全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (3) : 403 - 408
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 10 - 15; 修回日期 : 2008 - 01 - 21
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA100109)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhaolj5073@ sina1com)
多花蔷薇假珠芽诱导、体细胞胚发生及植株高效再
生
田传卫 1 , 尚爱芹 1, 2 , 张建甫 1 , 郭艳超 1 , 梁建丽 1 , 赵梁军 13
(1 中国农业大学观赏园艺与园林系 , 北京 100094; 2 河北农业大学园艺学院 , 河北保定 071001)
摘 　要 : 以多花蔷薇 ‘无刺 3号 ’成熟种子为外植体 , 探讨了假珠芽诱导、体细胞胚发生及植株高效
再生的方法。结果表明 , 种子的子叶在添加 2, 42D 015～2 mg·L - 1的 1 /2 MS培养基上暗培养 30 d后所产
生的愈伤组织 , 接种到添加 TDZ 5～20 mg·L - 1的 1 /2 MS培养基上光培养 20 d产生初级假珠芽。假珠芽在
添加 TDZ 10 mg·L - 1和 GA3 011 mg·L - 1的诱导培养基上暗培养 20 d后 , 在含麦芽糖的无植物生长调节剂
的培养基上光培养产生少量次级假珠芽和胚性愈伤组织。假珠芽保存在诱导培养基上。胚性愈伤组织可发
育成大量正常体细胞胚 , 继而再生正常植物。假珠芽可通过上述方法不断诱导体细胞胚和假珠芽 , 通过这
种方法假珠芽已经保存了 2年。
关键词 : 多花蔷薇 ; 假珠芽 ; 体细胞胚 ; 植株再生
中图分类号 : S 685112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0320403206
Pseudobulb ils Induction , Soma tic Em bryogenesis and Shoot Regenera tion in
R osa m u ltif lo ra Thunb.
TIAN Chuan2wei1 , SHANG A i2qin1, 2 , ZHANG J ian2fu1 , GUO Yan2chao1 , L IANG J ian2li1 , and ZHAO L i2
ang2jun13
(1D epartm ent of O rnam ental Horticulture and Landscape A rchitecture, China A gricultural U niversity, B eijing 100094, China;
2 College of Horticu lture, Hebei A gricultural U niversity, B aoding, Hebei 071001, China)
Abstract: A p rotocol for the induction of somatic embryogenesis via p seudobulbils from mature seeds of
R osa m ultif lora‘ Inerm is 3’was established. The results showed that the p rimary p seudobulbils were obtained
by using a two2stage p rocedure where excised seed cotyledons were incubated 30 days on the 1 /2 MS medium
supp lemented with 2, 42D at 015 - 2 mg·L - 1 under the dark conditions for calli induction, and subsequently
transferred to a 1 /2 MS medium supp lemented with TDZ at 5 - 20 mg·L - 1 under the light conditions for 20
days for p seudobulbils induction. The p seudobulbils were incubated 20 days on the induction medium supp le2
mented with TDZ at 10 mg·L - 1 under the dark conditions and then transferred to the hormone2free medium
supp lemented with maltose instead of sucrose under light conditions for the secondary p seudobulbils and em2
bryogenic calli induction. The p seudobulbilswere maintained on the induction medium. The embryogenic calli
developed into normal somatic embryos then p lantlets. By this way, the p seudobulbils have been maintained
for two years by far.
