全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (3) : 363 - 368
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 27; 修回日期 : 2009 - 02 - 16
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA1001082427) ; 陕西省 ‘13115’工程项目 (2007ZDKG205)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lugangzh@1631com; Tel: 029287082131)
大白菜苹果酸脱氢酶基因的克隆及序列分析
贾　晋 1, 2 , 张鲁刚 13
(1西北农林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100; 2 内蒙古科技大学生物与化学工程学院 , 内蒙古包头 014010)
摘 　要 : 首先以一个用 cDNA2AFLP分析大白菜 [B rassica cam pestris L. ssp. pekinensis (Lour. ) O lsson ]
雄性不育花蕾败育得到的差异表达片段 ( TDF, Transcrip t Derived Fragments) EST5421为信息探针 , 在 Gen2
Bank数据库中进行同源 EST序列检索 , 并对亲缘关系近的同源 EST序列进行拼接 , 获得长度为 1 574 bp的
虚拟序列。然后设计引物 , 经 RT2PCR扩增、测序 , 获得了大白菜苹果酸脱氢酶基因的 cDNA全长序列 ,
并已将其登录到 GenBank, 登录号 : FJ208590, 该 cDNA全长 1 209 bp, 编码 403个氨基酸。同源分析显示
该 cDNA与电子克隆获得的核酸序列 99%同源 , 该 cDNA序列推导的氨基酸序列与拟南芥苹果酸脱氢酶同
源性 100%。虽然在大白菜花蕾败育过程中苹果酸脱氢酶基因 mRNA表达量下降 , 但其与大白菜花蕾败育
的关系还需通过 RNA干扰等技术进行验证。
关键词 : 大白菜 ; 花蕾败育 ; 电子克隆 ; RT2PCR; 苹果酸脱氢酶
中图分类号 : S 63411　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0320363206
C lon ing and Sequence Ana lyz ing of M a la te D ehydrogena se Gene in Ch inese
Cabbage [ B rassica cam pestris L. ssp. pekinensis ( L our. ) O lsson]
J IA J in1, 2 and ZHANG Lu2gang13
(1 College of Horticulture, N orthw est A & F U niversity, Yangling, Shaanxi 712100, Ch ina; 2 School of B iologica l & Chem ical
Eng ineering, InnerM ongolia U niversity of Science & Technology, B aotou, InnerM ongolia 014010, China)
Abstract: Firstly, a differential TDF ( Transcrip t Derived Fragments) EST5421 from the RNA of bud
aborting of male sterile Chinese cabbage by cDNA2AFLP analysis was used as a querying p robe to blast homol2
ogous ESTs sequences in the GenBank database, we sp liced the homologous EST sequences assembled from
GenBank, and gained an virtual sequence of 1 574 bp length. Then, two p rimers were designed from it, the
full length cDNA of malate dehydrogenase gene in Chinese cabbage was gained through RT2PCR amp lifying
and sequencing and entered GenBank as accession number FJ208590, which is 1 209 bp length and coded 403
am ino acids. Homologous analysis showed that the cDNA amp lified had 99% identity with sequence from in
silico cloning on the nucleotide acid sequence, and am ino acids sequence derived from it had 100% identity
with Malate Dehydrogenase (MDH) in A rabidopsis. Though the exp ression capacity of MDH gene in Chinese
cabbage was dep ressed as bud aborting, the relationship between MDH and bud abortion in Chinese cabbage
need to be clarified through further research such as RNA i technology etc.
