全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (2) : 221 - 226
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 15; 修回日期 : 2008 - 12 - 15
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30671419, 30700541 ) ; 国家高技术研究发展计划专项 ( 2006AA100108, 2006AA10Z108,
2008AA10Z150) ; 教育部 ‘111’计划项目 (B08025) ; 国家支撑计划项目 ( 2006BAD13B06, 2006BAD01A725211) ; 江苏省高新技术
项目 (BG2007301)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jfchen@njau1edu1cn)
黄瓜游离小孢子培养诱导成胚和植株再生
詹　艳 , 陈劲枫 3 , Ahmed AbbasMalik
(南京农业大学园艺学院 , 作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095)
摘 　要 : 以 10个不同基因型黄瓜为试材进行游离小孢子培养 , 通过对成胚条件的系统研究 , 从
‘7447’和 ‘Poinsett97’中获得了子叶形胚和再生植株。研究结果表明 : 基因型和小孢子发育时期是限制
黄瓜游离小孢子成胚的关键因子。不同品种间胚状体产量差异显著 , 每皿产胚 115～3314个。单核靠边期
是进行黄瓜游离小孢子培养的最佳时期。低温预处理有利于胚状体的诱导 , 4 ℃预处理 2～4 d为宜 , 以处
理 2 d的胚状体产量最高。外源激素在诱导胚状体时并非必需 , 但低浓度外源激素 (015 mg·L - 1 2, 42D、
012 mg·L - 1 62BA) 能促进小孢子成胚。NLN和 B5两种基础培养基在诱导胚状体上无显著差异。子叶形胚
易分化成苗 , 而其它类型的胚状体未能获得再生植株。
关键词 : 黄瓜 ; 小孢子培养 ; 胚状体 ; 植株再生
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0220221206
Em bryo id Induction and Plan t Regenera tion of Cucum ber ( C ucum is sa tivus
L . ) Through M icrospore Culture
ZHAN Yan, CHEN J in2feng3 , and Ahmed AbbasMalik
(S tate Key Laboratory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, College of Horticu lture, N an jing A gricu ltura l U niversity,
N an jing 210095, China)
Abstract: Isolated m icrospore culture in cucumber was studied by using 10 different varieties of cucum2
ber. Cotyledonary embryoids and p lantletswere obtained from‘7447’and‘Poinsett97’genotypes for the first
time. The results showed that genotype and the developmental stage of m icrospore were the key factors in em2
bryoid induction. The embryoid yield was different significantly among different genotypes. Embryoid yield per
culture dish varied from 115 - 3314. The late2uninucleate stage of m icrospore was found op timum for isolated
m icrospore culture in cucumber. Cold2p retreatment (4 ℃) for 2 - 4 days also p romoted embryoid induction,
while the highest embryoid yield was obtained form m icrospore p re2treated at 4 ℃ for 2 days. The results also
indicated that low concentration of exogenous hormones (015 mg·L - 1 2, 42D and 012 mg·L - 1 62BA) were
conductive to embryogenesis, whereas NLN and B5 medium had no significant difference on embryoid induc2
tion. The regenerated p lantlets were obtained only from cotyledonary embryoids and no p lantlet was p roduced
from the embryoids at other developmental stages.
