全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（9）：1513–1516
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–04–23；修回日期：2010–06–17
基金项目：国家自然科学基金项目（30871713）；国家科技支撑计划项目（2009BADB8B03）；河北省应用基础研究计划重点基础研究项
目（08965514D）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：shensx@hebau.edu.cn)
大白菜开花相关基因 FLC1的 BAC克隆筛选及
分析
石学萍，冯大领，王彦华，轩淑欣，申书兴*
（河北农业大学园艺学院，河北保定 071001）
摘 要：采用改良的混合池构建方法构建大白菜 BAC文库一级混合池和二级混合池，利用开花相关
基因 FLC1特异引物对其进行 PCR筛选。通过三步 PCR扩增、114个 PCR反应，筛选了 19 200个克隆，
获得了 2个 FLC1单克隆。克隆测序结果表明，其扩增产物的序列与大白菜 FLC1的相似性达到 99%，证
实此克隆为含 FLC1基因的 BAC克隆。
关键词：大白菜；BAC克隆；开花相关基因；混合池； PCR筛选
中图分类号：S 634.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）09-1513-04

Screening and Analysis of BAC Clones Containing Flowering Time Gene
FLC1 in Brassica campestris L. ssp. pekinensis Olsson
SHI Xue-ping，FENG Da-ling，WANG Yan-hua，XUAN Shu-xin，and SHEN Shu-xing*
（College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China）
Abstract：The primary and secondary pools of a bacterial artificial chromosome（BAC）library in
Chinese cabbage were constructed using improved BAC pooling strategy. The specific primers of
flowering time gene FLC1 were to screen those BAC clones by PCR amplification. In total two positive
FLC1 clones were obtained from 19 200 BACs through three steps of PCR screening with 114 reactions.
Sequence analysis of FLC1 clones showed that these fragments has 99% of homology with the FLC1 in
Chinese cabbage，indicating that the flowering time gene FLC1 is contained in the BAC clones.
Key words：Chinese cabbage；BAC clone；FLC1 gene；pool；PCR screening

大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour.）Olsson]是典型的春化敏感植物，春季抽薹
是白菜类作物春季生产的主要障碍。FLOWERING LOCUS C(FLC）基因是最早在拟南芥中发现的与
春化作用有关的基因（Lee et al.，1994；Sheldon et al.，2000），对花分生组织特性基因 LFY起抑制
作用，并编码一种新的MADS-box蛋白，FLC的表达水平越高，开花时间越晚（Michaels & Amasino，
1999；Yuan et al.，2009）。Schranz等（2002）研究发现，在白菜中有 4个 BrFLCs基因（BrFLC1，
BrFLC2，BrFLC3，BrFLC5），FLC 的重复是造成开花时间变异的原因，开花时间的表型变异是由
于 BrFLC1和 BrFLC2的加性效应造成的。Kim等（2006）研究了这 4个开花相关基因与各个连锁

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图 2 FLC1克隆的二级混合池（C ~ J）筛选
Fig. 2 Screening of secondary pools（C–J）for FLC1 clones
群的关系，Yang等（2006）将它们分别定位在连锁群 A10、A02和 A03上。本研究中以中国大白菜
‘85-1’自交系构建的 BAC文库为材料，筛选开花相关基因 FLC1的 BAC克隆，为研究其在大白
菜染色体上的定位以及染色体结构（如易位）或数量变异（如三体）对开花特性的影响奠定基础，
也为筛选抗抽薹反季节大白菜新品种提供技术基础，同时对 BAC库筛选方法进行了优化。
1 材料与方法
试验于2008年3月—2009年10月在河北农业大学园艺学院进行。试验材料为大白菜‘85-1’自交
系构建的BAC文库，由河北农业大学细胞生物学实验室提供。
根据GenBank中大白菜开花相关基因FLC1（登录号AY115678）设计合成1对PCR引物：P1为
5-AGGTACGTTACTTCCGTGAT-3，P2为5-GGAGATTTGTCCTGGTGAGA-3。PCR反应体系：100
ng模板DNA，1 U Taq DNA 聚合酶，0.5 µL dNTPs（2.5 mmol · L-1），各1 µL正向和反向引物（5
µmol · L-1）。PCR程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃
延伸10 min。
BAC文库混合池的构建参考 Liu等（2006）提出的方法并进行了改进。用灭菌的 384复制器在
装有 BAC克隆的 384板上沾取菌落于 LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。各菌落混合置于 10 mL
离心管中，即构成 1个一级混合池。共构建一级混合池 50个。利用碱裂解法（Sambrook & Russell，
2001）制备质粒 DNA，并以其为模板，进行 PCR筛选。取含阳性克隆一级混合池对应的 384冻存
板，用牙签分别挑取 A ~ P每行 24个克隆置于含 3 mL LB液体培养基的离心管中，37 ℃ 225 r · min-1
过夜培养，此菌液做为二级混合池。每个一级混合池对应的 384冻存板能构成 16个二级混合池，每
个二级混合池中有 24个 BAC单克隆。用牙签挑取含有阳性克隆的二级混合池对应的单克隆，过夜
培养并提取质粒，以此为模板进行 PCR筛选，经电泳检测找到含 FLC1的阳性单克隆。
PCR产物回收按照 Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0试剂盒进行，回收的 PCR
产物与 T–载体连接、转化，PCR验证转化菌落，挑取 10个克隆进行验证。将验证正确的克隆送上
海生工测序，用 NCBI站点的 BLAST进行核苷酸比对，分析 PCR扩增产物的序列与已知 FLC1基
因的相似性。
2 结果与分析
2.1 FLC1克隆的筛选
以 50个一级混合池为模板，利用特异引物 P1和 P2进行 PCR扩增，结果表明：第 146号池中
能够扩增出目的条带，其大小为 900 bp左右，与预期的扩增片段一致（图 1），说明其含有 FLC1克
隆。






