全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (3) : 327 - 332
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 17; 修回日期 : 2009 - 02 - 20
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671441) ; 国家 ‘863’计划项目 (2006AA10Z1B6)3 共同第一作者3 3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: rschan@cau1edu1cn)
富士苹果 AFL P体系的优化及其在鉴定早熟芽变中
的应用
李元军 13 , 唐美玲 13 , 于　青 1 , 刘美英 1 , 宋来庆 1 , 韩振海 23 3
(1 烟台农业科学研究院果树所 , 山东烟台 265500; 2 中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100193)
摘 　要 : 以 ‘长富 2号 ’苹果为材料 , 采用优化的 AFLP技术对其早熟芽变与母株进行初步研究 , 筛
选了 64对引物 , 其中 43对引物扩增结果理想 , 共产生了 2 700条带。有 4对引物在芽变与母株之间产生了
7条差异片段 , 主要集中在 350～800 bp之间。研究表明早熟芽变是由于遗传物质改变造成的 , 同时也说明
利用该体系对苹果芽变进行分析和鉴定获得成功。
关键词 : 苹果 ; AFLP; 芽变
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0320327206
O ptim iza tion of AFL P System for Fuji and Iden tif ica tion Early2ma tur ing
Sport from‘Changfu 2’
L I Yuan2jun13 , TANG Mei2ling13 , YU Q ing1 , L IU Mei2ying1 , SONG Lai2qing1 , and HAN Zhen2hai23 3
(1 Fru it Institu te, Yan ta i A gricu ltura l Science A cadem y, Yanta i, Shandong 265500, China; 2 Institu te of Horticultural P lants,
China A gricu ltura l U niversity, B eijing 100193, Ch ina)
Abstract: U sing AFLP to compare the early2maturing sport and its mother p lant in‘Changfu 2’. Sixty2
four selective p rimer pairs were adop ted in AFLP analysis. Two thousand and seven hundred clear bands were
detected by 43 pairs of AFLP p rimers. There were 7 obvious bands difference between early2maturing sport and
mother p lant under 4 pair p rimers. The molecular weight range of the polymorphic fragments were mainly
350 - 800 bp. The results indicated that there were some molecular2level differentiation between‘Changfu 2’
and its early2maturing sport. The app lication of AFLP in the research of app le bud mutation was successful.
Key words: app le; AFLP; bud mutation
苹果是遗传背景高度杂合的多年生木本植物 , 芽变频率高 , 因此芽变选种在其育种中占有十分重
要的地位。但因饰变因素的存在 , 需要对芽变进行鉴定。目前对果树芽变的鉴定已发展到分子水平 ,
用于鉴定芽变的分子标记有 RAPD、AFLP、 ISSR和 MSAP标记 (宁允叶 等 , 2003; 肖璇 等 , 2005;
曾柏全 等 , 2006; 黄玉辉 等 , 2007; 谢吉容 等 , 2007)。与其它分子标记相比 , AFLP适合多态性
低的样品检测 (Vos et al. , 1995)。目前利用 AFLP分子标记对苹果进行芽变研究在国内外报道较少。
2005年 9月山东烟台吕格庄镇院下村蔡玉光其在果园中发现 1株 ‘长富 2号 ’苹果树上一主枝
所结果实比普通果实早成熟 1个月左右 , 历经 3年的高接试验 , 其早熟性状稳定。本研究中以 ‘长富
2号 ’为材料 , 对经典 AFLP流程进行改进 , 建立了一套适合富士苹果的 AFLP技术体系 , 同时利用
AFLP技术对 ‘长富 2号 ’母树上的变异枝条与普通枝条进行分析 , 旨在将芽变与其原类型从 DNA
水平上加以区分 , 同时为苹果成熟期方面的研究提供特异性 AFLP片段。
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1　材料与方法
111　植物材料
‘长富 2号 ’芽变材料 : A , 母株上的芽变枝条 ; B , 嫁接 3年的单株 ; C, 嫁接 2年的单株 ; D ,
嫁接 1年的单株。所有单株均是田间随机取样。对照样品是母株上的普通枝条。2008年 6月下旬采
回幼叶 , 液氮速冻后移至 - 80 ℃保存备用。
112　试验方法
11211　AFLP引物序列 　
引物序列参照 Vos等 (1995) AFLP技术体系 , 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 , 其
序列具体如下 : E2F: 5′2CTC GTA GAC TGC GTA CC23′; E2R: 3′2CAT CTG ACG CAT GGT TAA25′;
M 2F: 5′2GAC GAT GAG TCC TGA G23′; 预扩增引物 : M 2R: 3′2TAC TCA GGA CTC AT25′; E20: 5′2
GAC TGC GTA CCA ATT CA23′; M 2C: 5′2GAT GAG TCC TGA GTA ACC23′; 选择性扩增引物是带有 3
个选择性碱基 , 引物序列如表 1所示。
表 1　供试引物
Table 1　Tested pr im er pa irs and the ir sequence in the study
