全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (12) : 1799 - 1804
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 05 - 18; 修回日期 : 2009 - 11 - 04
基金项目 : 广东省科技计划项目 (2005B20901019) ; 广东省自然科学基金项目 (05300272)3 通讯作者 Author for correspondence
蝴蝶兰多酚氧化酶基因克隆及序列分析
许传俊 1, 2 , 周文灵 1 , 陈冬茵 1 , 赖艳艳 1 , 李　玲 13
(1 华南师范大学生命科学学院 , 广东省植物发育生物工程重点实验室 , 广州 510631; 2福建省亚热带植物研究所 , 福
建厦门 361006)
摘 　要 : 利用 RT2PCR和 RACE技术从蝴蝶兰中克隆的多酚氧化酶同源基因 , 命名为 PhPPO , 其 cDNA
全长 1 851 bp, 完整的编码框长 1 647 bp, 编码 549个氨基酸 , 生物信息学分析表明其具有酪氨酸酶家族的
特征 , 具有保守的 CuA和 CuB 结合区 , 以及向叶绿体运输的导肽结构。将其亚克隆到表达载体 pPRo2
EXHTa上 , 在 BL21 (DE3) 进行表达 , 经 ITPG诱导 , 获得蝴蝶兰 PPO原核表达蛋白。
关键词 : 蝴蝶兰 ; 多酚氧化酶 ; 基因 ; 克隆 ; 褐变 ; 原核表达
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1221799206
M olecular C lon ing and Ana lysis of Hom olog ica l Gene PPO from Pha laenopsis
XU Chuan2jun1, 2 , ZHOU W en2ling1 , CHEN Dong2yin1 , LA I Yan2yan1 , and L IL ing13
(1 Guangdong Key Lab of B iotechnology for Plant D evelopm ent, College of L ife Science, South China N orm al U niversity, Guang2
zhou 510631, China; 2 Fujian Institu te of Subtropical B otany, X iam en, Fujian 361006, China)
Abstract: The PPO homolog, designated as PhPPO , was cloned from Phalaenopsis by RT2PCR and
RACE. The full length cDNA of PhPPO was 1 851 bp, has an open read frame of 1 647 bp, encoding a p ro2
tein of 549 am ino acids. B ioinformatic analysis showed that PhPPO p rotein shared the characters of tryosinase
fam ily, bearing the conserved CuA and CuB binding domains and a chlorop last2targeting leading pep tide.
Prokaryotic exp ression vectors based on pPRoEXHTa had been constructed and then exp ressed in the BL21
(DE3) induced with ITPG.
Key words: Phalaenopsis; PPO; gene; clone; browning; p rokaryotic exp ression
外植体褐变是阻碍植物组织培养成功的重要因素之一。酚类物质的酶促氧化是组织褐变的直接原
因 , 多酚氧化酶 ( Polyphenol oxidase, PPO ) 催化酚类化合物形成醌和水 , 醌经非酶促聚合形成深色
物质 , 并对外植体产生毒害作用 (姚洪军 等 , 1999)。外植体褐变过程中 PPO活性发生变化 , 是褐
变发生的原因还是结果尚需要进一步研究。Lokman等 (2008) 外施乙烯利提高了菠菜 PPO活性 , 认
为乙烯利不是直接通过激活酶而是通过提高 PPO的转录水平来实现。抑制马铃薯 PPO基因表达可降
低马铃薯块茎的褐变 (王清 等 , 2007)。在蝴蝶兰外植体褐变过程中酚类物质的含量与褐变发生的程
度呈正相关 , 叶片外植体在培养前 PPO活性低 , 随着培养时间增加 PPO呈现新的酶带 , 酶活性也升
高 (许传俊和李玲 , 2006)。蝴蝶兰褐变严重的外植体 PPO活性高于褐变轻微的外植体 (赵伶俐 等 ,
2006)。
作者从蝴蝶兰叶片中克隆 PPO基因并进行生物信息学分析和原核表达 , 为研究蝴蝶兰外植体褐
变过程中 PPO基因和蛋白变化及作用奠定基础 , 为有效抑制外植体褐变提供依据。