Key words: cucumber; m icrospore culture; embryoid; p lant regeneration
利用花药培养和游离小孢子培养可快速获得纯系和突变体 , 缩短育种年限 , 提高育种效率。但迄
今为止仅见两例黄瓜 (Cucum is sa tivus L. ) 花药培养成功的报道 ( Kumar et al. , 2003; Song et al. ,
2007) , 国内外尚无有关黄瓜游离小孢子培养成功的报道。本试验中首次通过黄瓜游离小孢子培养获
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
得了胚状体及再生植株 , 较详细地研究了小孢子离体发育过程以及基因型、小孢子发育时期、预处理
和培养基等因素对黄瓜游离小孢子培养的影响 , 为进一步建立和完善黄瓜小孢子培养体系奠定基础。
1　材料与方法
111　材料
以 10份不同基因型黄瓜材料作为游离小孢子培养的供体。其中 ‘长春密刺 ’购于新疆农业科学
院园艺研究所 , 经本实验室多代自交保存 ; ‘北京截头 ’由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供 ;
‘7011A’和 ‘Poinsett97’由美国威斯康辛大学园艺系提供 ; ‘康德 ’购于荷兰瑞克斯旺种子公司 ;
‘津优 31’购于天津科润黄瓜研究所 ; ‘7447’、‘6520’、‘6529’和 ‘宁佳 3号 ’是本实验室配制的
杂交品种。2006年秋和 2007年春将试材种植于南京农业大学园艺圃的塑料大棚中 , 常规管理。
112　小孢子分离和培养
于盛花期从健壮植株上取小孢子处于单核靠边期的花蕾。接种前将花蕾在 4 ℃下预处理 2 d。参
照 Sato等 (1989) 的方法 (稍作改动 ) 分离、纯化小孢子。将预处理后的花蕾用 70%酒精消毒 30 s,
然后用 011%升汞消毒 8 m in, 最后用无菌水冲洗 3次 , 每次 30～60 s。在无菌条件下将花蕾置于 10
mL离心管中 , 加入适量提取液 B5 213 (B5 + 13%蔗糖 ) , 用玻璃棒挤压花蕾使小孢子释放出来 , 再用
200目细胞筛过滤。滤液经 600 r·m in - 1离心 3 m in, 弃上清液。重复离心 3次至上清液无色透明 , 弃
上清液 , 沉淀即为纯化的小孢子。最后用液体培养基 (表 4) 悬浮小孢子 , 并用血球计数板计数 , 调
整小孢子密度约为 110 ×105个 · mL - 1。于超净台上用直径 60 mm的培养皿分装小孢子悬浮液 , 每皿
2 mL, 用 Parafilm封口膜封口后 , 在 25 ℃下进行静止暗培养 , 至产生肉眼可见的胚状体。之后进行
60 r·m in - 1振荡暗培养 , 至形成子叶形胚。培养 30 d后 , 将子叶形胚及部分球形胚转移至胚状体萌
发培养基 MS2BA (MS + 012 mg·L - 1 62BA + 3%蔗糖 + 018%琼脂 ) 上 , 25 ℃光照 16 h培养。而另一
部分球形胚继续在诱导培养基中进行振荡暗培养。
113　各因素对小孢子培养的影响试验
基因型试验 : 以上述 10份材料为试材 , 在胚状体诱导培养基 [NLN + 015 mg·L - 1 2, 42D + 012
mg·L - 1 62BA + 13%蔗糖 (表 4, B培养基 ) ] 上培养。
小孢子发育时期试验 : 以 ‘长春密刺 ’、‘Poinsett97’和 ‘康德 ’3份材料为试材 , 分别取单核
早期和单核靠边期的小孢子在胚状体诱导培养基 (表 4, B培养基 ) 上培养。
温度试验 : 以 ‘7447’、‘长春密刺 ’、‘Poinsett97’和 ‘康德 ’为试材 , 在胚状体诱导培养基
(表 4, B培养基 ) 上培养。低温预处理 : 将花蕾在 4 ℃下分别预处理 1、2、4和 6 d; 高温预培养 :
于接种后分别置于 33 ℃培养 1 d和 2 d。以未进行温度处理的材料作为对照。
培养基试验 : 以 ‘7447’、‘长春密刺 ’、‘Poinsett97’和 ‘康德 ’为试材 , 分别以 5种不同的胚
状体诱导培养基 (表 4) 进行培养。
试验中的所有器材除封口膜以外均用 121 ℃高压灭菌 20 m in。每个材料每个处理接种 4个培养
皿。培养过程中 , 分别于培养后 2、4、8、10和 12 d取少许培养物在 OLYMPUS显微镜下观察游离小
孢子的发育情况。在胚状体诱导培养基上培养 30 d后 , 统计胚状体产量 (平均每皿获得的胚状体个
数 , 包括处于球形、心形和子叶形等各时期的胚状体 ) 和子叶形胚产量 (平均每皿获得的子叶形胚
个数 )。在萌发培养基上培养 20 d后 , 统计植株再生率 (分化成苗的胚状体个数占接种胚状体总数的
百分率 )。
114　数据分析
M icrosoft excel软件处理数据 , 用 SPSS 1115软件进行方差分析和显著性检验。
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2　结果与分析
