全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (2) : 257 - 260
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 08 - 06; 修回日期 : 2008 - 12 - 10
基金项目 : 山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目 (01DS48)3 E2mail: qingrongsun@ hotmail1com; qingrongsun@ yahoo1com1cn
γ -射线照射梨试管苗诱导产生多倍体变异
孙清荣 13 , 孙洪雁 1 , 祝恩元 2 , 李林光 1
(1 山东省果树研究所 , 农业部泰安温带果树资源重点野外科学观测试验站 , 山东省果树生物技术育种重点实验室 ,
山东泰安 271000; 2 山东省科学技术厅 , 济南 250014)
摘 　要 : 用γ -射线照射梨试管苗 , 照射后对其顶芽、侧芽和叶片 3种外植体分别接种 , 经过继代和
筛选 , 获得了形态变异明显的变异无性系 , 其变异表现为茎变粗 , 节间变短 , 叶长 /叶宽比变小 , 叶柄变
短。经染色体计数鉴定 , 这些变异中既有三倍体也有四倍体。多倍体的气孔长度及比叶重较对照二倍体显
著增大。
关键词 : 梨 ; 试管苗 ; γ -射线 ; 多倍体
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0220257204
Polyplo id Induction in Pear in vitro Trea tm en t w ith Gamma2rays
SUN Q ing2rong13 , SUN Hong2yan1 , ZHU En2yuan2 , and L IL in2guang1
(1 Shandong Institu te of Pom ology, the S tate A gricu lture M in istry Experim ent S tation of Tem perate Fru its Germ plasm Key O utdoor
O bserva tion in Taipian, Shandong Fru its B iotechnology B reed ing Key L aboratory, Taipian, Shandong 271000, China; 2D epartm ent
of Science and Technology of Shandong Province, J inan 250014, Ch ina)
Abstract: In vitro shoots of pear cultivar‘Fertility’( Pyrus comm unis L. ) were irradiated with gamma2
rays. Three different exp lants of shoot tip , lateral bud and young leaf from irradiated shoots were cultured
separately. Shoots from 3 different exp lants were subcultured and selected. Morphologicalmutants with thicker
stem, shorter internode, smaller leaf index and shorter petiole were obtained. Chromosome counting confirmed
that the mutants were trip loids and tetrap loids. The lengths of stomatal guard cells and specific leaf mass of
polyp loids were significantly increased than that of dip loids.
Key words: pear; in vitro shoots; gamma2ray; polyp loid
随着果树组织培养技术的成熟和完善 , 离体组织培养和诱发突变相结合已成为一项很有前途的育
种研究项目 , 组织培养可提供更广泛的处理材料 , 如器官、组织和细胞 , 比原位活体 ( in vivo) 更适
于诱变 , 而且辐射诱变育种与离体培养结合能大大降低嵌合体的比例 , 可在有限的空间内对大量诱变
群体进行选择 , 提高后代筛选和鉴定效率 (刘进平和郑成木 , 2004)。到目前为止 , 诱导果树组培材
料变异的研究以离体材料对诱变的敏感性报道较多 ( Pinet2Leblay et al. , 1992; Predieri, 2001; 孙清
