全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (12) : 1810 - 1815
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 07 - 13; 修回日期 : 2009 - 08 - 24
基金项目 : 河南省教育厅自然科学研究计划项目 (2008A208012)3 E2mail: songshw959@1631com
银条茎尖玻璃化法超低温保存及其植株再生
宋尚伟 3 , 苗红霞 , 胡青霞 , 王　娟
(河南农业大学园艺学院 , 郑州 450002)
摘　要 : 为长期稳定保存银条种质 , 建立了玻璃化法超低温保存其茎尖的技术体系。选择继代 4次的
银条无菌壮苗 , 5 ℃低温驯化 14 d; 剥取 5 mm的茎尖 , 在含有 015 mol·L - 1蔗糖的 MS (无 Ca2 + ) 液体培
养基预培养 1 d; 25 ℃条件下经改良 MS + 2PVS2装载 20 m in; 在 - 20 ℃, 95%乙醇浴中以 PVS2脱水处理 4
h; 更换新鲜的 PVS3后投入液氮 , 保存 24 h后取出冷冻管在 40 ℃水浴中化冻 1 m in; 以含有 112 mol·L - 1
蔗糖的改良 MS (无 Ca2 + ) 溶液洗涤 2次 , 每次 10 m in; 冻存后的茎尖相对存活率超过 70%。将冻存后的
茎尖转接到再生培养基上 , 暗培养 20 d后转入正常光照条件下培养 , 存活率达 6317% ; 继续培养得到正常
分化和生长的再生植株 , 生根后可移栽成活。
关键词 : 银条 ; 玻璃化法 ; 茎尖 ; 超低温保存 ; 植株再生
中图分类号 : S 644　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1221810206
Cryopreserva tion of Shoot2tips of S tachys floridana Schuttl. ex Ben th. by
V itr if ica tion and Its Regenera tion
SONG Shang2wei3 , M IAO Hong2xia, HU Q ing2xia, and WANG Juan
(College of Horticu lture, Henan A gricultural U niversity, Zhengzhou 450002, Ch ina)
Abstract: In vitro2grown shoot tip s of S tachys f loridana Schuttl. ex Benth. were successfully cryop re2
served by the encap sulation - vitrification method. Excised 5 mm shoot tip s, subcultured 4 times and domesti2
cated at 5 ℃ for 14 d, were p recultured for 1 d in liquid MS medium supp lemented with 015 mol·L - 1 su2
crose. Precultured shoot tip s loaded with a m ixture of imp roved MS and 2PVS2 for 20 m in at 25 ℃were direct2
ly dehydrated with a highly concentrated vitrification solution ( PVS2 ) for 4 h at - 20 ℃ and exchanged fresh
PVS3 p rior to immersion in liquid nitrogen for 24 h. After rewarm ing at 40 ℃ for 1 m in, the cryop reserved tip s
were washed twice in imp roved MS liquid medium supp lemented with 112 mol·L - 1 sucrose for 2 ×10 m in
and then post2cultured on regeneration medium in dark for 20 d, the rate of root recovery amounted to about
6317%.