211　小孢子离体发育过程中的细胞学观察
显微观察发现 , 刚接种的单核靠边期小孢子呈圆球形或近球形 , 细胞内具有一个大液泡 , 大
小均匀一致 (图 1, A )。培养 2 d后部分小孢子膨大 , 细胞内大液泡消失 , 内含物增多 (图 1,
B )。4 d后发现部分小孢子发生第 1次均等分裂 (图 1, C)。2周后肉眼可见大小不均的球形胚 ,
呈乳白色 (图 1, D )。培养 30 d后 , 材料 ‘7447’和 ‘Poinsett97’的球形胚进一步发育成心形胚
和子叶形胚 (图 1, E、 F)。之后将子叶形胚及部分球形胚和心形胚转移至萌发培养基 M S2BA上 ,
培养 20 d后 , 部分子叶形胚萌发形成根叶俱全的再生小植株 (图 1, G、H ) , 部分未能正常分化
(图 1, G) , 而球形胚和心形胚则停止发育 , 褐化死亡。在诱导培养基上继续培养的球形胚和心形
胚停止发育 , 20 d后褐化死亡。
图 1　小孢子离体发育过程和植株再生
A. 新接种的单核靠边期小孢子 (200 ×) ; B. 膨大的细胞 (200 ×) ; C. 培养 4 d后 , 细胞发生第 1次均等分裂 (200 ×) ;
D. 培养 14 d后 , 形成肉眼可见的球形胚 (20 ×) ; E. 培养 20 d后形成的心形胚 (40 ×) ;
F. 培养 30 d形成子叶形胚 (20 ×) ; G. 子叶形胚萌发及未能正常萌发的胚状体 ;
H. 根、芽、叶俱全的再生小植株。
F ig. 1　 Isola ted m icrospores developm en t in vitro and plan tlets regenera tion
A. Fresh isolated late2uninucleate stage m icrospores (200 ×) ; B. An expended m icrospore (200 ×) ;
C. The first cell division after 4 d culture (200 ×) ; D. Globular embryoid (20 ×) ; E. A heart2shaped embryoid (40 ×) ;
F. Cotyledonary embryoid (20 ×) ; G. Embryoid germ ination and a cotyledonary embryoid keep ing white;
H. A comp lete p lantlet with roots, shoots and leaves.
212　基因型对胚状体诱导的影响
在 10份供试材料中 , 分别从 ‘7447’、‘长春密刺 ’、‘Poinsett97’和 ‘康德 ’中获得了胚状体
(表 1)。其中产量最高的是 ‘7447’, 为每皿 3112个 , 最低的是 ‘康德 ’, 为每皿 115个。‘7447’
和 ‘Poinsett97’获得子叶形胚 , 其他 7份材料中有部分基因型的游离小孢子或出现膨大 , 或已启动
分裂 , 但最终未能继续分裂形成胚状体。
213　小孢子发育时期对胚状体诱导的影响
如表 2所示 , 3份材料均是只有单核靠边期的小孢子诱导成胚。因此单核靠边期是进行黄瓜游离
小孢子培养的最佳时期。
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表 1　基因型对花粉胚状体诱导 (每皿胚产量 ) 的影响
Table 1　Effect of genotype on em bryo id induction ( per d ish)
from isola ted m icrospore culture
材料
Genotype
胚状体
Embryoid
子叶形胚
Cotyledonary embryoid
7447 3112a 310a
长春密刺 Changchun M ici 2313b 0c
Poinsett97 518c 015b
康德 Kangde 115d 0c
其他 O thers 0e 0c
　　注 : 不同小写字母为差异达显著水平 ( P < 0105)。下同。
Note: The different small letter indicated significantly difference at
0105 level. The same below. 表 2　小孢子发育时期对花粉胚状体诱导 (每皿胚产量 ) 的影响Table 2　Effect of m icrospore developm en ta l stageon em bryo id induction ( per d ish)材料Genotype 单核早期Early2uninucleate胚状体Embryoid 子叶形胚Cotyledonaryembryoid 单核靠边期Late2uninucleate胚状体Embryoid 子叶形胚Cotyledonaryembryoid长春密刺 0 0 2117 0Changchun M iciPoinsett97 0 0 510 0康德 Kangde 0 0 118 0
