全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (1) : 175～178
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 04 - 08; 修回日期 : 2005 - 06 - 27
基金项目 : 河北省自然科学基金项目 (300162)
适于制作人工种子的一品红体细胞胚的培养
肖 颖 1, 2 王 刚 1
(1 河北师范大学生命科学学院 , 石家庄 050016; 2 石家庄学院化学系 , 石家庄 050801)
摘 要 : MS + 2042D 210 mg·L - 1 + 62BA 015 mg·L - 1固体培养基较适合一品红苞片诱导愈伤组织。MS
+ 2042D 110 mg·L - 1 + 62BA 015 mg·L - 1 +水解酪蛋白 80 mg·L - 1固体培养基上体细胞胚分化率最高。活
性炭、MS培养基和悬浮振荡培养有利于高频率体细胞胚发生。球形、心形及梨形胚及时转入添加 NAA 012
mg·L - 1、62BA 015 mg·L - 1及水解酪蛋白 80 mg·L - 1的 MS液体培养基中 , 有利于高质量体细胞胚发生。
子叶期胚及时转入添加 ABA 015 mg·L - 1的上述培养基中 , 会提高正常体细胞胚的百分率。用高质量 (子
叶期 ) 的一品红体细胞胚包埋制作人工种子 , 在无菌条件下萌发率为 5811%。
关键词 : 一品红 ; 愈伤组织 ; 体细胞胚发生 ; 人工种子
中图分类号 : S 685123 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0120175204
Stud ies on H igh Qua lity Soma tic Em bryogenesis Applied to Artif ic ia l Seed of
Euphorbia pu lcherrim a W illd.
Xiao Ying1, 2 and W ang Gang1
(1 The College of L ife Science, Hebei N orm al U niversity, Sh ijiazhuang 050016, China; 2D epartm en t of Chem istry, Shijiazhuang
College, Shijiazhuang 050801, China )
Abstract: MS agar medium supp lemented with 2042D 210 mg·L - 1 and 62BA 015 mg·L - 1 was p roved
to be the best for inducing callus from the leaves of Euphorbia pu lcherrim a W illd. It was suitable for somatic
embryogenesis when the concentration of 2042D was reduced to 110 mg·L - 1. Activated carbon, MS medium
and suspension culture were suitable for high frequency somatic embryogenesis. If globular embryoids, heart2
shaped embryoids and pear 62BA shaped embryoids were transferred into MS medium supp lemented with NAA
012 mg·L - 1 , 62BA 015 mg·L - 1 and casein hydrolyzed 80 mg·L - 1 , the quality of somatic embryos would
be imp roved. If cotyleden embryoids were transferred in time into a forementioned medium added on ABA 015
mg·L - 1 , the rate of normal somatic embryogenesis would be increased.
Key words: Euphorbia pu lcherrim a; Callus; Somatic embryogenesis; A rtificial seed
1 目的、材料与方法
一品红 ( Euphorbia pu lcherrim a W illd. ) 的繁殖常采用扦插的方法 , 但繁殖速度慢且繁殖系数低 ,
目前多以叶片、茎段为外植体诱导愈伤组织 , 再分步诱导芽或根 , 继而生成苗〔1, 2〕。本试验于 2001～
2002年在河北师范大学进行。以一品红 (购自西三教花卉基地 ) 苞片为外植体 , 离体培养诱导体细
胞胚 , 制作人工种子 , 从而再生成苗 , 此法可大大提高繁殖系数且又因体胚具有双极性 (一端为芽
端 , 一端为根端 ) , 不需分步诱导根或芽 , 故又可简化培养步骤 , 缩短培养时间。植物人工种子的报
道多集中于作物、蔬菜 , 花卉人工种子的研究少见报道 , 而一品红人工种子的研究国内未见报道。
愈伤组织的诱导 : 将一品红苞片常规消毒后切成 016 cm2 的小块 , 接种到添加不同浓度 62BA和
2042D的 MS固体培养基中 (表 1) , 每瓶接种 5片并称质量 , 第 20天继代时再次称量。每个处理接
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种 7瓶 , 3次重复。培养温度为 (25 ±2) ℃, 暗培养。
体胚的诱导 : 将 C培养基 (表 1) 中的愈伤组织接种于 D、E、F、G培养基 (表 2) , 每瓶接种 5