Key words: S tachys f loridana Schuttl. ex Benth. ; vitrification; shoot2tip; cryop reservation; regenera2
tion p lantlet
银条 (S tachys f loridana Schuttl. ex Benth. ) 属唇形科水苏属多年生草本植物 , 其地下根状茎脆嫩
多汁 , 营养丰富 , 在药用和保健食品开发利用领域具有广阔发展前景。但银条自然分布和栽培区域很
小 , 存在种质退化甚至消失的问题 , 亟需进行资源筛选和保存研究 (张国裕 等 , 2004)。建立在组
织培养基础上的玻璃化超低温保存技术 , 以其设备要求简单 , 材料处理步骤简便 , 重演性好 , 能长期
稳定地保存种质等优点 , 已成功应用于许多园艺植物 (Nag & Street, 1973; Dereuddre et al. , 1994;
Paul et al. , 2000; Matsumoto et al. , 2001; 王子成和邓秀新 , 2001; 赵艳华和吴永杰 , 2001; 薛建平
　12期 宋尚伟等 : 银条茎尖玻璃化法超低温保存及其植株再生 　
等 , 2003; 吴黎明 等 , 2006; 徐小彪 等 , 2006) 等茎尖与胚性细胞的保存研究。但应用该方法在剥
取一些较柔嫩的茎尖材料时存在一定的技术困难 ; 冰冻保护剂的应用对植物材料也有一定的毒害作
用。本试验中以银条茎尖为材料用玻璃化法进行超低温保存研究 , 也得到了较高的冻存后再生成活
率 , 为长期稳定地保存银条种质提供了技术依据。
1　材料与方法
111　供试材料及冰冻保护剂
试验在河南农业大学园艺学实验室进行。供试材料为河南省偃师市主栽品种 ‘二细一粗 ’银条。
2007年 3月室内培养健壮母株 , 当株高 10～20 cm时 , 剪取带芽茎段约 2 cm, 自来水冲洗 2 h后 , 用
011%升汞消毒 6～8 m in, 无菌水冲洗 3～4次。于无菌条件下将带腋芽茎段依次在芽诱导培养基 MS
+ 62BA 510 mg·L - 1 , 芽增殖培养基 MS + 62BA 415 mg·L - 1 + GA3 110 mg·L - 1和不定芽伸长培养基
MS + 62BA 115 mg·L - 1 +NAA 014 mg·L - 1 + GA3 015 mg·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +琼脂 615 g·L - 1上
培养。上述培养基调 pH 518, 培养温度 (25 ±2) ℃, 光照 14 h·d - 1。每 20 d继代 1次 , 继代 4次
后用于超低温保存试验。
冰冻保护剂包括 PVS1 ( 22%甘油 + 13%乙二醇 + 13%聚乙二醇 + 10%二甲基亚砜 )、 PVS2
(30%甘油 + 15% 乙二醇 + 15%二甲基亚砜 + 0140 mol·L - 1蔗糖 , Sakai et al. , 1999) ; PVS3 (50%
甘油 + 50%蔗糖 , 赵艳华 等 , 2006) ; PVS4 (35%甘油 + 20% 乙二醇 + 0160 mol·L - 1蔗糖 , 吴黎明
等 , 2006) 和 2PVS2 ( 0140 mol·L - 1蔗糖溶液与 PVS2溶液以体积比 40 ∶60 配制 , 薛建平 等 ,
2003)。
112　低温驯化处理试验
选择继代 4次的无菌壮苗 , 装入保鲜袋在 5 ℃条件下进行低温驯化 , 驯化时间分别设为 0、7、
14、21、28、35、42 d, 每个处理 30 个茎尖。低温驯化处理后的材料用改良 MS (无 Ca2 + , 下同 )
+ 015 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d, 25 ℃条件下改良 MS + 2PVS2装载 20 m in后 , - 20 ℃、95% 乙醇浴
中 PVS2脱水 4 h, 更换新鲜的 PVS3 , 立即投入液氮 , 保存 24 h。取出冷冻管 , 在 40 ℃条件下化冻 1
m in, 用改良 MS + 112 mol·L - 1蔗糖溶液清洗 2 次 , 每次 10 m in; 吸去材料表面液体后转入 MS +
62BA 415 mg·L - 1 + GA3 110 mg·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +琼脂 7 g·L - 1培养基 , 暗培养 20 d后转入光
培养 , 10 d后统计存活率。培养后仍呈绿色的茎尖数占茎尖总数的百分比为存活率。
113　不同蔗糖浓度预培养试验
取低温驯化 14 d的材料 , 分别用改良 MS、改良 MS分别加 013 、015、017和 110 mol·L - 1蔗糖
的培养基进行预培养 , 每个处理 30个茎尖 , 预培养 1 d。装载、脱水和液氮保存同上。取出冷冻管 ,
立即在 40 ℃条件下化冻 1 m in, 用改良 MS + 112 mol·L - 1蔗糖溶液清洗 2次 , 每次 10 m in; 然后放入
10 mL试管中 , 加 014% TTC (每个茎尖 1 mL) 溶液 , 在黑暗 25 ℃恒温下静止培养 24 h; 吸取 TTC溶
液 , 用双蒸水冲洗 3次 ; 添加 5 mL 95%乙醇 , 65 ℃水浴中加热 30 m in; 提取 TTC被脱氢酶还原后生