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1　材料与方法
111　材料及菌种
满天红 (D oritaenopsis Q ueen Beer‘RedSky’) 为蝴蝶兰 D otis Pu lcherrim a ×Phalaenopsis M eteor的杂
交种 , 无菌苗购自广东省花卉研究所。在 2 000 lx条件下光照 16 h·d - 1 , (24 ±2) ℃培养。大肠杆
菌 DH5α、BL21为本实验室保存。
112　PPO 基因全长序列的克隆
根据 Sullivan等 (2004) 设计简并引物 PPO1和 PPO2, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成 (下同 ) , 采用 Trizol法提取蝴蝶兰叶片总 RNA逆转录 cDNA , PCR扩增目的片段 ; 以引物 3′race 1
作反转录获得的 cDNA 为模板 , 分别用 PPO321和 PPO322与 3′通用引物 3′race 2进行 3′cDNA 末端扩
增。PCR程序为 : 94 ℃变性 3 m in; 94 ℃变性 30 s, 60 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 m in, 32个循环 ,
72 ℃延伸 10 m in。采用巢式 PCR利用 5′特异引物 PPO521、PPO522、PPO523与 5′Race Outer Primer和
5′Race Inner Primer (表 1, 由 TaKaRa公司 5′Race试剂盒提供 ) 进行 PPO 基因 5′端扩增。PCR 程序
为 94 ℃变性 3 m in; 94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 m in, 30个循环 , 72 ℃延伸 10 m in。
测序结果通过 Editseq软件整合后 , 获得 PPO全长序列。基于 Internet的 DNA和氨基酸序列分析 , 利
用 NCB I的 BLAST程序进行 ( http: ∥www1ncbi1nlm1nih1gov/BLAST)。
使用 DNAStar软件分析基因的预测读码框 (ORF) , N端蛋白序列分析采用 iPSORT (Bannai et
al. , 2002) 和 Signal IP3 (Bendtsen et al. , 2004) ; 氨基酸序列多重排比 (multip le sequences align2
ment) 采用 DNA star软件中的 Clustal W 程序进行 ; 利用 MEGA311软件进行进化树的构建 , 采用
Bootstrap检验法 , 默认的泊松校验 ( Poisson Correction) 作为计算距离的方法 , 1 000次重复。采用
SW ISS2MODEL ( http: ∥ swissmodel1expasy1org/ ) 对蝴蝶兰 PPO 的二级结构进行预测 , 并用软件
W eblab V iewerilte 410进行分析。
表 1　蝴蝶兰 PPO 基因克隆及原核表达所用引物
Table 1　Sequences of pr im ers used in PPO clone and prokaryotic expression
引物名称 Primer 引物序列 Primer sequence
O ligo dT 5′- 3′TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTN
- 1N
PPO1 5′- 3′CAACAAGCTA (A /G) ( G/T) (A / G) T(A /C /T) CATTGTGCTT
PPO2 5′- 3′ATCCCAATTCCA (A /G) (A /T) A (A /C /T) GG
3′Race1 5′- 3′GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT
3′Race2 5′- 3′GACTCGAGTCGACATCG
PPO321 5′- 3′ATCGTTTTTATCTTTATTTCCATGA
PPO322 5′- 3′TGAGCGCATTCTCGGAAAGCTTATT
5′Race outer 5′- 3′CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
5′Race inner 5′- 3′CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
PPO521 5′- 3′CAAGGGAAGAAAAGCCAGCAGTTAT
PPO522 5′- 3′TTGGTCATAGGCGGCGTCGCAGTAC
PPO523 5′- 3′CAGTACGCACAGTGCACATTAGCCT
PPOY21 5′- 3′GAATTCCCCATCCAACCGCCGGATCTAAAAC
PPOY22 5′- 3′CTGCAGTCAAGAAACCAGCACGATCGACAGC
　　注 : 下划线示酶切位点。
　　Note: The underline showed site of enzyme digetion.