块淡黄色疏松且直径为 015 cm的愈伤团诱导体胚。在确认 E培养基体胚诱导率较高的情况下 , 在 E
培养基中加入活性炭 1 g·L - 1 , 以期提高诱导率。另外将 H培养基 (表 2) 的添加物分别加入到 N6
和 B5 培养基 , 比较体胚的诱导效果。每个处理均接种 7瓶 , 3次重复 , 培养温度 ( 25 ±2) ℃, 光照
强度 2 000 lx, 光照时间 12 h·d - 1。20 d后统计体胚发生率。
将培养基 C中的愈伤组织接种在 E培养基 (表 2) 中 , 分为固体培养基静止培养和液体培养基
振荡 (110 r·m in - 1 ) 培养两种方式。每瓶接种 5 g, 每个处理接种 7瓶 , 3次重复 , 培养温度、光照
等同上。
高质量体细胞胚的培养 : 将液体的 E培养基中培养的不同时期体胚混悬液用物理过筛法逐级通
过 10目 (子叶期胚 )、20目 (心形胚和梨形胚 ) 及 40目 (球形胚 ) 的金属筛 , 即可分别获得发育
期大致相同的体胚〔3〕。
将球形胚、心形胚及梨形胚混合在一起 , 接种于液体的 E、 I、J、K培养基 (表 4) 中 , 各处理
接种 5瓶 , 3次重复 , 继代 2次 (继代间隔 7 d) 后 , 测量体胚的长度并观察子叶期体胚的发育情况。
将子叶期体胚接种到液体培养基 J和 L (在 J的基础上加入 ABA 015 mg·L - 1 ) 中 , 每瓶接种 20个
双子叶体胚 , 每个处理接种 7瓶 , 3次重复 , 继代 4次 (继代间隔 7 d) 后 , 统计正常体胚的百分率。
体细胞胚的包埋及萌发 : 配制 2% CaCl2 溶液 ; 配制 3%海藻酸钠 , 其中附加 1 /2MS基本培养基 +
62BA 015 mg·L - 1 + GA3 015 mg·L - 1 + IBA 015 mg·L - 1〔4〕及 115%麦芽糖。包埋剂经高压灭菌。将
子叶期体胚放入海藻酸钠溶液后 , 再用吸管逐个吸起并滴入 CaCl2 溶液中络合 15 m in, 捞起放入无菌
水中浸洗 15 m in, 制成具有一定强度的人工种子胶丸。将人工种子胶丸播种于无激素的 MS固体培养
基上 , 每瓶播种 15粒 , 播 7瓶 , 3次重复 , 培养温度 (25 ±2) ℃, 光照 2 000 lx、12 h·d - 1。30 d后
统计人工种子萌发率。
2 结果与分析
211 不同植物生长调节剂水平对愈伤组织诱导的影响
表 1表明 , A、B、C 3种培养基均可诱导出愈伤组织 , C中愈伤组织最早萌动 (约 7 d) 且最为
疏松。生长素与细胞分裂素的比例较高时 (2042D /62BA为 4 /1) 有利于诱导愈伤组织 , 其比例较低
时 (3 /1或 2 /1) 虽然可以诱导愈伤组织 , 但脱分化不完全。
表 1 2042D和 62BA水平对愈伤诱导的影响
Table 1 The im pact of 2042D and 62BA on ca llus culture of Euphorb ia pu lcherrim a
代号
Code
固体培养基
Agar medium
2042D
(mg·L - 1 )
62BA
(mg·L - 1 )
接种外植体数 Number
of transferred exp lants
产生愈伤组织块数
Number of calli
愈伤诱导率 Induction
rate of callus( % )
相对生长量 3
Relative growth
A MS 110 015 105 74 7015 bB 01380 C
B MS 115 015 105 80 7612 bB 01513 B
C MS 210 015 105 105 100 aA 01992 A
3 相对生长量 = (终质量 - 初质量 ) /初质量。
Relative growth = ( the final mass - the original mass) / the original mass.
212 高频率体细胞胚的发生
一品红体胚发生于愈伤组织表面 , 最初为一些小的乳白色光滑而致密的球形突起。表 2表明 , 一
品红由愈伤组织分化出体胚需要降低生长素 2042D的浓度 , 当其浓度为 110 mg·L - 1时体胚分化率最
高 , 过高或过低都不利于体胚的发生 , 这一现象与陈利萍等〔5〕的研究相似。
在培养基 E中加入活性炭 1 g·L - 1后 , 体胚发生率大为增加 (表 2, H ) , 可能由于活性炭作为
吸附剂 , 可以去除酚类氧化造成的毒害效应 , 减轻褐变。另外在人工种子包埋基质中加入一定比例的
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1期 肖 颖等 : 适于制作人工种子的一品红体细胞胚的培养
活性炭对种子萌发有促进作用 , 推测也与活性炭具有较好的吸附性有关〔6〕。
以 H培养基为基础 , 比较 MS, N6 和 B5 基本培养基对体胚发生率的影响 , 仍是以 MS为基本培
养基的 H培养基效果最好 (表 2)。MS, N6 和 B5 培养基中 NH +4 /NO -3 的比例分别为 1 /1119, 1 /3199
和 1 /14163, 可见适当提高 NH +4 /NO -3 的比例可能有利于体胚的分化。
表 2 2042D和活性炭 ( AC) 水平对体细胞胚发生的影响
Table 2 The im pact of 2042D and activa ted carbon ( AC) on soma tic em bryogenesis
代号
Code
固体培养基
Agar medium
浓度 Concentration (mg·L - 1 )
2042D 62BA 水解酪蛋白Casein hydrolyzed 活性炭AC( g·L - 1 ) 接种愈伤数Number oftransferred calli 产生体胚的愈伤块数Number of calli wheresomatic embryo occurred 体胚发生率Rate of somaticembryogenesis( % )