成的红色 TTF溶液。用分光光度计在波长为 485 nm处测定吸光值。以新鲜材料为对照。用相对存活
率表示细胞的活力。相对存活率 ( % ) =处理 TTC值 /对照 TTC值 ×100。
114　装载试验
取低温驯化 14 d的材料 , 用改良 MS + 015 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d后 , 在 25 ℃条件下分别用装
载液 Ⅰ (改良 MS)、Ⅱ (改良 MS + 2PVS2 )、Ⅲ (改良 MS + PVS2 ) 装载 20 m in, 其后步骤同 113 。
115　脱水处理试验
取低温驯化 14 d的材料 , 用改良 MS + 015 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d后 , 在 25 ℃下改良 MS +
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2PVS2装载 20 m in, 将茎尖从装载液中取出后 , 在不同温度下进行不同时间的脱水处理 : 对照 (未经
PVS2脱水的材料 ) ; 25 ℃ PVS2脱水 2 h; 25 ℃PVS2脱水 4 h; - 20 ℃, 95%乙醇浴中 PVS2脱水 2 h;
- 20 ℃, 95%乙醇浴中 PVS2脱水 4 h, 其后步骤同 113。
116　冰冻保护剂处理试验
取低温驯化 14 d的材料 , 用改良 MS + 015 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d后 , 25 ℃条件下改良 MS +
2PVS2装载 20 m in, - 20 ℃, 95%乙醇浴中 PVS2脱水 4 h后 , 分别加入 4种冰冻保护剂 PVS1、PVS2、
PVS3和 PVS4后立即投入液氮 , 其后步骤同 113。
117　化冻方式试验
取低温驯化 14 d的材料 , 改良 MS + 015 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d, 在 25 ℃条件下改良 MS +
2PVS2装载 20 m in, - 20 ℃、95%乙醇浴中 PVS2脱水 4 h, 更换 PVS3立即投入液氮保存 , 1 d后从液
氮中取出 , 立即在 40 ℃水浴、流水 (18 ℃) 和 25 ℃室温 3种条件下进行化冻 , 其后步骤同 113。
118　植株再生
取经过化冻洗涤后的茎尖 , 迅速放在无菌滤纸上吸干材料表面液体 , 然后接种在 MS + 62BA 415
mg·L - 1 + GA3 110 mg·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +琼脂 7 g·L - 1再生培养基上。对照直接放在正常条件
下 (培养室温度 25 ℃, 光照强度 2 000～3 000 lx, 光照时间 12 h·d - 1 ) 培养 , 其余的暗培养 20 d,
转入正常光照条件下培养 , 10 d后统计存活率。生长正常的茎尖转接到 MS + 62BA 115 mg·L - 1 +
NAA 014 mg·L - 1 + GA3 015 mg·L - 1培养基上继续培养 , 部分愈伤组织化的茎尖接种到 MS + 62BA
510 mg·L - 1 + NAA 011 mg·L - 1上继续诱导芽。当芽长 115 cm左右时转接到 MS + NAA 015 mg·
L - 1上 , 每 7 d观察和统计生根情况 , 待有 7～8条根时 , 将发育良好的苗从培养瓶中取出 , 洗去附着
的培养基 , 栽于盛有灭菌处理 (121 ℃, 20 m in) 过的蛭石和草炭的营养钵中 , 加盖玻璃瓶以更好的
保持湿度和温度 , 并放在温室环境 (相对湿度 70%左右 , 温度 25 ℃, 光照时间 12 h·d - 1 ) 下培养 ,
待 5～7 d后逐渐通风炼苗 , 14 d后观察成活情况。
2　结果与分析
211　无菌苗增殖情况
通过茎段诱导出不定芽芽团 , 再进行芽的伸
长培养可显著提高芽的增殖效率 , 每个外植体可
诱导的不定芽平均超过 15个。芽团经过 4次继代
后 , 仍能保持较强的增殖及芽伸长能力 , 能在较
短的时间内获得大量再生植株。适量添加 NAA ,
有改善植株状况、增加节间长度的作用。
212　低温驯化时间对银条茎尖超低温保存后存活
率的影响
低温驯化时间长短对后续银条茎尖超低温保
存效果有较大影响 (图 1)。未经低温驯化的保存
后存活率只有 1312% , 低温驯化 14 d的保存后存
活率最高 , 达 6317% , 显著高于其它处理。随着
驯化时间的增加 , 存活率又逐渐下降。当驯化时
间过长时 , 无菌壮苗因受冻叶片呈现褐色 , 茎顶端
抽生白色嫩稍 , 植株营养消耗过多 , 抗冻能力显著
图 1　低温驯化时间对银条茎尖超低温保存效果的影响
邓肯氏多重检验 , 小写字母不同者表示差异
显著 ( P < 0105)。下同。
F ig. 1　Effect of cold hard ing tim e on cryopreserva tion of
S tachys floridana Schuttl. ex Ben th. shoot tips
Duncanpis multip le test. The different small letters indicated
significance at P < 0105 level. The same below.