引物 Primer 序列 Sequence 引物 Primer 序列 Sequence
E1 5′2GACTGCGTACCAATTCAGC23′ M1 5′2ATGAGTCCTGAGTAACAA23′
E2 5′2GACTGCGTACCAATTCAGG23′ M2 5′2GATGAGTCCTGAGTAACAC23′
E3 5′2GACTGCGTACCAATTCAAG23′ M3 5′2GATGAGTCCTGAGTAACAG23′
E4 5′2GACTGCGTACCAATTCACT23′ M4 5′2GATGAGTCCTGAGTAACAT23′
E5 5′2GACTGCGTACCAATTCACA23′ M5 5′2GATGAGTCCTGAGTAACTG23′
E6 5′2GACTGCGTACCAATTCACC23′ M6 5′2GATGAGTCCTGAGTAACTA23′
E7 5′2GACTGCGTACCAATTCACG23′ M7 5′2GATGAGTCCTGAGTAACTC23′
E8 5′2GACTGCGTACCAATTCAAC23′ M8 5′2GATGAGTCCTGAGTAACTT23′
11212　AFLP体系的优化 　
参照经典的 AFLP体系从以下 3方面进行优化。
采用 SDS法 (王彩虹 等 , 2001 ) 和改良的 CTAB 法提取 DNA, 改进的步骤是利用等体积的
氯仿 /异戊醇抽提 3次 , 最后用 012%的 RNase水溶解 , 37 ℃保温 30 m in, 将浓度调为 100 ng·μL - 1
备用。
采用 EcoRⅠ和 M seⅠ限制性内切酶同时进行双酶切。40μL酶切体系包含 DNA 500 ng, M se I和
EcoR I各 3 U。反应在 2 ×Y/T Buffer中进行 , 37 ℃酶切 6 h, 72 ℃酶灭活 15 m in。取出 10μL进行琼
脂糖电泳检测。酶切产物的连接与预扩增、选择性扩增均参照 Vos等 ( 1995) 进行。分别将预扩增
产物稀释 10倍、20倍和 30倍作为选择性扩增模板。
PCR产物加入 1 /2体积的变性剂 , 95 ℃变性 5 m in, 取 6μL于 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳
2 h, DNA条带通过 AgNO3染色显现 , 将银染的时间设定为 10、20和 30 m in。
2　结果与分析
211　苹果 AFL P体系的优化
提取植物中 DNA最常用的两种方法就是 CTAB法和 SDS法。本研究最初采用的是 SDS法 , 提取
的 DNA质量不高 , 含有较多杂质 (图 1中的 6～12泳道 ) , 所以采用改良的 CTAB法提取 DNA (图 1
的 1～5泳道 ) , 经纯度测定 A260 /A280均达到 117～119, 适于 AFLP体系的后续操作。
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　3期 李元军等 : 富士苹果 AFLP体系的优化及其在鉴定早熟芽变中的应用 　
图 1　改良的 CTAB法和 SD S提取 D NA的电泳结果
1～5: CTAB法提取的 DNA; 6～12: SDS法提取的 DNA。
F ig. 1　The apple D NA extracted by m od if ied CTAB and SD S m ethod
1 - 5: The DNA extracted by CTAB method; 6 - 12: The DNA extracted by SDS method.
将预扩增产物稀释 10倍作为选择性扩增的模板。如图 2所示 , 稀释 10倍时条带分布均匀且背景
干净 ; 稀释 20倍与 30倍时背景比较深 , 不利于条带统计。
图 2　预扩增产物稀释不同倍数作为选择模板扩增的结果
F ig. 2　The selective am plify ing result w ith tem pla tes d iluted d ifferen tly
from pre2am plif ied product
银染的时间由 30 m in缩减到 10 m in。如图 3所示 , 硝酸银染色时间为 20 m in和 30 m in时 , 背景
颜色会加深 , 而染色 10 m in背景比较浅 , 条带明显。因此确定硝酸银染色时间为 10 m in。同时显色
液的温度要控制在 6 ℃左右 , 温度太低 , 显色时间过长容易加深背景颜色 , 温度太高 , 显色时间太
短 , 条带还没有显现背景的颜色就加深了。
图 3　银染不同时间的电泳结果
F ig. 3　The electrophoresis result of d ifferen t AgNO 3 2sta ined tim e
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212　AFL P选择性引物筛选结果
利用 64对引物组合对早熟芽变枝条与普通枝条进行分析 , 由表 2可知 43对引物扩增结果理想 ,
共扩增出 2 700条清晰可辨的 AFLP条带 , 平均每对引物扩增 62条带 (其中 E2ACT/M 2NNN 和 E2
AAG/M 2NNN扩增结果如图 4所示 ) ; 16对引物扩增片段较大 , 集中在胶板上部 , 不利于统计 ; 另外
5对几乎没有扩增产物。
表 2　各引物组合出现的 AFL P带数及其多态性
Table 2　AFL P fragm en t num ber am plif ied by d ifferen t pr im er com b ina tion s
引物 Primer M2CAA M2CAC M2CAG M2CAT M2CTG M2CTA M2CTC M2CTT
E2AGC × × × × × × × ×
E2AGG 40 35 37 × 41 36 37 36 (2)
E2AAG 68 65 60 (1) 67 64 69 65 60
E2ACT 3 68 75 3 65 78 × ×
E2ACA 75 73 70 69 74 (3) 73 (1) 76 71
E2ACC 65 60 69 61 73 67 56 68
E2ACG 67 61 73 75 57 67 69 65
E2AAC × × 3 3 × × × 3
　　注 : ×代表扩增产物集中于胶板上部 , 并且比较密集 , 不便统计 ; 3 代表几乎没有扩增产物 ; 括号内是观测的差异带数。
Note: The fragment was too large to number for p rimer combination with ×; No p roduct with p rimer combination with 3 ; Numbers in
bracket show the specific segment number found by electrophoresis observation.