D MS 115 015 80 0 105 20 1910 bB
E MS 110 015 80 0 105 54 5114 aA
F MS 015 015 80 0 105 23 2119 bB
G MS 0 015 80 0 105 25 2318 bB
H MS 110 015 80 1 105 96 9114 A
E MS 110 015 80 0 105 59 5612 B
H MS 110 015 80 1 105 99 9413 A
N6 110 015 80 1 105 53 5015 B
B5 110 015 80 1 105 13 1213 C
表 3表明 , 及时对胚性愈伤组织进行悬浮培养是提高体胚发生率的重要环节。愈伤组织在悬浮条
件下 , 胚性细胞游离度高 , 接触培养基更为直接 , 改善了营养条件 , 有利于胚胎发生。
表 3 不同培养方式对体细胞胚发生的影响
Table 3 The im pact of d ifferen t culture m odes on soma tic em bryogenesis
培养方式
The culture mode
接种愈伤质量
Mass of transferred callus( g)
体胚数
Total number of somatic embryos
体胚数 /质量
Number of somatic embryos/mass
固体静止
The stillness culture on agar medium
5
2911 B
5182
液体振荡
The suspension culture in liquid medium
5
10611 A
21122
213 高质量体细胞胚的获得
一品红体细胞胚诱导时会出现不同步现象 , 即同一培养时间可观察到不同发育时期的体细胞胚 :
球形胚 , 心形胚 , 梨形胚及子叶期胚 (图版 , 1～4)。为使人工种子发芽整齐 , 用于包埋制种的体细
胞胚必须经同步化处理。
表 4 NAA与 62BA配合对高质量体细胞胚发生的影响
Table 4 The im pact of NAA coopera ted w ith 62BA on h igh qua lity soma tic em bryogenesis
代号
Code
液体培养基
L iquid medium
浓度 Concentration (mg·L - 1 )
2042D NAA 62BA 水解酪蛋白Casein hydrolyzed 体胚数 Number of somatic embryos总数Total 双子叶Two2cotyledon 多子叶Multi2cotyledon 体胚长度 Length ofsomatic embryos< 3 mm > 3 mm
E MS 110 0 015 80 185 33 (1718) B 48 104 81 (4318) b
I MS 015 0 015 80 193 37 (1912) B 58 98 95 (4912) b
J MS 0 012 015 80 263 169 (6413) A 58 36 227 (8613) a
K MS 0 012 110 80 216 56 (2519) B 113 47 169 (7812) a
注 : 括号内数字为占体细胞胚总数的百分数。
Note: The number in bracket was the percent of the total number of somatic embryos.
表 4表明 , NAA与 62BA配合使用可促进未成熟体胚的发育 , 增大体胚的体积 , 提高正常体胚
发生率。在 J培养基 (表 4) 的基础上添加 ABA及未添加 ABA时正常体胚百分率分别为 92%及
64% , 经 t - 检测 , 差异极显著。虽然 ABA是一种生长抑制剂 , 但在一定浓度 ( 015 mg·L - 1 ) 下
能显著抑制多子叶体胚的产生并促进正常体胚的发育和成熟 , 对获得高质量的双子叶正常体胚十
分有利。
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综上所述 , 一品红愈伤组织在分化形成体胚之后 , 其发育阶段的培养条件十分关键。发育早期的
球形、心形及梨形胚及时地转入 J培养基 (表 4) 中 , 会显著提高体胚质量。待体胚发育进入子叶期
时 , 及时转入添加 ABA 015 mg·L - 1的上述培养基中 , 会显著提高正常体胚的百分率。
214 包埋及萌发
3～5 mm长的子叶期体胚发育较为成熟 , 体内物质积累亦丰富 , 适于包埋制作人工种子。一品红
人工种子胶丸播种在无激素的 MS固体培养基上 (图版 , 5、6) , 萌发率为 5811%。
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Sinica, 2001, 28 (5) : 435～439 ( in Chinese)
图版说明 : 1. 球形胚 ( ×30) ; 2. 心形胚 ( ×25) ; 3. 梨形胚 ( ×25) ; 4. 子叶期胚 ( ×15) ; 5. 人工种子 ; 6. 人工种子萌发。
Explana tion of pla tes: 1. Globular embryoid ( ×30) ; 2. Heart2shaped embryoid ( ×25) ; 3. Pear2shaped embryoid ( ×25) ; 4. Cotyledon
embryoid ( ×15) ; 5. A rtificial seeds; 6. Germ ination of artificial seeds.
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