214　温度处理对胚状体诱导的影响
试验结果显示 : 供试材料在 4 ℃低温预处理 2 d和 4 d时获得了胚状体 (表 3) , 说明对花蕾进行
一定的预处理是必要的。其中以 4 ℃低温预处理 2 d效果最好 , 并且有子叶形胚形成 , 处理 4 d的胚
状体产量显著下降 , 未能诱导子叶形胚。可能短时间的处理尚未满足促使小孢子完成脱分化启动的要
求 , 而长时间低温预处理会使小孢子因维持代谢消耗过多营养 , 造成活力下降或死亡 , 此外在进行预
处理的同时小孢子仍会继续发育 , 经过长时间的预处理小孢子已不适宜进行培养。另外 , 进行高温预
培养后未能获得胚状体 , 说明高温预培养抑制了小孢子成胚。
表 3　温度处理对胚状体诱导 (每皿胚产量 ) 的影响
Table 3　Effect of tem pera ture trea tm en t on em bryo id induction ( per d ish)
温度 /℃
Temperature
天数 / d
Days
7447
胚状体
Embryoid
子叶形胚
Cotyledonary
embryoid
长春密刺 Changchun M ici
胚状体
Embryoid
子叶形胚
Cotyledonary
embryoid
Poinsett97
胚状体
Embryoid
子叶形胚
Cotyledonary
embryoid
康德 Kangde
胚状体
Embryoid
子叶形胚
Cotyledonary
embryoid
对照 Control 0 0 0 0 0 0 0 0
4 1 0 0 0 0 0 0 0 0
4 2 3314a 210 2415a 0 317a 115 210a 0
4 4 2117b 0 1112b 0 0b 0 0b 0
4 6 0 0 0 0 0 0 0 0
33 1 0 0 0 0 0 0 0 0
33 2 0 0 0 0 0 0 0 0
　　注 : 对照 , 未进行温度处理。
Note: Control, anthers were cultured without temp reture treatment1
215　培养基对胚状体诱导的影响
表 4说明 , 较低浓度的外源激素可以促进胚状体诱导。‘长春密刺 ’、‘7447’和 ‘康德 ’在外源
激素浓度较低的培养基 (B和 E) 上都诱导了胚胎发生。‘长春密刺 ’在无外源激素的培养基 (A )
和浓度较高的培养基 (C和 D ) 上 , 虽有胚状体产生但产量明显著降低。说明外源激素是影响小孢子
胚胎发生的重要因素 , 但要求浓度较低。本试验最适宜的外源激素配比为 015 mg·L - 1 2, 42D + 012
mg·L - 1 62BA。
从表 4还可以看出相同基因型在 B和 E两种诱导培养基上的胚状体产量差异不显著。但 ‘7447’
在培养基 B上的子叶形胚产量显著高于在培养基 E上的产量。可见 , 在黄瓜游离小孢子培养中 , B5
和 NLN作为基本培养基使用时虽然诱导获得的胚状体产量差异不显著 , 但 NLN更有利于球形胚进一
步发育形成子叶形胚。
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表 4　培养基对胚状体诱导的影响
Table 4　Effect of em bryo id induction m ed ium on em bryo id induction
培养基 / (mg·L - 1 ) Mediun
编号
Code
培养基
Medium 2, 42D 62BA 7447胚状体Embryoid 子叶形胚Cotyledonary
embryoid
长春密刺 Changchun M ici
胚状体
Embryoid
子叶形胚
Cotyledonary
embryoid
Poinsett97
胚状体
Embryoid
子叶形胚
Cotyledonary
embryoid
康德 Kangde
胚状体
Embryoid
子叶形胚
Cotyledonary
embryoid
A NLN 0 0 1614b 0 1715b 0 0b 0 0b 0
B NLN 015 012 3018a 313 2313a 0 518a 018 115a 0
C NLN 110 015 0c 0 413c 0 0b 0 0b 0
D NLN 210 110 0c 0 0d 0 0b 0 0b 0
E B5 015 012 3010a 018 2018a 0 610a 0 118a 0
　　注 : 所有的培养基均使用 0122μm微孔滤膜过滤灭菌 , 蔗糖 13% , pH 518。其他 6份试材均未获得胚状体。
Note: A ll the media were filter sterilized using 0122μm pore size filter, the concentration of sucrose was 13% and pH 518. No embryoid was
obtained from the rest of materials tested.