图 1 FLC1克隆的一级混合池（140 ~ 146）筛选
Fig. 1 Screening of primary pools（140–146）for FLC1 clones
9期 石学萍等：大白菜开花相关基因 FLC1的 BAC克隆筛选及分析 1515

将 146号冻存板每 1行作为 1个二级混合池进行 PCR扩增，结果显示：在 I行和 L行含有
FLC1克隆（图 2）。对 L行的各个单克隆进行 PCR扩增结果表明，L行的 11号单克隆扩增到了目
的条带（图 3）。用同样方法在 I行的 20号单克隆扩增到了目的条带。通过以上 3步 PCR扩增共 114
个 PCR反应，筛选了 19 200个克隆，获得了 2个 FLC1单克隆。
2.2 FLC1单克隆的鉴定及分析
将单克隆的PCR产物与载体pMD-19连接、转化，PCR验证结果表明：扩增条带均在900 bp左右，
与筛选单克隆的扩增条带一致，证明转化后的克隆为阳性克隆（图4）。取该阳性克隆的菌株送上海
生工测序，测序结果表明，该片段长度为909 bp，与预期片段完全一致。
图 3 FLC1阳性单克隆的筛选 图 4 FLC1菌液的 PCR验证
Fig. 3 The single FLC1 positive clone screening 1 ~ 10：含FLC1的菌液；M：2 kb DNA分子量标准。
Fig. 4 PCR confirming of bacteria FLC1
1–10：The bacteria FLC1；M：2 kb DNA marker.

在NCBI站点进行了 BLAST比对，从表 1可以看出， PCR扩增产物的序列与大白菜
KBrH080A08BAC克隆、大白菜FLC1外显子和部分蛋白质编码序列（Coding sequences，cds）相似
性达到99%，与甘蓝FLC1基因相似性达到63%，证明此克隆为含FLC1基因的BAC克隆。

表 1 FLC1克隆的相似性比对
Table 1 Sequence similarities of compared with the FLC1 clones
登录号
Accession
序列名称
Description
最大相似分值
Max score
总分值
Total score
相似性/ %
Query coverage
AC155344.1 大白菜KBrH080A08克隆的完整序列 Brassica campestris ssp.
pekinensis clone KBrH080A08, complete sequence
1 668 1 668 99
AY115678.1 白菜类FLC1基因2-7号外元的部分序列 Brassica campestris FLC1
gene，exons 2 through 7 and partial cds
1 646 1 646 99
AM231517.1 芥蓝FLC1基因1-7号外元序列 Brassica oleracea var. alboglabra
FLC1 gene for flowering protein, exons 1-7
815 1 004 63
AY115674.1 甘蓝FLC1基因2-7号外元部分序列 Brassica oleracea FLC1 gene,
exons 2 through 7 and partial cds
813 1 002 63
AM231521.1 青花菜FLC1基因2-7号外元部分序列 Brassica oleracea var. italica
partial FLC1 gene for flowering protein exons 2-7
811 1 000 63
3 讨论
用于筛选BAC文库的方法主要有高密度影印杂交筛选法（王文生 等，2006；张洋 等，2008）
和PCR法，PCR法由于具有简便、快速、精确度高而被大多数人采用。吴新东等（2008）在研究美
利奴细毛羊BAC文库筛选时，一级混合池基于盘、行、列三维混合池组成，二级混合池基于整个BAC
文库而构建，先筛选二级混合池，再根据结果筛选相应的一级混合池。筛选7.4万个克隆，共构建一
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级盘混合池168个，一级行混合池672个，一级列混合池1 008个。此方法需要做的PCR反应较少，且
筛选多个不同功能基因的阳性克隆时可多次使用，但构建混合池较复杂。本试验中利用384冻存板的
384个克隆作为一级混合池，冻存板的各行做二级混合池，1个冻存板只需做16个二级混合池，然后
对阳性克隆行24个单克隆进行PCR验证。本试验从19 200个克隆中筛选到阳性克隆只需做50个一级
混合池，16个二级混合池，共114个PCR反应就能够获得2个阳性克隆。这样使构建混合池的程序简
化、贮存混合池占用空间减小，也减少了做单列池的工序，更重要的是减少了对384孔板的污染几率。
该文库筛选方法的优化，为快速筛选包含功能基因的阳性克隆提供了有效的技术手段。
本试验通过PCR方法筛选到2个BrFLC1基因的BAC克隆。但这2个克隆是否包含BrFLC1基因的
全部遗传信息还有待于进一步利用分子生物学技术对BAC克隆进行分析。由于在白菜类作物中存在
着多个FLC相关基因，因此，还需要筛选BrFLC2，BrFLC3，BrFLC5的BAC克隆，以期通过BAC-FISH
技术对大白菜开花相关基因进行染色体定位；并利用本课题组创建的大白菜初级三体（申书兴 等，
2006）研究不同BrFLCs基因的协同作用对开花特性的影响，为筛选抗抽薹反季节大白菜新品种提供
理论依据。

References
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