Keywords: R osa m ultif lora Thunb. ; p seudobulbil; somatic embryogenesis; shoot regeneration
多花蔷薇 (R osa m ultif lora Thunb. ) 是切花月季的重要砧木。中国农业大学从多花蔷薇中筛选出
一系列无刺新品系 , 其中 ‘无刺 3号 ’生长健壮 , 与切花月季的亲和性好 , 切花产量高 (吕娟妃
等 , 2004)。但 ‘无刺 3号 ’对根癌病的抗性不强 (赵小兰 等 , 2005) , 需要对其进行基因工程改
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
良。体细胞胚是遗传转化的良好受体 , 但蔷薇属植物体细胞胚发生、体细胞胚萌发以及植株再生均较
困难。有报道以 3种月季试管苗小叶片为外植体诱导出体细胞胚和次级胚 , 并再生出植株 , 其中最成
功的品种是月季 ‘Carefree Beauty’ (L i et al. , 2002) ; 另有以月季 ‘萨蔓莎 ’试管苗小叶片为外植体
成功诱导出假珠芽 , 并从假珠芽诱导出可长期继代的愈伤组织 , 成功再生出植株 (高莉萍和包满珠 ,
2005)。尽管在柑橘属和山茶属植物上均可通过假珠芽诱导产生体细胞胚 (Botton & Botha, 1975; 赖
钟雄和林莉 , 2004) , 但在蔷薇属植物上未见报道。本试验中以多花蔷薇 ‘无刺 3号 ’为试材 , 建立
一套假珠芽诱导、体细胞胚发生和植株高效再生的技术体系 , 为多花蔷薇乃至蔷薇属植物的基因工程
改良奠定基础。
1　材料与方法
选取多花蔷薇 ‘无刺 3号 ’成熟种子 , 用浓盐酸处理 30 m in后 , 流水冲洗 20 m in, 去外种皮后
在无菌操作台上用 70%的酒精消毒 30 s, 无菌水冲洗 2～3次 , 然后用 10%次氯酸钠溶液消毒 10
m in, 用无菌水冲洗 4～6次 , 剥出子叶并横切成基部和顶部两部分 , 作为初代培养的外植体。
愈伤组织诱导 : 将成熟种子的子叶接种于添加不同浓度 2, 42D的培养基上进行暗培养 30 d, 诱
导愈伤组织。
假珠芽诱导及其脱分化 : 将获得的子叶愈伤组织转入添加不同浓度 TDZ的培养基上进行光培养
20 d, 诱导假珠芽 , 并延长培养时间使其脱分化。
胚性愈伤组织诱导及新的假珠芽发生 : 将开始脱分化的假珠芽转入含 3%蔗糖的无植物生长调节
剂的培养基上进行光培养 , 诱导胚性愈伤组织和新假珠芽。
新假珠芽脱分化 : 将新假珠芽转入添加不同浓度 TDZ的培养基上进行暗培养 20 d, 使其脱分化
成胚性愈伤组织。
体细胞胚诱导与植株再生 : 将胚性愈伤组织转移到含有不同碳源的无植物生长调节剂的培养基上
进行光培养 , 再次诱导体细胞胚和再生植株。再生植株在 MS +NAA 012 mg·L - 1培养基上顺利生根 ,
生根苗移植于混合基质 (草炭 ∶蛭石 ∶珍珠岩 = 2∶1∶1) 中 , 90%的生根苗移栽成活。
基本培养基均为 1 /2 MS (盐减半 ) , 培养基中均添加 215% Gelrite, pH 518。GA3采用过滤灭菌 ,
其他植物生长调节剂均在培养基灭菌前加入。培养基在 121 ℃高压灭菌锅中灭菌 15 m in。光培养温度
为 (25 ±2) ℃, 光强为 25μmol·m - 2 ·s- 1 , 光周期为 16 h光 /8 h暗 , 暗培养温度 (23 ±2) ℃。
试验采用随机区组设计 , 重复 3次 , 每重复为 10个外植体。
在培养期间定期取样 , 用 FAA液固定 , 采用石蜡切片 , 切片厚 12μm, 番红 —固绿染色 , 用奥
林帕斯光学显微镜观察照相。
2　结果与分析
211　种子子叶愈伤组织的诱导
接种 7 d后子叶切口处开始膨大 , 形成黄白色愈伤组织 , 20 d后形成大量愈伤组织 , 30 d时愈伤
组织颜色稍变褐 , 愈伤组织量不再增加。暗培养条件下 , 子叶在无 2, 42D的培养基上不产生愈伤组