113　原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达与 SD S2PAGE分析
设计 PPO原核表达引物 , PPOY21和 PPOY22 (表 1) , 在两端分别引入 EcoRⅠ和 PstⅠ酶切位点。
PCR扩增条件 : 94 ℃变性 3 m in; 94 ℃变性 30 s, 60 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 90 s, 34个循环 , 72 ℃
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　12期 许传俊等 : 蝴蝶兰多酚氧化酶基因克隆及序列分析 　
延伸 10 m in。PCR产物经回收、连接、转化、酶切检测、测序后 , 把验证正确的表达菌进行诱导表
达 , 将菌液接种于 3 mL LB培养基 (Amp + ) 中 , 37 ℃继续振荡培养 2 h后 (OD 值大约为 015左
右 ) , 加 ITPG至终浓度为 015 mmol·L - 1 , 37 ℃继续振荡培养 4 h。收集菌体进行 SDS2PAGE分析 ,
分析 PPO基因的原核表达情况 , 所用载体为 pPRoEXHTa, 表达菌为大肠杆菌 BL21。
2　结果与分析
211　蝴蝶兰 PPO 基因克隆
电泳结果显示 , PCR产物在约 190 bp处有特异带扩增 (图 1)。测序结果和同源性分析也证明该
片段即为 PPO目的基因的部分 cDNA序列。根据已经获得的 PPO片段设计特异引物 , 分别进行 3′和
5′Race (图 2) , 将目的片段进行回收、测序 , 结果证实 , 获得蝴蝶兰 PPO cDNA序列 3′端和 5′端。
将获得的蝴蝶兰 PPO基因命名为 PhPPO , cDNA全长为 1 851 bp, 读码框 (ORF) 为 1 647 bp, 两端
分别为 26 bp的 5′-非翻译区 (5′2UTR) 和 178 bp的 3′-非翻译区 (3′2UTR)。
图 1　RT2PCR克隆蝴蝶兰 PPO 片段
F ig. 1　Fragm en t of Pha laenopsis PPO gene
图 2　蝴蝶兰 PPO 基因的 5′Race ( A) 和 3′Race ( B)
F ig. 2　5′Race and 3′Race clone of Pha laenopsis PPO gene
A: PCR of 5′Race; B: PCR of 3′Race.
212　蝴蝶兰 PPO 基因序列分析
DNA star分析表明 PhPPO编码的蛋白由 549个氨基酸组成 , 分子量为 60143 kD, p I为 7127。在
NCB I蛋白 blast搜索结果显示 , 编码的蛋白属于酪氨酸酶超基因家族蛋白 , 具有 PPO蛋白典型的特
征 , 有两个保守的 Cu结合区 : CuA结合区 , CuB结合区 , 多重序列比对结果显示 , PPO中间序列高
度保守 (图 3) , CuA结合区和 CuB结合位于 N端区 , 每个 Cu结合区有 3个保守的 H is, CuA结合区
还有一个保守的 Cys, 在二级结构中与 H is形成酯键。CuB结合区中有一个 F, 推测起到功能调节因
子的作用 , 在 CuB 结合区下游有一个“Tyrosine motif”( Prieto et al. , 2007 )。在 http: ∥
www1cbs1dtu1dk / services/ChloroP /和 http: ∥ hc1 im s1u2tokyo1ac1 jp / iPSORT/上分析 PhPPO 亚细胞定
位 , 表明 PhPPO分布于叶绿体中。在 PhPPO的 N端具有向叶绿体运输的 41氨基酸的转运肽 , 运输到
叶绿体剪切后的多肽在 22个氨基酸处还有一个剪切位点。系统进化分析结果表明 , PhPPO与来自其
它物种的 PPO亲缘关系较远 , 与单子叶植物粗山羊草 (A egilops tausch ii)、普通小麦 ( Triticum aesti2
vum ) 等的 PPO为同一个祖先进化而来 (图 4)。
PhPPO具有 6个α螺旋 , 6个β折叠 (图 5和表 2) , 每 3个 H is与一个 Cu结合 , Cys2155通过硫
