全 文 ：园 艺 学 报 , 一
纽 月 币
白菜春化相关基因 的克隆及表达研究
黄细松 , 李晋豫 , 余小林 , 孙保娟 , 曹家树
’
浙江大学蔬菜研究所 , 细胞与分子生物学实验室 , 杭州
摘 要 运用 同源基因克隆法从 ‘ 上海青 ’ 白菜 。 、 、 。
‘ ’ 和 ‘ 四九 ’ 菜墓 ‘ ’ 叶片中分离到 的同源基因 的编
码序列
、 启动子以及内含子 序列 序列比对发现 , 二者编码的核昔酸序列几乎完全一致 , 而且启动子及
内含子 序列也无实质性差异 对 ‘ 上海青 ’ 进行人工低温春化处理 , 一 基因在 ‘ 上海青 ’ 茎尖的
表达随着低温处理时间的延长逐渐减弱 , 低温处理 时 一 基因的表达已经非常弱 , 低温处理
时 , 表达已检测不到 , 花芽分化石蜡切片也表明 , 低温处理 , 茎尖已开始向生殖状态过渡 。 一
基因在 ‘ 四九 ’ 菜墓未现蕾之前的叶片中有强表达 , 而现蕾之后叶片中则检测不到 。
关键词 白菜 菜墓 春化 基因
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
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呷 ‘ ’ 呷
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‘ ’ 邵 ℃ ,
一
‘ ’ ,
一 ’
一 一
邢
呷 尹
百 是拟南芥春化成花途径中的一个重要基因 , 与 及 协
同作用使拟南芥产生晚开花 需春化 的生态型 , 。。 。 。 , 。 几 主
要在分裂活跃的区域 , 如芽和根尖分生组织 感受低温春化效应的部位 中表达
, , 它编码一个名为 一 的转录因子 , 。 的表达水平
收稿日期 一 一 修回日期 一 一
甚金项目 浙江省重大科技项 目 浙江省 自然科学基金项 目
通讯作者 一
园 艺 学 报 卷
越高 , 开花时间越晚 。 在拟南芥冬性生态型和春性生态型 中 , 的编码产物完全一致
, 。 研究表明 , 的内含子 含有对 进行调节所必需的重要调控序列 ,
。 , 。 , 。 , , 。 在拟南芥中 , 某些春性
生态型的 内含子 发生过不同的插入事件 , 导致 功能减弱 。 功能的弱化提供了一条拟
南芥春性生态型进化的途径 , 。
白菜 呷 , 中的普通 白菜
与菜蔓 同属十字花科芸蔓属 , 但普通白菜需要通过春化才能抽蔓
开花 , 而菜蔓则不需要 。 目前在十字花科不同属和不同种中 , 已分别克隆到 的同源基因 , 白菜上也
已经克隆到 个 的同源基因 , 以 , 但均欠缺内含子 序列 。 作者运用同源基因克
隆方法结合 厂 一 技术从普通白菜和菜蔓中克隆 的同源基因编码序列 及其内含
子 和启动子序列 , 比较了二者的异同 , 并对普通白菜不同时间人工春化条件下及菜蔓发育阶段转变前
后 的表达进行 一 分析 , 试图揭示白菜与菜蔓 基因及其启动子
、
内含子序列的差异 , 以
及序列差异与开花习性差异的关系 , 为阐明 基因与春化的关系提供进一步的证据 。
材料与方法
材料及其低温处理
试验所用材料为普通白菜品种 ‘ 上海青 ’ 和菜蔓品种 ‘ 四九 ’ 。 将吸涨的 ‘ 上海青 ’ 种子平铺
于底部垫上滤纸的培养皿中 , 放人 ℃的培养箱中催芽 , 待 乃 的种子露白后将培养皿转移到 ℃光
照培养箱分别进行
、 、 和 人工春化处理 。 处理结束后将种子点播于营养钵中置于光照培
养箱 昼 ℃ 夜 ℃ , 光 扮暗 。 每个处理生长 巧 以后 , 取茎尖 一 个 , 用 固定液
甲醛 冰醋酸 酒精 二 固定 , 制作石蜡切片 孙保娟 , , 观察花芽分化进程 。
同时对各处理材料取茎尖各 个 , 另播种 ‘ 上海青 ’ 白菜和 ‘ 四九 ’ 菜蔓于营养钵中置于光照
培养箱 条件同上 , 待真叶长出以后取叶片至少 , 迅速用液氮固定 , 一 ℃超低温冰箱保存 ,
用于提取 、 第 链和第 链的合成及 一 分析 。