织 , 而在所有含 2, 42D的 1 /2 MS培养基上均产生愈伤组织 (表 1)。随着 2, 42D浓度的增大 , 愈伤
组织发生玻璃化 , 且褐化程度较深。当 2, 42D浓度为 015 mg·L - 1时 , 子叶愈伤组织分化率达到最大
值 , 为 9617%。
212　假珠芽的发生及其脱分化
在光照培养下 , 愈伤组织不断增大并逐渐褐化 , 15 d时愈伤组织上形成少量的假珠芽 (图版 Ⅰ,
a) , 随后假珠芽开始脱分化 , 20 d后脱分化程度进一步加强 (图版 Ⅰ, b)。表 2所示的试验结果表
404
　3期 田传卫等 : 多花蔷薇假珠芽诱导、体细胞胚发生及植株高效再生 　
明 , 在不含 TDZ的培养基上 , 子叶愈伤组织均不能产生假珠芽 , 随着 TDZ浓度的增大 , 产生的假珠
芽数量和假珠芽的脱分化率均呈现出先增多后减少的趋势。在当 TDZ浓度为 10 mg·L - 1时 , 愈伤组
织所产生的假珠芽数量最多 , 为 9个 , 假珠芽的脱分化率也最高 , 达到 8313% (表 2)。这说明 TDZ
的浓度对假珠芽的诱导及其脱分化起关键作用。
表 1　2, 42D对诱导多花蔷薇的成熟种子产生愈伤组织的影响
Table 1　Effects of d ifferen t 2, 42D on ca lli induction from
ma ture seeds of Rosa m u ltif lo ra
2, 42D /
(mg·L - 1 )
外植体数
Number of
exp lants
愈伤化数
Number
of calli
愈伤组织分化率 /%
Rate of calli induction
0100 30 0 0 b
0125 30 24 8010 a
0150 30 29 9617 a
1100 30 27 9010 a
2100 30 26 8617 a
　　注 : 所有数据是暗培养 30 d后的统计值 , 所有培养基均添加
脯氨酸 300 mg·L - 1。表中字母表示显著水平为 P < 0105。
Note: Data were collected after 30 days culture under the dark con2
ditions. A ll the medium s were supp lemented with proline at 300 mg·
L - 1. Letters in the table indicate significant differences at P < 0105. 表 2　TD Z对诱导多花蔷薇的子叶愈伤组织产生假珠芽的影响Table 2　Effects of d ifferen t TD Z on induction of pseudobulb ilsfrom the ca lli of cotyledon s in Rosa m u ltifloraTDZ/(mg·L - 1 ) 愈伤组织数Number ofcalli 假珠芽 Pseudobulbil数量Number 发生率 /%Induction 脱分化率 /%Dedifferentiation0100 30 0 0 c 0 b2150 30 0 0 c 0 b5100 30 3 1010 bc 5010 ab10100 30 9 3010 a 8313 a20100 30 6 2010 ab 5516 ab　　注 : 所有数据是光培养 20 d后的统计值。所有培养基均添加GA3 011 mg·L - 1。表中字母表示显著水平为 P < 0105。Note: Data were collected after 20 days culture under the lightconditions. A ll the medium s were supp lemented with GA3 at 011 mg·L - 1. Letters in the table indicate significant differences at P < 0105.