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下降。故在以后的试验中驯化时间以 14 d为准。
213　预处理溶液浓度对银条茎尖超低温保存后相对存活率的影响
经改良 MS培养基分别加不同浓度蔗糖对银条茎尖进行预培养 , 可以充分降低细胞内自由水含
量 , 提高细胞对低温的抵抗能力。如图 2所示 , 银条茎尖超低温保存后相对存活率随蔗糖浓度的增加
呈先增后减的趋势。当蔗糖浓度为 013和 015 mol·L - 1时 , 相对存活率分别为 70195%和 73165% ,
显著高于对照和其它两个处理。
214　不同装载液对银条茎尖超低温保存后相对存活率的影响
经过 3种装载液处理的茎尖经过超低温保存后 , 以装载液Ⅱ即改良 MS + 2PVS2效果最好 , 超低温
保存后银条茎尖相对成活率达 77114% , 显著高于另外两个处理 (图 3)。这可能是装载液 Ⅱ不仅可
以充分降低胞间含水量 , 而且可避免由于渗透压剧烈变化对材料的伤害。
215　不同脱水条件对银条茎尖超低温保存后相对存活率的影响
细胞进行适当的保护性脱水 , 可降低水的过饱和点 , 阻止冰晶生长 , 较易达到玻璃化状态。5种
脱水方式对装载后的银条茎尖进行保护性脱水处理结果 (表 1) 表明 , - 20 ℃乙醇浴中 PVS2脱水处
理 4 h和 - 20 ℃乙醇浴中 PVS2脱水处理 2 h的相对存活率分别为 7715%和 7111% , 显著高于其它 3
个处理。故在以后的试验中保护性脱水处理条件选择 - 20 ℃乙醇浴中 PVS2脱水处理 4 h。
表 1　PVS2 脱水条件对超低温保存后相对存活率的影响
Table 1　Effect of d ifferen t dehydra ted tim e and tem pera ture on rela tive surv iva l ra tes after cryopreserva tion
脱水处理条件
Dehydrated treatment
相对存活率 / %
Relative survival rate
对照 (未脱水 ) Control 3213 ±1179 c
25 ℃脱水 2 h Dehydrated at 25 ℃ for 2 h 5511 ±1110 b
25 ℃脱水 4 h Dehydrated at 25 ℃ for 2 h 4911 ±1133 b
- 20 ℃乙醇浴脱水 2 h Dehydrated at - 20 ℃ alcohol bath for 2 h 7111 ±1135 a
- 20 ℃乙醇浴脱水 4 h Dehydrated at - 20 ℃ alcohol bath for 4 h 7715 ±1141 a
　　注 : 采用邓肯氏检验方法 , 不同小写字母代表差异显著 ( P < 0105)。下同。
Note: Duncanpis multip le test. The different small letters indicated significance at P < 0105 level. The same below.