图 4　引物 E2AAG /M 2NNN ( 1～8) 和 E2ACT /M 2NNN ( 9～16) 扩增的电泳结果
F ig. 4　D NA band pa tters am plif ied by pr im er com b ina tion
E2AAG ( 1 - 8) and E2ACT ( 9 - 16) w ith M 2NNN
213　芽变材料的 AFL P分析
利用 4对引物对 4份芽变材料进行扩增 (图 5所示 ) , 都没有出现多态性 , 说明该芽变性状比较
稳定。因此后续试验只采用母株上的芽变为材料。
214　芽变与母株间 AFL P扩增位点差异分析
43对引物只有 4对引物在芽变与母株间存在多态性 , 共扩增出 7条差异片段 , 片段长度在 350～
800 bp之间 , 其中 4条属于芽变枝条特有 , 另外 3条属于母株上普通枝条特有 (如图 6和表 3所示 )。
215　芽变与母株遗传相似性分析
扩增结果中相对迁移距离相同为单态性片段 , 否则为多态性片段。由表 2可知 , 芽变与母株扩增
出的共有谱带为 2 693条 , 多态性谱带为 7条 , 根据 Nei和 L i (1979) 的遗传相似系数的计算方法 ,
芽变与母株之间的遗传相似系数为 019987, 遗传距离为 010013, 多态性为 0126%。
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　3期 李元军等 : 富士苹果 AFLP体系的优化及其在鉴定早熟芽变中的应用 　
图 5　 4对引物对 4份芽变材料扩增的电泳结果
1. 母株上的芽变枝条 ; 2. 嫁接 3年的单株 ; 3. 嫁接 2年的单株 ; 4. 嫁接 1年的单株。
F ig. 5　The electrophoresis result am plied by four pr im er com b ina tion s in sports m uta tion
1. Mutation from mother p lant; 2. Mutation from grafting for three years;
3. Mutation from grafting for two years; 4. Mutation from grafting for one year.
表 3　芽变与对照扩增产生差异片段的结果
Table 3　Polym orph ic fragm en t
by sport and con tract
引物组合
Primer
combination
差异片段分子量
Molecular weight of polymorphic fragment
芽变 Sport 母株 Mother p lant
E2AGG/M2CTT 350 700
E2AAG/M2CAG 500
E2ACA /M2CTG 600 750
800
E2ACA /M2CTA 680
图 6　 4对引物组合在芽变与母株间的扩增结果
1: 母株 ; 2: 芽变。
F ig. 6　PAGE electrophoresis of 4 pa irs of AFL P pr im er
com b ina tion s in sport and con tract
1: Mother p lant; 2: Sport.
3　讨论
由于 AFLP技术操作复杂 , 影响因素较多 , 因此对于不同物种建立和优化 AFLP体系尤为重要。
关于苹果 AFLP 体系的建立已经有一些报道 (祝军 等 , 2000; 王彩虹 等 , 2001; 石丽雪 等 ,
2006) , 但笔者研究发现利用这些个体系都不能取得满意的结果。本研究中从 3方面优化苹果 AFLP
反应体系 , 采用改良的 CTAB法提取的 DNA , 既能有效去除苹果中多糖与多酚对 DNA的污染 , 又节
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
省了提取时间。提高选择性扩增模板的浓度和缩短银染时间 , 有效降低胶板背景 , 使 AFLP条带分布
均匀 , 更容易统计分析。本研究建立了稳定、清晰的富士苹果 AFLP技术体系 , 为以后标记富士苹果
农艺性状奠定了技术平台。
本研究中共筛选了 64对引物 , 只有 4对引物在芽变与母株中存在多态性 , 说明早熟芽变枝条的
遗传物质改变很小 , 而 7条差异片段可能与果实提早成熟的结构基因有关 , 也有可能是调控这些结构
基因的转录因子 , 需要将差异片段回收克隆、测序进行 DNA分析比对后才能推测这些片段的功能。4
对引物扩增的特异性条带 , 可以作为区分芽变与普通 ‘长富 2号 ’的特征条带 , 为使鉴定工作简化 ,
可以将获得的 AFLP标记转化为 SCAR标记。这些工作正在进行中。
本研究中所用的芽变系与母株的遗传背景基本一致 , 只有成熟期差别很大 , 是探索果实提早成熟
分子机制较理想的材料 , 也为苹果育种工作提供重要的种质资源。
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