGAAC 55 30
MzWRKY28 GO577517,
GO577505
TCCTGAAGACGGGGTATAAC AGCTTCCCATCTGATGAGAA 55 40
MzWRKY29 DT043766 CAGGCTTTTGAATCTTTACAT ATTGATGGTGTCGTGGTT 53 40
MzWRKY30 DT002743 TAATCCTGTCCACCAAACGA GCTGTGCTTGCAGCTTCTC 55 40
MzWRKY31 GO528515,
GO562085
TTCCACATGTTAAGCGATCA TGCACCGTGCATATTGACA 51 40
MzWRKY32 GO565958 TCTGCTCCGTGGACTTTC TCTGCTCCGTGGACTTTC 55 40
MzWRKY33 GO509807 CCGCACTCGACCAACCTT CCTTATCTGCCCATTGTTTG 55 40
MzWRKY34 GO502176 AACCACCCAAGGATACCA CCATCTGTGACTTGGCTTCT 53 40
MzWRKY35 GO567554 GCTTTCAACAGCTTTCGTAAC GCTTTGATGGATTAGATGGT 51 40
MzWRKY36 GO518865 CTCCGTGAACGAGGTCTTG CACGCCAGCACAACCATA 55 40
MzWRKY37 GO500060 ATGAGCCAGGTGGTCGTA TGCTATGCCGCAGACTAA 53 40

8期 蒋阿维等：珠美海棠MzWRKY基因家族盐胁迫应答模式研究 1217
2.2 珠美海棠MzWRKY基因的半定量RT-PCR
37个 MzWRKY 基因的阳性对照（总 DNA）均能得到扩增，28 个能在 cDNA 中得到扩增。编号
28 ~ 37的 9个基因未能在 cDNA中得到扩增，推测它们的转录水平很低，其表达也不受盐胁迫诱导。
图 1 不同盐处理时间下珠美海棠MzWRKY基因的表达分析
A：根中受盐胁迫诱导；B：根中不对盐胁迫应答；C：叶中受盐胁迫诱导；D：叶中受盐胁迫抑制；E：叶中不对盐胁迫应答。
Fig. 1 Expression analysis of MzWRKY genes under salt treatments in M. zumi Mats
A：Induced by salt stress in root；B：Not response to salt stress in root；C：Induced by salt stress in in leaves；
D：Down-regulated by salt stress in leaves；E：Not response to salt stress in leaves.

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3个基因的表达具有组织特异性：MzWRKY5及 MzWRKY6仅在根中表达，MzWRKY20仅在叶中
表达。根中扩增得到 26个MzWRKY基因，MzWRKY1 ~ MzWRKY18等共 18个基因受盐胁迫诱导（图 1，
A），MzWRKY19 ~ MzWRKY27等共 8个基因的表达无明显变化（图 1，B）；叶片中扩增得到 25个
MzWRKY中，15个基因的表达受盐胁迫诱导（图 1，C）、1个基因受盐胁迫抑制（图 1，D）、9个
基因的表达无明显变化（图 1，E）。
2.3 珠美海棠MzWRKY基因盐胁迫应答模式分析
根据盐胁迫下在根和叶中转录峰值最先出现的时间，将盐应答 MzWRKY基因分成两组。第一组
基因在根或叶中的表达峰值出现在盐胁迫后 1 h，有 6个基因：MzWRKY1、MzWRKY2、MzWRKY3、
MzWRKY4、MzWRKY17、MzWRKY19。第二组基因在根或叶中的表达峰值出现在盐胁迫下 1 h以后，
表达峰值出现的时间分别为 2 h（MzWRKY5 ~ MzWRKY8）、4 h（MzWRKY9、MzWRKY10、MzWRKY16、
MzWRKY20）、8 h（MzWRKY11、 MzWRKY12、 MzWRKY13、 MzWRKY14、 MzWRKY15、 MzWRKY18、
MzWRKY21、MzWRKY22）。
3 讨论
近年研究表明WRKY转录因子参与草本植物和灌木中盐应答反应。Jiang和Deyholos（2006）发
现盐胁迫下拟南芥根组织中的35个WRKY中有18个基因受盐诱导；Qiu等（2004）研究水稻的13个
WRKY基因有9个基因的应答NaCl处理；盐胁迫下大豆64个WRKY基因中22个基因表达有差异 （Zhou
et al.，2008）；所研究的小麦48个WRKY基因中，有23个基因的表达发生变化（Kawaura et al.，2008）。
在木本植物中虽然分离了部分WRKY基因，但是仅在灌木Larrea tridentata中有WRKY参与盐应答的
报道（Zou et al.，2007）。本文首次报道在乔木中研究WRKY与盐应答的关系，发现有81% MzWRKY
基因参与盐应答，这个数据远远高于草本植物，表明WRKY在乔木珠美海棠中可能更广泛地参与盐
应答。WRKY是个超级转录因子家族，珠美海棠也可能拥有庞大的MzWRKY基因数目，目前获得的
基因数量不多，这个推测还需进一步的数据支持。
基因表达模式的差异往往与基因的功能及参与盐胁迫应答的方式相关，所以研究 MzWRKY基因
盐胁迫下的表达模式对了解 MzWRKY基因在盐胁迫应答过程中的功能至关重要。本研究发现，盐胁
迫下，21 个 MzWRKY 基因的表达受盐胁迫诱导，1 个受盐胁迫抑制。这些应答盐胁迫的 MzWRKY
基因中，有 6个基因的表达峰值出现在盐处理后 1 h，这些基因可能在MzWRKY盐胁迫调控途径的
上游发挥作用，参与盐胁迫的早期应答；16个基因表达峰值的出现晚于 1 h，这些基因可能通过调
控下游功能基因参与盐胁迫应。MzWRKY 基因盐胁迫的应答模式的差异，说明 MzWRKY 在珠美海
棠盐应答过程中角色的多样性。
本研究表明，在珠美海棠中，MzWRKY可能广泛地参与盐应答的调控。对 MzWRKY基因的进
一步的功能研究，将为揭示珠美海棠的盐应答机理奠定基础。


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