213　胚性愈伤组织的诱导及新的假珠芽发生
脱分化的假珠芽在含蔗糖的无植物生长调节剂的 1 /2 MS培养基上可继续愈伤化 , 1个月后形成
疏松的黄白色颗粒状胚性愈伤组织 (图版 Ⅰ, c)。随着培养时间延长 , 胚性愈伤组织不断增殖并逐
渐变绿 , 但只有少数体细胞胚形成正常植株 , 大量的体细胞胚发育成非正常植株 , 其上产生大量不规
则的白色新假珠芽 (图版 Ⅰ, d)。
214　体细胞胚诱导及植株再生
21411　假珠芽胚性愈伤组织的诱导 　新假珠芽在所试的含有 TDZ的培养基上均能产生胚性愈伤组
织 , 培养 7 d后假珠芽表面开始膨大并愈伤化 , 20 d后变成白色胚性愈伤组织 (图版 Ⅰ, e)。当 TDZ
浓度为 10 mg·L - 1时 , 假珠芽的胚性愈伤组织分化率最大 , 为 90% (表 3) , 形态也最好。试验结果表
明 , 最佳的诱导假珠芽产生胚性愈伤组织的培养基为 1 /2 MS + TDZ 10 mg·L - 1 + GA3 011 mg·L - 1。
表 3　TD Z对诱导多花蔷薇的假珠芽产生胚性愈伤组织的影响
Table 3　Effects of d ifferen t TD Z on induction of em bryogen ic
ca lli from pseudobulb ils in Rosa m u ltiflo ra
TDZ/
(mg·L - 1 )
假珠芽数
Number of
p seudobulbils
胚性愈伤组织
Somatic embryogenic calli
数量
Number
分化率 /%
D ifferentiation
010 30 0 0 d
5100 30 9 3010 c
10100 30 27 9010 a
20100 30 21 7010 b
　　注 : 所有数据是暗培养 20 d后的统计值。所有培养基均添加
GA3 011 mg·L - 1。表中字母表示显著水平为 P < 0105。
Note: Data were collected after 20 days culture under the dark
conditions. A ll the medium s were supp lemented with GA3 at 011 mg·
L - 1. Letters in the table indicate significant differences at P < 0105. 表 4　碳源对诱导多花蔷薇胚性愈伤组织产生体细胞胚的影响Table 4　Effects of carbohydra te sources on induction ofsoma tic em bryos from soma tic em bryogen icca lli in Rosa m u ltiflora碳源种类Carbohydratesource 胚性愈伤组织数Number of somaticembryogenic calli 体细胞胚Somatic embryo平均数量Number 诱导率 /%Induction蔗糖 Sucrose 30 215 b 80 ab麦芽糖 Maltose 30 615 a 90 a葡萄糖 Glucose 30 111 b 6617 b　　注 : 所有数据是在光培养下 20 d后的统计值。所有培养基的碳源浓度为 30 g·L - 1. 表中字母表示显著水平为 P < 0105。Note: Data were collected after 20 days culture under the lightcondtitions. The carbohydrate concentration of all the medium is 30 g·L - 1. Letters in the table indicate significant differences at P < 0105.
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
21412　碳源对体细胞胚发生的影响 　假珠芽胚性愈伤组织接种在无植物生长调节剂的培养基上进行
光培养 , 愈伤组织由黄白色逐渐转为绿色 , 培养 20 d后其表面形成大量的体细胞胚 (图版 Ⅰ, f) ,
并出现不同发育阶段的球形胚 (图版 Ⅰ, j)、心形胚 (图版 Ⅰ, k) 和子叶形胚 (图版 Ⅰ, l) , 40 d
左右大量体细胞胚发育成正常植株 (图版 Ⅰ, g) 和少量假珠芽。再生植株在 MS +NAA 012 mg·L - 1
培养基上顺利生根 (图版 1, h) , 生根苗移植于混合基质 (草炭 ∶蛭石 ∶珍珠岩 = 2∶1∶1) 中 , 90%的
生根苗移栽成活 (图版 Ⅰ, i)。试验结果表明 (表 4) , 麦芽糖对体细胞胚的诱导及促进其正常萌发
的效果均优于蔗糖和葡萄糖。在含麦芽糖的培养基上 , 体细胞胚诱导率达最高 , 为 90% , 每块愈伤