荣 等 , 2004) , 而获得有利性状改良的品种较少 , 仅在香蕉上用γ -射线照射组培苗顶芽获得了比母
本开花时间早 10周的品种 ‘Novaria’和果穗大的品种 ‘Klue Hom Thong KU1’ ( Jain & Swennen,
2004)。另外 , 用γ -射线照射香蕉试管苗获得了矮化和半矮化变异无性系 (李丰年 等 , 1996)。用
γ
-射线照射桃组培苗获得了比母本早熟 20 d左右的早熟桃 ‘辐靥 ’ (张毅 , 1998)。用γ -射线照射
梨试管苗获得了株型紧凑型变异及果实形状由梨形变为圆卵形的变异 ( Predieri et al. , 1997; Predieri
& Zimmerman, 2001) 等。本文报道用γ -射线照射梨试管苗获得多倍体变异无性系。
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
1　材料与方法
试验材料为山东省果树研究所繁殖的梨 ( Pyrus comm unis L. ) ‘丰产 ’品种试管苗 , 2003年 5月
在山东农业大学南校区钴源进行辐射处理。γ -射线照射剂量分别为 10、20和 30 Gy, 剂量率为 0115
Gy·m in - 1 , 照射梨无根无菌苗。照射方法 : 以 60 Co源为圆心 , 在不同半径上放置培养瓶 , 相同半径
为同一剂量。每个剂量处理 10瓶 , 每瓶 15～20个绿梢。照射后的无菌苗分成顶端幼嫩叶片、顶芽及
侧芽分别接种在增苗培养基上继代培养 , 每个芽梢分别增殖 , 并从第 2次继代开始观察茎粗、节间
长、叶形、叶色等的变化。逐代逐步淘汰没有变异或变异不稳定的绿梢 , 保留稳定变异的绿梢。对每
一个变异梢分别编号增殖 , 形成各自的无性系。
　　参照李林光等 (2007) 的方法进行染色体计数。从变异试管苗中下部摘取充分生长的功能叶片 ,
用尖头镊子撕取下表皮 , 放在载玻片上 , 用 O lympus光学显微镜观察 , 在 40倍物镜下用 100小格
(1小格 = 01271μm)目镜测微尺测量气孔保卫细胞长度。每个叶片测量 10个气孔保卫细胞。每个无
性系重共测 30个叶片。取充分生长的功能叶片 , 用打孔器取 10个叶圆盘称其鲜样质量 , 放在 85 ℃
下烘干 , 称其干样质量 , 每个无性系重复 3次 (30个叶圆盘 ) , 计算单位叶面积干样质量 (即比叶重 )。
应用 DPS3101专业版分析软件对数据进行 Duncanpis多重比较。
2　结果与分析
211　辐射后梨试管苗产生的变异
不同剂量辐射对梨试管苗不同外植体生长产生的影响已有报道 (孙清荣 等 , 2004)。辐射后无
菌苗的顶端嫩叶、顶芽和侧芽产生的绿梢经过 3次继代培养 , 筛选出一批变异无性系 , 继代 5～6次 ,
获得了变异稳定的无性系。经过 1年的继代淘汰选择 , 3种外植体都获得了比对照 (图 1, a、 c) 茎
变粗 , 节间变短 (图 1, b) , 叶柄变短 , 叶指数 (叶长 /叶宽 ) 变小 (图 1, d) 等类似多倍体性状的
变异无性系。
图 1　二倍体和四倍体 ‘丰产’梨试管苗生长形态比较
a和 c为二倍体 , b和 d为四倍体。
F ig. 1　Com par ison of m orpholog ica l character istics of in vitro d iplo id and tetraplo id shoots of pear‘Fertility’
a, c: D ip loid; b, d: Tetrap loid.
212　染色体计数
对无性系进行染色体计数 : 对照为二倍体 , 2n = 2x = 34 (图 2, a) , 不同的变异无性系染色体数
有 51和 68, 表明既有三倍体 , 2n = 3x = 51 (图 2, b) , 也有四倍体 , 2n = 4x = 68 (图 2, c) 变异。
共获得多倍体变异无性系 10个 , 2个为三倍体 , 都来源于顶芽变异 , 8个为四倍体 , 来源于顶芽、侧
芽和叶片再生不定梢。
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　2期 孙清荣等 : γ -射线照射梨试管苗诱导产生多倍体变异 　
图 2　不同无性系染色体数观察
a: 二倍体 (2n = 2x = 34) ; b: 三倍体 (2n = 3x = 51) ; c: 四倍体 (2n = 4x = 68)。
F ig. 2　Chrom osom e observa tion of d ifferern t clones
a: D ip loid (2n = 2x = 34) ; b: Trip loid (2n = 3x = 51) ; c: Tetrap loid (2n = 4x = 68) .