216　胚状体萌发和植株再生
将获得的子叶形胚、部分球形胚和心形胚 , 转移至胚状体萌发培养基 MS2BA上。培养 20 d后 ,
球形胚和心形胚褐化死亡 , 发育成熟的子叶形胚正常萌发形成根芽俱全的小植株 (图 1, H ) , 处于
初期的子叶形胚则有大部分未能正常分化 , 或未能变绿 , 或褐化死亡 , 或仅有根分化 (表 5)。由此
可见 , 子叶形胚最易成苗。因此 , 胚状体能否正常发育形成成熟的子叶形胚是影响成苗的关键。
表 5　胚状体萌发与植株再生
Table 5　Em bryo id germ ina tion and plan tlet forma tion
材料
Genotype
胚状体个数 Number of embryoid
球形胚和心形胚
GEM and HEM
子叶形胚
CEM
成苗数 Number of p lantlet
球形胚和心形胚
GEM and HEM
子叶形胚
CEM
成苗率 /% Regenerated p lantlets
球形胚和心形胚
GEM and HEM
子叶形胚
CEM
7447 60 36 0 11 0 3017
Poinsett97 30 11 0 3 0 2510
长春密刺 Changchun M ici 60 0 0 0 0 0
康得 Kangde 20 0 0 0 0 0
　　GEM: Globular embryoid; HEM: Heart2shaped embryoid; CEM: Cotyledonary embryoid.
3　讨论
黄瓜基因型、小孢子发育时期、预处理和培养基成分是影响游离小孢子培养胚状体诱导和植株再
生的重要因素。
供试的 10份不同基因型材料中仅 3份启动雄核发育 , 之后细胞继续分裂获得了球形胚 , 另外 7
份材料有的部分细胞膨大但未能启动分裂 , 有的虽然有少数细胞发生分裂 , 但未能继续分裂成胚 , 且
不同基因型间胚状体产量差异显著。这与前人 (曹鸣庆 等 , 1993; 张丽 , 2004; ) 的研究结果一致。
同时 , 该 3份获得胚的材料中 , 仅从 ‘7447’和 ‘Poinsett97’获得的球形胚正常发育形成子叶形胚 ,
且子叶形胚产量很低。显然供体基因型对黄瓜游离小孢子培养具有决定性的影响。
本研究中仅单核靠边期的小孢子诱导成胚。前人 (陈军 等 , 1995; Hu & Kasha, 1997; 申书兴
等 , 1999; 卢钢和曹家树 , 2001; ) 的研究也已证实 , 对多数植物而言单核居中期至单核靠边期的花
粉最易诱导胚胎发生。这可能是因为单核靠边期的小孢子正处于面临不同分裂方式和发育途径的敏感
时期 , 所以容易诱导成功。而单核早期的小孢子则需要比较苛刻的条件才能启动雄核发育 , 因此难以
诱导成胚。可见 , 小孢子发育时期是影响诱导成胚的又一关键因素 , 而单核靠边期是进行黄瓜游离小
孢子培养的最佳时期。
在游离小孢子培养中已被证实采用一定的预处理可以促进或提高胚状体产量。本研究采用了 6种
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不同的预处理 , 发现 4 ℃低温预处理 2～4 d为宜 , 且以处理 2 d效果最好。低温预处理可以改变小孢
子的理化特性 , 促进雄核发育的启动。这与申书兴等 (1999) 和 Sato等 (2002) 的报道一致。
基本培养基和外源激素对游离小孢子培养具有重要影响 (O leszczuk et al. , 2004)。本试验采用了
B5和 NLN两种基本培养基 , 发现二者在诱导胚状体时无显著差异 , 但 NLN更有利于球形胚正常发育
形成子叶形胚。因此 NLN较 B5更适宜作为基本培养基。另一方面 , 虽然在诱导花粉胚状体时外源激
素并不是必需的 , 但低浓度 2, 42D (015 mg·L - 1 ) 和 62BA (012 mg·L - 1 ) 更利于促进小孢子成
胚 , 但姜凤英和冯辉 ( 2006) 研究认为 62BA对羽衣甘蓝小孢子胚发生有促进作用 , 而 2, 42D 和
NAA会抑制胚发生。这可能是因为不同作物对外源激素的要求不同。同时高浓度激素反而不利于胚
状体诱导 , 这可能与较高浓度 2, 42D产生毒害作用有关。
此外 , 本试验获得的球形胚仅少数能正常发育形成子叶形胚 , 而在随后的胚状体萌发阶段中 , 只
有子叶形胚易分化成苗。因此 , 如何促使球形胚正常发育形成子叶形胚 , 是能否获得再生植株的关
键 , 也是今后研究的重点之一。
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