组织上发生的体细胞胚数最大 , 达 615个。在含葡萄糖的培养基上 , 体细胞胚发生最差 , 每块胚性愈
伤组织上发生的体细胞胚数为 111个。
图版Ⅰ说明 : 多花蔷薇假珠芽诱导、体细胞胚发生及植株高效再生
a. 从种子子叶愈伤组织 (黑色箭头 ) 上诱导的假珠芽 (白色箭头 , 标尺 = 3 mm) ; b. 假珠芽 (白色箭头 ) 脱分化 (标尺 = 2 mm ) ;
c. 假珠芽脱分化后形成的胚性愈伤组织 (标尺 = 2 mm) ; d. 胚性愈伤组织上产生非正常植株 , 其上产生新的假珠芽 (白色箭头 , 标
尺 = 2 mm) ; e. 新的假珠芽愈伤化形成的胚性愈伤组织 (标尺 = 2 mm ) ; f. 胚性愈伤组织发育的大量的体细胞胚 (标尺 = 5 mm ) ;
g. 正常发育的再生植株 (标尺 = 6 mm) ; h. 长根的再生植株 (标尺 = 20 mm) ; i. 移植的再生植株 (标尺 = 30 mm ) ; j. 球形胚 (箭
头 , 标尺 = 500μm) ; k. 心形胚 (箭头 , 标尺 = 500μm) ; l. 子叶形胚 (箭头 , 标尺 = 500μm)。
Explana tion of pla teⅠ: Pseudobulb ils induction, soma tic em bryogenesis and shoot regenera tion in Rosa m u ltiflora
a. Induction of a p seudobulbil (white arrow) from the calli ( black arrow) of the cotyledon of one mature seed ( bar = 3 mm) ; b. The dedifferenti2
ation of the p seudobulbil ( arrow, bar = 2 mm) ; c. Embryogenic calli formed from the p seudobulbil ( bar = 2 mm) ; d. A new p seudobulbil (white
arrow) formed from one abnormal p lantlet which derived from the embryogenic calli ( bar = 2 mm) ; e. Embryogenic calli was induced from a new
p seudobulbil ( bar = 2 mm) ; f. A number of somatic embryos developed from embryogenic calli ( bar = 5 mm) ; g. Regenerated normal p lants de2
veloped from somatic embryos ( bar = 6 mm) ; h. An rooted regenerated2p lantlet ( bar = 20 mm). i. An acclimated p lant growing in a pot ( bar =
30 mm) ; j. Somatic embryos at the globular stage ( arrow, bar = 500μm) ; k. Somatic embryos at the heart stage ( arrow, bar = 500μm) ; l. So2
matic embryos at the cotyledonary stage ( arrow, bar = 500μm).
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　3期 田传卫等 : 多花蔷薇假珠芽诱导、体细胞胚发生及植株高效再生 　
215　假珠芽的继代与保存
将假珠芽接种于诱导培养基上 , 暗培养 20 d后再转入含麦芽糖无植物生长调节剂的 1 /2 MS培养
基上进行光培养 , 可以继续保持假珠芽的体细胞胚发生能力和新的假珠芽形成能力。本研究采用此方
法 , 将多花蔷薇假珠芽继代了 24次 , 保持了 2年 , 并且从假珠芽的形态和再生能力上看 , 还可继续
保存下去。
216　体细胞胚发生过程的细胞学观察
通过石蜡切片的观察 , 证明了体细胞胚形成于假珠芽表层细胞 (图版 Ⅱ, a) , 表层细胞的细胞
质浓 , 细胞核大 , 并且排列整齐 (图版 Ⅱ, a、b)。表层细胞先愈伤化 , 形成具有强烈分生能力的瘤
状胚性细胞团 , 该细胞团与假珠芽内部的细胞分界明显 (图版 Ⅱ, b) , 继而发育成体细胞胚 (图版
Ⅱ, c)。在同一愈伤组织上 , 体细胞胚胎的发育是不同步的 , 有球形胚 (图版 Ⅱ, d～f) , 心形胚
(图版 Ⅱ, g) 及子叶形胚 (图版 Ⅱ, h)。在含麦芽糖的无植物生长调节剂的培养基上 , 大量体细胞