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216　不同冰冻保护剂对银条茎尖超低温保存后相
对存活率的影响
应用 4种冰冻保护剂处理银条茎尖 , 比较超
低温保存后的相对存活率 , 以 PVS3和 PVS4效果
较好 , 分别达到 7511%和 7314% , 显著优于其它
处理 (表 2)。原因可能是 PVS3和 PVS4不含 DM2
SO, 避免了其直接接触植物材料而造成毒害。
表 2　不同冰冻保护剂对超低温保存后相对存活率的影响
Table 2　Effect of types of PVS on rela tive surv iva l
ra tes after cryopreserva tion
冰冻保护剂种类
Types of PVS
相对存活率 /%
Relative survival rate
PVS1 1319 ±211 c
PVS2 5616 ±115 b
PVS3 7511 ±114 a
PVS4 7314 ±211 a
217　化冻方式对银条茎尖超低温保存后相对存活率的影响
化冻速度是冻存技术的关键因素之一 , 为避免化冻过程中产生细胞内的次生结冰 , 并防止化冻吸
水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏 , 一般采用快速化冻法。在本试验设置的 3种化冻方式
中 , 40 ℃快速化冻的相对存活率达 6515% , 高于 25 ℃室温化冻 ( 1415% ) 和 18 ℃流水化冻
(3515% )。
218　植株再生条件
茎尖化冻后接种在再生培养基中直接放在光下难以成活。而对化冻后的茎尖进行 20 d的暗培养
(图版 , A) , 再移至正常光照下培养可显著提高其存活率 , 存活的茎尖可继续生长 (图版 , B )。部
分愈伤组织化的茎尖接种到 MS + 62BA 510 mg·L - 1 + NAA 011 mg·L - 1培养基上可诱导芽的发生
(图版 , C)。银条较易生根 , 转接于添加 015 mg·L - 1 NAA的 MS培养基上 , 经 7 d左右即有根长出。
待有 7～8条根时 , 将发育良好的苗移栽 , 成活率超过 75% (图版 , D )。
图版说明 : A: 超低温保存后暗培养 20 d的银条茎尖 ; B: 超低温保存后存活的银条茎尖 ; C: 超低温保存后银条增殖情况 ; D: 超低
温保存后移栽成活的植株。
Explana tion of pla tes: A: Shoot2tip s of cryop reservation 20 days in dark; B: Survival shoot2tip s after cryop reservation; C: Proliferation of p lant2
lets after cryop reservation; D: Transp lantation seeding after cryop reservation.
3　讨论
影响植物离体茎尖玻璃化超低温保存效果的因素很多 , 不同植物种类对低温驯化时间、脱水处理
条件及冻存后再生条件等要求不同。如猕猴桃 (徐小彪 等 , 2006) 继代 20 d后 5 ℃低温锻炼 42 d,
桃 (赵艳华和吴雅琴 , 2006) 继代 30 d后 5 ℃低温驯化 21 d, 其冻后存活率都比对照高 , 而银条以
继代 80 d后 5 ℃低温驯化 14 d为宜 , 继续延长低温驯化时间茎尖冻存后存活率显著下降。脱水处理
条件是影响冻存效果的关键 , 在其它植物上常用 25 ℃室温脱水处理 , 但在银条上研究发现 - 20 ℃乙
醇浴中以 PVS2脱水处理效果最好。在恢复生长阶段不同的植物所需的培养基种类、光照条件和时间
长短也不同 , 桃茎尖 (赵艳华和吴雅琴 , 2006) 接种在 MS培养基上很难成活 , 接种在 GS培养基上
则不仅存活率高且存活的茎尖可形成正常植株 ; 而香蕉 (吴黎明 等 , 2006) 冻存洗涤后的茎尖接种
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在 MS + 015 mg·L - 1 62BA上 , 大部分茎尖直接成芽 , 通过继代培养能再生成丛芽。地黄 (薛建平
等 , 2003) 冻存后的茎尖直接接种在再生培养基上 , 3 d后即可萌动 , 30 d后可发育成完整植株。银
条茎尖化冻后再培养到微小茎尖或顶端分生组织存活 , 则需要较长的恢复期 , 且对黑暗条件要求严
格 , 暗培养 5、7、15 d的茎尖见光后发白色 , 很难存活 , 暗培养 20 d后缓慢过渡到正常光照条件下 ,
茎尖才能存活 , 这不同于杏、樱桃、李和苹果等材料 , 而与桃类似 (赵艳华和吴雅琴 , 2006)。另
外 , 冻存后 TTC法检测的相对成活率与茎尖的实际存活率存在一定的差异 , 培养条件和检测手段还
需进一步研究和优化。总之 , 在各种植物的超低温保存研究中 , 应根据物种和保存材料的特性 , 对保
存程序进行相应地调整 , 以探索出安全、稳定和简便的保存技术。
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