Key words: Chinese cabbage; bud aborting; in silico cloning; RT2PCR; malate dehydrogenase
植物花蕾败育是普遍存在的一种生物学现象 , 目前对这一现象的研究较少。西北农林科技大学白
菜研究室在多年的育种实践中发现 , 大白菜及萝卜的雄性不育系、高代自交系等材料中普遍存在花蕾
败育现象 , 个别表现严重的材料甚至不能开花。采用现代生物技术研究其分子机理 , 不仅可以在理论
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
上丰富人们对植物花蕾败育现象的认识 , 而且可在实践中为育种工作者的知识产权保护提供新思路。
随着人类以及模式植物拟南芥和水稻等基因组计划及 EST计划的开展和不断深入 , 电子克隆 ( in
silico cloning) 作为一种基因克隆新方法被科研人员广泛采用 (张会敏 等 , 2006)。其基本原理是 :
利用日益发展的生物信息学技术 , 借助电子计算机的强大运算能力 , 通过将 EST或基因组的序列组
装、拼接得到一个虚拟的核苷酸序列 , 根据该序列设计引物 , 利用 RT2PCR的方法快速克隆功能基
因。该技术自产生以来 , 即以其方法简单、节约成本、耗时短而备受广大科研工作者的青睐 , 目前利
用该法已克隆了大量人类基因。但是该技术又存在缺点 , 其研究的成功与否依赖于已登录到 NCB I网
站的 EST序列的丰富程度 , 因此在植物研究领域中 , 由于 EST序列资料不够丰富 , 电子克隆应用较
少 (李娟和赵萍 , 2005)。
本研究中利用电子克隆技术对所获得的大白菜花蕾败育过程中下调表达的 EST5421 (贾晋 ,
2008) 进行全长 cDNA的克隆 , 并对获得的基因进行了序列分析 , 为进一步验证其生物学功能奠定基
础。
1　材料与方法
111　材料与试剂
所用材料为西北农林科技大学园艺学院白菜
研究室育成的大白菜雄性不育系 97C17 - 2 , 其花蕾
败育严重 , 田间表现为大多数花枝的花蕾生长到
一定大小即由绿变黄 , 干枯 , 不能开花 (图 1)。
试验从 2007年到 2008年在本研究室试验田及农
业部分子生物学重点实验室进行。从有败育倾向
的花蕾 (田间表现为刚开始由绿转黄 ) 开始 , 沿
着花序向上连续取样 , 直至取到表现正常的花蕾
(每一节位取 2个花蕾混合样代表一个发育时期 ,
共 9个时期 ) , 研究基因表达谱的变化 , 从中选
择与花蕾败育相关的基因。将所取花蕾于 - 70 ℃
保存备用。
图 1　大白菜花蕾败育表现
F ig. 1　Bud abortion of Ch inese cabbage
　　用于 RNA提取的 B IOZOL试剂为杭州博日公司产品 , PrimeScrip tTM cDNA一链合成试剂盒、二链
合成试剂盒、Taq酶和 dNTPs为大连 TaKaRa生物公司产品 , RQ DNase I、RNasin、pGEM 2easy克隆载
体为 Promega生物公司产品 , 胶回收试剂盒为北京百泰克生物服务有限公司产品 , RT2PCR验证引物
由上海 Sangon生物工程服务有限公司合成。
112　方法
总 RNA的提取参照 B IOZOL试剂说明书进行 ; 总 RNA中痕量 DNA去除采用 RQ DNase I; cDNA
二链合成参照 PrimeScrip tTM cDNA二链合成试剂盒 ( TaKaRa公司 ) 说明书进行 ; 双链 cDNA经苯酚 ∶
氯仿 ∶氯仿异戊醇 (25∶24∶1) 纯化后溶于 10～20μL的 ddH2O中备用。
将合成的 cDNA二链经 TaqⅠ、AseⅠ (NEB, New England) 酶切后连接接头 , 取 5μL产物进行预扩
增。9个样品的预扩增产物稀释 20倍后作为模板 , 采用 256对引物进行了 cDNA2AFLP差异表达分析。
根据电子克隆所得的完整的 cDNA序列 , 设计并合成特异引物。正向引物 : 5′2ACTCAAACCCTC2
GAAAGCCTGC23′, 反向引物 : 5′2AACCAGAAATGTCTCGCCGATGC23′。以供试大白菜花蕾败育的 9个
时期花蕾的 cDNA二链为模板进行 RT2PCR扩增。RT2PCR反应体系为 : 二链 cDNA 1μL, 10 ×缓冲
液 215 mmol·L - 1 , Mg2 + 11875 mmol·L - 1 , dNTPs 011875 mmol·L - 1 , Taq酶 1 U, 特异引物 015
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　3期 贾 　晋等 : 大白菜苹果酸脱氢酶基因的克隆及序列分析 　
μmol·L - 1 , 加水到总体积 20μL。扩增程序为 94 ℃ 2 m in; 94 ℃ 30 s, 68 ℃ 115 m in, 72 ℃ 115
m in, 40个循环 ; 72 ℃ 7 m in; 4 ℃保存。反应完毕后取 5μL于 1%琼脂糖凝胶电泳检测分析。
琼脂糖凝胶电泳回收 PCR产物 , 克隆到 pGEM 2T2easy载体上 , 按照说明书进行操作 , 通过蓝白
菌落挑选阳性克隆 , 委托上海 Sangon生物工程服务有限公司进行 DNA序列测定。利用 NCB I网站的
BLAST在线分析软件及 DNAMAN软件对所得 DNA序列进行分析。
2　结果与分析
211　cD NA2AFL P分析结果
采用 256对引物对大白菜花蕾败育材料 9个时期的样品进行 cDNA2AFLP分析 , 共得到差异表达
片段 192条 , 大小分布在 100～1 000 bp之间 , 其中引物对 A4 T12扩增得到的长度为 283 bp的差异片
段经测序后得到的 EST序列 , 将其编号为 EST5421 (图 2)。
212　大白菜苹果酸脱氢酶基因的 cD NA克隆
首先采用 NCB I网站的 B lastn软件对大白菜雄性不育系花蕾败育相关的差异表达片段 EST5421进