提取 、 分离及 的合成
提取参照本实验室的方法 曹家树 等 , 进行 。 的分离参照 公
司 ⑧的说明书进行 。 沉淀用 水溶解 , 一 ℃保存备用 。 用分光光度计测定 闭 和
。 , 根据 。值计算 的产量 根据 。 。值判断 的质量 。 甲醛变性凝胶电泳
检测 的质量参照 《分子克隆实验指南 》 , 进行 。
第一链和第二链的合成参照 。 。 进行 。
、 内含子 及启动子的克隆
根据 上已登录的 序列 , 设计引物扩增 同源序列 , 上游引物为 ’
一 ‘ 下游引物为 ‘
一
竹
一 ‘ 。
反应体系 或 模板
· 林 一 ’ 林 , 反应缓冲液 林 , 林 ,
· 一 ’ 协 , 上下游引物 林
· 一 ’ 各 卜 , 聚合酶 , 加灭菌水至总
体积 林 。 条件为 ℃ ℃ ℃ ℃延伸 , 个循环 ℃延伸
, 将扩增得到的 产物进行回收
、
克隆和序列测定 。
根据已克隆到的 部分 序列 , 设计特异引物扩增 的 ‘末端 , 引物序列为
’一 一 ’。 退火温度为 ℃ , 其他反应条件同上 。
根据大白菜 基因 登录号 , 设计从起始密码子开始的上游引物
‘一 竹
一 ’ 根据扩增得到的 ‘末端序列设计位于 ’
期 黄细松等 白菜春化相关基因 的克隆及表达研究
区下游引物 ’一 一 ’ , 用于编码序列的扩增 。
退火温度为 ℃ , 其他反应条件同上 。
根据外显子 序列设计上游引物 ’一 竹
一 ’ 与下游
引物 几 ’一 一 ‘ , 用于内含子 序列的扩增 。 退
火温度为 ℃ , 其他反应条件同上 。
根据 外显子 设计 条反向特异引物 , ‘一竹
’ , ‘一 一 ‘ , ‘一
’ , 与所用的 个简并引物分别是 ‘一 一 ‘ , ’一
召 ’ , 忆 一 ’ , 进行 气 区的启动子序列的扩
增 。 反应体系和反应程序参照文献 , 进行 。
核昔酸序列分析
软件分析 的最大开放阅读框 。 用 软件对 一 和 一 的序列进行比
对 。 用 巧 程序 对克隆到的 ‘一 进行分析 , 在
邵 罗 和 儿 上对克隆
到的及沪艺 一 和 及卢艺吞 基因启动子序列进行保守元件分析 。
· 检测
先以肌动蛋白 引物进行 扩增 , 根据琼脂糖凝胶电泳结果 , 调整不同处理模板
双链 用量 , 使亮度一致 。 不同处理模板用量确定之后 , 把 引物换成 和
及 和 引物 , 进行 扩增 。
结果与分析
低温处理花芽形态分化观察
低温处理
、 、 和 , 茎尖所处的发育阶差异显著 图 。 低温处理 茎尖所处的阶
段与对照 相似 图 , 、 , 均处于营养生长阶段 , 茎端生长锥扁平 , 周围有分化或尚未分化
的叶原基 , 表明 的低温处理不足以促成茎尖状态的改变 。 而低温处理 图 , , 茎尖 已
开始花原基分化 , 已处于花芽分化的 级 惠麦侠 等 , , 生长锥膨大为具有一个中心圆突起 ,
其周缘出现一个或几个圆球状突起 , 该突起即为花原基 , 表明茎尖经过 的低温处理就可以顺利
完成发育阶段转变 。 低温 图 , 的处理促进花芽分化的效果更加明显 。 低温处理时间越
长 , 花原基 单花器官 生长的速度越快 。
图 低温处理不同时间下 白菜的花芽分化
一 ℃处理 、
、 、 , 花芽未分化期 花原基分化始期 花原基增大伸长期 。
生长锥 花原基
回 幻免 八 ” 即 洲台 代 ℃ 陇 对
一 ℃ , , , , 卿 一笔
,
此 罗
园 艺 学 报 卷
‘ 上海青 ’ 白菜和 ‘ 四九 ’ 菜茎 的克隆和序列比较
从 ‘ 上海青 ’ 白菜和 ‘ 四九 ’ 菜蔓叶片中均克隆得到编码序列为 的片段
,
分别命名为
一 和 一 。 其最大开放阅读框均为 。 将 乙 一 和 ’ 乙
一 与大白菜的 进行
比较 , 结果 图 显示 一
、 一 与 编码序列的一致性达到了 。
图 ‘ 上海青 ’ 白菜和 ‘ 四九 ’ 菜墓 一 、 刀‘ 乙 基因与大白菜 , 基因的比较
阴影部分表示比对基因的核营酸序列一致