胚能萌发 , 形成正常小植株 (图版 Ⅱ, i)。
图版Ⅱ说明 : 多花蔷薇假珠芽诱导体细胞胚发生的组织学观察
a. 假珠芽组织结构 (标尺 = 100μm) ; b. 假珠芽表面愈伤化形成的瘤状突起 (标尺 = 50μm) ; c. 假珠芽表面愈伤化形成的体细胞
胚胎 (标尺 = 500μm) ; d. 球形胚 (标尺 = 250μm) ; e. 球形胚下部开始形成胚根 (标尺 = 250μm ) ; f. 带胚根的球形胚 (标尺 =
250μm) ; g. 心形胚 (标尺 = 250μm) ; h. 子叶形胚 (标尺 = 250μm) ; i. 萌发的体细胞胚胎 (标尺 = 1 mm)。
Explana tion of pla te Ⅱ: The h istolog ica l stud ies of soma tic em bryogenesis inducted from pseudobulb ils in Rosa m u ltif lo ra
a. The tissue structure of a p seudobulbil ( bar = 100μm ) ; b. The strumose structure was induced from the ep iderm is tissue of a p seudobulbil
( bar = 50μm) ; c. A number of somatic embryos were induced from a p seudobulbil ( bar = 500μm) ; d. A somatic embryo at the globular stage
( bar = 250μm) ; e. Radicel polarized from one globular somatic embryo ( bar = 250μm) ; f. A somatic embryo with radicel at the globular stage
( bar = 250μm) ; g. A somatic embryo at the heart stage ( bar = 250μm) ; h. A somatic embryo at the cotyledonary stage ( bar = 250μm) ; i. A
somatic embryo at the germ inant stage ( bar = 1 mm).
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3　讨论
假珠芽是由处于 16～32个细胞阶段且极性尚未形成的球形胚发育而来 , 此类结构难以成苗 , 除
偶尔能出苗外 , 无器官分化能力 , 但表皮细胞能进一步分化出胚状体 (Button & Botha, 1975)。山茶
属植物的假珠芽可以生根 , 难以成苗 , 但其分化能力很强 , 用不同生长调节剂诱导 , 假珠芽可产生新
的假珠芽或分化成体细胞胚或形成丛生苗 (赖钟雄和林莉 , 2004)。月季的假珠芽经过诱导愈伤化
后 , 生命力旺盛的愈伤组织可以继代并可再生出植株 (高莉萍和包满珠 , 2005)。本研究发现 , 多花
蔷薇的假珠芽通过诱导可同时产生体细胞胚和新的假珠芽 , 新的假珠芽又可以通过诱导产生体细胞胚
和假珠芽。如此反复 , 在两年内经过继代 24次 , 假珠芽仍具有产生体细胞胚的旺盛能力。这与在柑
橘和山茶属植物上用假珠芽诱导体细胞胚的结果相似。
在多种木本植物的组织培养中 , TDZ浓度常为 0102～4140 mg·L - 1 , 伴随或高于这个浓度范围
时常引起植株的玻璃化 (Huetteman & Preece, 1993) , 但本试验使用的 TDZ浓度高达 10 mg·L - 1也未
出现玻璃化现象 , 说明多花蔷薇的体细胞胚发生对 TDZ浓度有较高的要求和适应性。另外 , 麦芽糖
可以诱导野樱桃 ( P runus avium ) 体细胞胚发生 (Reidiboym2Talleux et al. , 1999) , 但麦芽糖对香樟
体细胞胚的诱导与萌发不如蔗糖有效 (杜丽 等 , 2006)。在本研究中 , 麦芽糖在促进多花蔷薇体细
胞胚的发生与萌发方面比蔗糖和葡萄糖有效 , 这与野樱桃上的研究结果相似 , 而与香樟的研究结果相
悖 , 这反映出不同植物的体细胞胚发生与萌发对碳源的要求不同。
本研究发现 , 用多花蔷薇的假珠芽能不断继代并产生胚性愈伤组织和体细胞胚 , 体细胞胚的成熟
与萌发正常 , 不需任何处理便能形成正常植株。在含麦芽糖的培养基上 , 多花蔷薇愈伤组织的体细胞
胚诱导率高达 90% , 每块胚性愈伤可发生 615个体细胞胚 , 高于香樟 (3109个 ) 和月季 (5125个 )。
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