213　气孔保卫细胞长度和比叶重
气孔保卫细胞长度随倍性增加而增加 , 三倍体和四倍体与对照二倍体之间差异达极显著水平
(表 1)。三倍体与四倍体无性系 F21和 F22差异极显著 , 而与四倍体无性系 F23、 F24、 F25、 F26、
F27、F28差异不显著 , 这是因为四倍体的不同无性系间保卫细胞长度有差异 , 这种差异是正常的 , 相
同的倍性不同的无性系生物学性状也是不同的 , 在四倍体咖啡 (M ishra, 1997 ) 及四倍体茶树
(NgpiEtich & W afhira, 2003) 中都有类似的结果。相同倍性的不同无性系之间差异不显著 , 表明试管
苗叶片的气孔保卫细胞长度可用作多倍体变异早期选择的有效标记 , 多倍体的气孔保卫细胞长度明显
大于二倍体 (表 1) , 最大的为四倍体 F21, 最小的为二倍体对照母株。这和已报道的四倍体葡萄砧木
(Motosugi et al. , 2002)、四倍体沙梨 ( Kadota & N iim i, 2002)、四倍体咖啡 (M ishra, 1997) 的研究
结果一致。
表 1　梨不同倍性无性系气孔保卫细胞长度和比叶重
Table 1　M ean length of stoma ta guard cells and spec if ic leaf ma ss of d ifferen t plo idy in pear
无性系
Clones
倍数
Ploidy
平均保卫细胞长度 /μm
Mean length of guard cells
比叶重 / ( ×10 - 3mg·mm - 2 )
Specific leaf mass
F21 4x 4161 ±0131 a A 3611 ±1145 a A
F22 4x 4160 ±0133 a A 3513 ±1150 ab A
F23 4x 4133 ±0134 ab AB 3316 ±1190 b AB
F24 4x 4130 ±0132 ab AB 2511 ±3147 c C
F25 4x 4132 ±0131 ab AB 2615 ±2184 c BC
F26 4x 4130 ±0130 ab AB 2519 ±4110 c C
F27 4x 4133 ±0139 ab AB 2517 ±2120 c C
F28 4x 4130 ±0131 ab AB 2713 ±2140 c BC
F29 3x 4105 ±0134 b B 1917 ±1146 d D
F210 3x 4104 ±0130 b B 1911 ±2160 d D
对照母株 Control p lant 2x 2195 ±0132 c C 018 ±0135 e E
对照再生不定梢 Regenerating shoots of control 2x 3122 ±0131 c C 111 ±0131 e E
　　注 : 不同小写字母代表 5%显著水平 , 不同大写字母代表 1%显著水平。
Note: D ifferent small letters denote P < 0105, different cap ital letters denotes P < 0101.
比叶重结果也表现为四倍体最高 , 二倍体最低 , 不同倍性之间达极显著差异 (表 1) , 与不同倍
性茶树的研究结果 (NgpiEtich & W afhira, 2003) 一致 , 表明比叶重也是多倍体变异选择的有效标记。
3　讨论
γ
-射线辐射植物 , 可引起基因、染色体及基因组水平上发生变化。γ - 射线辐射已有效的用于
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果树育种 ( Predieri, 2001) , 提供了很多改良的有用性状 , 包括植株大小、开花时间、果实成熟期、
果实大小和颜色及抗病等。但这些性状的改良不是通过染色体加倍获得的 , 这可能是因为诱变的材料
是种子或枝条 , 然后通过种植或嫁接选择变异 , 在这种情况下 , 如果只有少数几个细胞的染色体获得
加倍 , 加倍的细胞常常比正常细胞分裂和生长慢 , 逐渐被排挤。诱变和组织培养相结合 , 诱变后的材
料分离成不同外植体分别放在最有利于生长的培养基上培养 , 能更好地使不同的变异表现并及早分离
出来 , 防止被生长快的组织所吞并。本研究获得的多倍体变异就是通过早期分离不同的芽组织分别进
行培养 , 连续多次继代培养和选择获得的 , 而且所获得的多倍体是纯合的 , 不是嵌合的。
本研究获得的多倍体无性系已移栽到田间 , 多倍体与二倍体差异明显 , 对多倍体的生物学性状有
待进一步观察和研究。
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