脂键与 CuA结合 , CuA区与 PPO水溶性相关 , CuB为底物结合区。
213　构建蝴蝶兰 PPO原核表达载体及原核表达
将原核表达载体转化大肠杆菌 E1coli BL21。抽提阳性转化子质粒进行 EcoRⅠ和 PstⅠ双酶切鉴
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定 , 得到 1 400 bp左右的插入片段 ( PPO) , 与预期结果相符。再经 DNA双向测序证明过程中没有引
入突变 , PPO片段已正确定向插入 pPRoEXHTa载体中。经过鉴定的阳性重组子命名为 pPRoEXHTa2
PPO (简称 pPRo2PPO)。重组菌经 IPTG诱导表达 PPO , SDS2PAGE电泳显示 , 原核表达蛋白主要存
在于包涵体中 (图 6)。
图 3　PhPPO比对结果
框内分别是 CuA和 CuB结合区 , 箭头分别示保守的 H is和 Cys, 下划线表示 tyrosine motif。
F ig. 3　M ultiple sequence a lignm en t of the Pha laenopsis deduced PhPPO prote in
Am ino acids identical are highlighted in black, and two conservation for each copper binding domains
are marked with box, respectivily. Six conservation H is and Cys are marked with arrow.
Tyrosine motif is marked with underlined.
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　12期 许传俊等 : 蝴蝶兰多酚氧化酶基因克隆及序列分析 　
3　讨论
利用 PPO反义表达载体成功转化马铃薯和苹果 (Murata et al. , 2001; 王清 等 , 2007) , 有效防
止了马铃薯的褐化和苹果的组培褐化问题。近年来对如何防止蝴蝶兰外植体褐变的研究成为大家关注
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的问题 , 但多集中在不同的培养基和培养条件 , 以及加抗氧化剂和吸附剂对蝴蝶兰外植体褐变的影响
(姚丽娟 等 , 2006; 赵伶俐 等 , 2006) 等方面。
本研究中通过 RT2PCR和 RACE技术获得蝴蝶兰 PPO cDNA序列 , 命名为 PhPPO ( GenBank登录
号为 EF36355311)。蛋白序列比对分析结果表明 PhPPO与凤梨 (Ananas com osus PPO, AAO16865)、
苜蓿 (M ed icago sa tiva subsp. sa tiva PPO , AAP33165)、一粒小麦 ( T. m onococcum subsp. aeg ilopoides
PPO, ACB12082)、葡萄 (V itis vin ifera, CAO23306) 等有较高的相似性 ; Cu结合区 : 6个 H is和一
个 Cys组成保守的活性结构 , 是为 Type23型酪氨酸酶 , N端具有向叶绿体运输的转运肽结构 , 说明
PhPPO可能分布于叶绿体。本研究成功构建了原核表达载体 , 通过 ITPG诱导获得 PPO原核表达蛋
白 , 为下一步制备抗体 , 分析蝴蝶兰叶外植体褐变过程中 PPO 蛋白含量和分布的变化奠定了基础 ,
有效抑制外植体褐变提供了理论依据。
研究选用 pProEXHTa载体在大肠杆菌 BL21中表达蝴蝶兰 PPO蛋白基因片段 , 由于 pProEXHTa
载体所表达的蛋白含有 6个连续 H is, 在融合蛋白上设有组氨酸标签 , 一方面有利于所表达的融合蛋
白分离纯化 , 使外源蛋白可通过亲和层析快速纯化 , 获得大量易于纯化的蛋白抗原 , 为进一步制备抗
体奠定基础 ; 另一方面有利于融合蛋白的 W estern B lot检测。
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