行同源序列检索 , 得到与之同源的基因序列或 EST片段。将检出的同源性较高的序列拼接组装成重
叠群 (Contig) , 再以此 Contig重复以上检索过程 , 反复进行序列的拼接和比对 , 直至 Contig不能继
续延伸 (黄骥 等 , 2002) , 得到长 1 574 bp的大白菜 EST5421的 cDNA虚拟全长序列。然后经 NCB I
网站的 ORF Finder分析发现其具有完整的开放阅读框架 (ORF) , 该阅读框编码具有 403个氨基酸的
蛋白质 , 经 B lastp分析发现为苹果酸脱氢酶 (Malate Dehydrogenase, MDH) 基因的 cDNA全长。
然后根据电子克隆虚拟 cDNA序列设计引物进行 RT2PCR验证。1%琼脂糖凝胶电泳分析的结果
显示 , 得到与预计大小基本相符的特异条带 , 且随着 “败育花蕾 →正常花蕾 ”总体表现出 “无 →弱
→强 ”的变化趋势 (图 3)。
用 pGEM 2T2easy载体克隆并测序后得到长度为 1 392 bp的序列 , 将其与得到的 1 574 bp虚拟序列
进行 B last A lign分析发现实际测定序列的第 1个碱基至第 1 342个碱基与虚拟序列的第 83个碱基至第
1 424个碱基之间除 7个碱基不同 (图 4箭头所示 ) 外 , 其余碱基完全相同 (图 4) , 一致性达到了
99%以上 , 说明该基因的电子克隆结果与 RT2PCR验证结果基本相符。
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图 4　EST5421的电子克隆序列与 RT2PCR扩增序列比对
Query: 查询项 , RT2PCR验证所得序列 ; Subject: 目标项 , 电子克隆所得虚拟序列 ; 箭头 : 表示两序列间不同的碱基。
F ig. 4　A lignm en t of tota l length of EST5421 between sequence from in silico clon ing and sequence from RT2PCR
Query: Inquiring item, the sequence from RT2PCR verifying; Subject: Objective item, the sequence from in silico cloning;
A rrowhead: Showing different bases between the sequence from RT2PCR verifying and the sequence from in silico cloning.
对实际测得序列进行 NCB I网站的 ORF Finder分析 , 确定了起始密码子在第 76位 , 终止密码子
在 1 284位 , 长度为 403个氨基酸的开放阅读框。ATG上游 - 3位核苷酸为 A, + 4位为 G, 是一个典
型的 Kozak结构 (图 5) , 这一结构对于蛋白质合成的 40S起始复合物正确识别起始密码子具有重要
作用 , 因此认为得到了大白菜 EST5421 cDNA的完整序列 , 图 5中横线所示为引物序列。
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　3期 贾 　晋等 : 大白菜苹果酸脱氢酶基因的克隆及序列分析 　
图 5　测序后 EST5421序列的开放阅读框分析
F ig. 5　O RF ana lysis of EST5421 after sequenc ing
213　MD H编码氨基酸的同源性分析
经氨基酸序列同源检索 , 大白菜 MDH编码的氨基酸序列与同科植物拟南芥苹果酸脱氢酶氨基酸
序列 100%同源 (图 6)。氨基酸序列的系统进化树表明 : 氨基酸的序列进化与植物的进化保持了一
致 , 同科植物在进化树上处于同一分支 , 而亲缘关系较远的处于不同分支 , 且氨基酸的同源百分率也
随物种亲缘关系的变远而变小。
图 6　大白菜苹果酸脱氢酶氨基酸序列与其它物种氨基酸序列的系统进化树
F ig. 6　Phylogenetic tree of a sequence of MD H gene in Ch inese cabbage w ith others spec ies
3　讨论
目前 , 国内外对植物苹果酸脱氢酶 (Malate Dehydrogenase, MDH ) 的研究已颇为深入 , 主要集
中在苹果酸脱氢酶的分离纯化 (Musrati et al. , 1998) , 蛋白高级结构的 X射线晶体衍射技术研究
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(Jessica et al. , 2001) , 苹果酸脱氢酶基因系统发育树分析 (Claus & W illiam, 2002) 等方面。在其
生物学功能方面 , 有研究认为 MDH可引起草酰乙酸盐的氧化以形成苹果酸盐 (Vance, 1997) , 增加
植物体内苹果酸的含量 , 从而螯合铝离子 , 显著提高植物体的耐酸、耐铝性。Song等 ( 2001) 研究
甜菜种子的人工老化 , 发现随着种子人工老化 , 苹果酸脱氢酶的活性下降 ; 孙成荣等 ( 2007) 采用
定量蛋白质组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白时发现 , 苹果酸盐脱氢酶表达下调。本课题组
研究发现在大白菜花蕾败育的发生过程中苹果酸脱氢酶基因下调表达 (贾晋 , 2008) , 苹果酸脱氢酶
基因下调表达是否与大白菜花蕾败育相关 , 以及大白菜花蕾败育是否与苹果酸脱氢酶参与的能量代谢
相关 , 还需要进一步通过反义 RNA或 RNA i技术加以验证 (A lison & Elaine, 2005)。苹果酸脱氢酶
全长基因的克隆为后续反义 RNA或 RNA i技术研究和时空表达特异性研究 ( Kim et al. , 1997) 奠定
了基础。
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