, “ 一 ” 表示比对基因的序列缺失
, 下图同
帅 七旧 皿 丑 众刀 翻期砰“办站 朋 月‘站 ‘ 山 ’ 朋
口 ‘ 认 台 ‘ ’
罗
况 “ 一 ” 姗
‘ 上海青 ’ 白菜和 ‘ 四九 ’ 菜墓 的内含子 的获得和序列比较
以 和 为引物
, ‘ 上海青 ’ 白菜和 ‘ 四九 ’ 菜蔓基因组 为模板 ,
均得到长约 的片段 。 其中第一内含子长度约 。 对 ‘ 上海青 ’ 白菜和 ‘
内含子 序列进行比对 , 结果表明两者的序列并无实质差异 , 编码序列的一致性达
经 反应 ,
四九 ’ 菜蔓的
图 。
期 黄细松等 白菜春化相关基因 的克隆及表达研究
图 ‘上海青 ’ 白菜和 ‘ 四九 ’ 菜 , 、 内含子 序列比较
如 邢 忿洲认 胎
‘ ’ 认 台 认 台 ‘ ’
将白菜 一 的内含子 序列与拟南芥的
内含子 序列进行比较 , 结果显示 一 内含
子 比拟南芥 内含子 约短 , 拟南芥
中的几个保守的区段 、 、 一 、
、
和 一
, 也大致存在于 一 内
含子 中 图 。
‘ 上海青 ’ 白菜和 ‘ 四九 ’ 菜墓 启
动子的获得和序列比较
以 , , 与简并引物进行
, 经反应在 ‘ 上海青 ’ 和 ‘ 四九 ’ 中均得到
长约 的片段 。 根据所得片段与原始片段
存在的重叠区域 , 确定扩增片段为 ‘一 序列 。
根据 程序对克隆的 ’一 序列的分析 , 预
测该段序列内含有启动子 。 对克隆到的 一 和
图 拟南芥 与白菜 一 内含子 的序列比较
灰色方框显示保守部分 。
、 、 、 、 巧 和 在拟南芥
中被鉴定为与春化对 的后成遗传抑制有关 。
·
, , , , ,
一
一 基因启动子序列进行保守元件分析 ,
均存在 和 , 符合启动子的基本特征 。 对两者的启动子序列进行 比对 图
对于 ‘ 上海青 ’ 白菜 , ‘ 四九 ’ 菜蔓启动子在第 饰 一 第 之间缺失了 个碱基 , 但这
碱基内并不含有任何调控序列 。 其余序列相似性达到 。
其中
。 相
个
园 艺 学 报 卷
图 ’上海青 ’ 白菜和 ‘ 四九 ’ 菜墓 、 启动子序列的比较
·
码 左“ 刃臼
’ 台 ‘ ’ 众 哪
‘ ’
的半定量 一 分析
图 为对 ℃处理
、 、 和 的 ‘ 上海青 ’ 白菜茎尖及 ‘ 四九 ’ 菜蔓的叶片现蕾前后
的表达情况进行的 一 分析 。
图 不同时间低温处理的 ‘ 上海青 ’ 白菜茎尖生长点和 ‘ 四九 ’ 菜墓现蕾前后叶片中 的 表达分析
肘胡 。 和 分另代表现蕾前和现蕾后
以 和 为引物
, 以 口 和 阶 口 为引物
· ‘ ’
, 一 ‘ ’
触
肠胡
即
价 。 口 口
期 黄细松等 白菜春化相关基因 的克隆及表达研究
分别使用 和 及 和 为引物 , 以经过 引物定量后
的双链 为模板 , 进行 一 反应 。 和 为引物的扩增产物表示为 一 ’ ,
和 为引物的扩增产物表示为 一 。 结果显示 , 对 ‘ 上海青 ’ 白菜而言 ,
随着低温处理时间的延长 , 一 的表达逐渐减弱 , 低温处理 , 一 的表达 已经非常弱 ,
低温处理 时 , 已检测不到表达 。 对 ‘ 四九 ’ 菜墓而言 , 现蕾之前 一 有强表达 , 而现蕾之
后检测不到 一 的表达 图 。
讨论
是拟南芥春化开花途径的一个重要抑制因子 , 其表达调控是近年来研究的热点 。 是
的重要激活因子 , 是冬性两年生 习性的主要决定因子 。 天然的早花生态型绝大部分携带隐性
户 等位基因 , 导致 的表达不能上调 。 因此 , 早花生态型可能是通过晚花生态型 功能的丧
失进化而来的 , 。 但某些早花生态型仍携带显性的 等位基因 , 早花
表型是由于 位点功能的弱化所致 , 的序列分析发现这些早花生态型的 转录产物与晚
花生态型几乎完全一致 , 表明可能是 受到的调节不 同所致 。 研究发现 , 这些早花生态型
基因的内含子 序列发生 了不 同的插人事件 , 使某些调控序列受到破坏 , 从而导致 不
稳定 , 进而对春化的需求减弱 , 。 目前 , 在 同 呷 中克隆
到的 个 基因 、 、 、 均未报道 内含子 的序列 ,
。
本研究从白菜品种 ‘ 上海青 ’ 和菜墓品种 ‘ 四九 ’ 中运用同源基因克隆方法结合 技术 ,
克隆到二者的 基因的编码序列 , 序列比对表明二者的一致性高达到 , 这与拟南芥中的
情形类似 。 另外我们还扩增到了白菜和菜蔓 基因的内含子 和启动子的序列 。 二者内含子
的相似性达 , 且多为单个和少量核昔酸的差异 , 表明白菜与菜蔓对春化需求不同的原因似乎
与拟南芥不同 , 并非与内含子 的转座插人事件有关 对启动子序列的比较发现 , 菜墓比白菜缺少一
段 的序列 , 但经分析 , 该 的序列内并不含有任何调控序列 , 不影响启动子的功能 。
一 表达分析表明 , ‘ 上海青 ’ 白菜茎尖 一 基因的表达随着低温处理时间的延长表达
逐渐减弱 , 低温处理 已基本检测不到表达 , 低温处理 后 , 完全检测不到表达 。 菜蔓现蕾前
叶片中 一 基因有较强表达 , 现蕾以后检测不到其表达 菜蔓开花并不需要经历低温春化的过
程 , 而白菜开花需要经历低温春化 。 本研究表明 , 基因在白菜和菜蔓阶段转变以前都有较强表
达 , 当植株转向生殖生长后 , 基因的表达逐渐减弱以至检测不到 , 二者的表达趋势一致 。 由于
在拟南芥中 基因的上游有包括 自主开花途径 , 春化途径在内的多条途径共同对其进行调控 , 所
以我们认为 , 菜蔓很有可能主要通过 自主开花途径的基因对 一 的表达进行调控 , 使菜蔓虽然不
需要通过春化作用 , 仍可开花 , 且 一 的表达趋势与白菜 一 一致 也有可能其 尺了基因发
生了类似于拟南芥的突变 。 但 目前 , 在 同 呷 中尚未有关于 的报道 。 因此
,
菜蔓不需要春化的原因还有待进一步研究 。
此外 , 本研究用两对不同的引物对 一 的表达进行了 一 分析 。 引物 和
在 叩 同 呷 ‘ 中可 以扩增 个转录本 , ,
, 括号中数字代表相应大小的转录本的数 目 , , 但我们只扩增出 条约
的产物 一 ’ 图 。 经过 春化处理 , 检测不到任何转录本 。 另一对全长引物
和 扩增产物包括了整个编码序列和 ‘端部分非编码序列 , 推测此转录本是
一 基因的转录本 。 大白菜中 属于一个多基因家族 , 等 从大 白菜扩增得到的
用 ’ 为探针杂交表明 , 以单拷贝存在 。 一 分析还表明 , 低温处理 ,
园 艺 学 报 卷
一 的表达 已经非常弱 , 同时低温处理 的花芽分化结果表明 , 的低温处理对于 ‘ 仁
海青 ’ 已经足够 。 但低温处理 , 以 和 为引物扩增的产物比以
和 口 为引物扩增的产物亮度要强 , 进一步表明似乎 。 只是多基因家族中一个基 因
的转录产物 。
一 , 一 , 一 脚
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曹家树 , 曹寿椿 , 易清明 白菜及其相邻类群基因组 的 分析 园艺学报 , 一
, , , 哪 、
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一 , 一 , 一罗 , 一 , 一
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惠麦侠 , 巩振辉 , 张鲁刚 , 柯桂兰 , 张明科 大白菜花芽形态分化的研究 园艺学报 , 一
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一 己叩 , 一
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, 分子克隆实验指南 第 版 黄培堂译 北京 科学出版社
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孙保娟 白菜花组织再生体系的建立及离体条件下阶段发育转年的研究 〔博士论文 杭州 浙江大学