全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2005, 25( 9): 89~ 93
技术与方法
多花蔷薇总 RNA提取方法*
赵小兰 1, 3 苏晓华 2 赵梁军 1**
( 1中国农业大学观赏园艺与园林系 北京 100094 2中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091)
( 3湖北民族学院生物科学与技术学院 恩施 445000)
摘要 根据总 RNA完整性、纯度和得率筛选出适合多花蔷薇幼嫩根、叶总 RNA的提取方法。结
果表明,以 CTAB /酸酚法提取的扦插苗根系总 RNA、以 LiCl -尿素法提取的扦插苗根、叶总 RNA
以及采用 RNeasy PlantM ini K it试剂盒的改进方法提取的组培苗嫩叶总 RNA电泳有清晰明亮的
28S、18S条带,无降解;其 A260 /A280值为 1. 73~ 2. 04, 表明总 RNA质量好。 RT - PCR结果进
一步证实所提取的总 RNA能够用于分子生物学的各种下游实验。 RNA得率分别为:根系和组培
苗嫩叶 120 - 140Lg /g( fw),扦插苗嫩叶 190 - 230Lg /g( fw) 。CTAB /酸酚法提取的嫩叶总 RNA、
SDS /酸酚法提取的根、叶总 RNA有多糖污染,且有明显降解。Tota l RNA isola tion system (Z5111,
Promega)试剂盒不适合提取多花蔷薇各组织总 RNA。
关键词 多花蔷薇 ( Rosa mu ltiflora ) RNA提取 LiCl -尿素法 CTAB /酸酚法
收稿日期: 2005-04-06 修回日期: 2005-07-08
* 北京市科委/抗逆地被植物的培育 0资助项目 (H 020620110130 ),
国家转基因植物研究与产业化课题 ( J2002-B-004)
** 通讯作者,电子信箱: zhao lj5073@ sina. com. cn
多花蔷薇 (Rosa multiflora thunb. )在我国、日本、美
国等国家被广泛用作月季砧木。研究表明, 其种内蕴
含着丰富的抗性资源 [1, 2]。针对日益蔓延且严重影响
月季生产与应用的月季根癌病, 本研究小组通过对蔷
薇属资源的长期筛选获得了根癌病抗性材料多花蔷薇
无刺 4号 (待发表 )。为深入研究该材料的抗病分子机
理、克隆抗病相关基因, 提取纯度高、完整性好的总
RNA是顺利进行相关研究的前提条件。目前蔷薇属植
物总 RNA提取方法仅有少量报道, 其中以热硼酸 /蛋
白酶 K法提取月季花瓣总 RNA较为成功 [ 3~ 5]。但该
方法提取的多花蔷薇根、叶总 RNA呈黏性、水中溶解
度低,电泳时点样孔中有大量物质残留其中, 不能用于
下一步实验。多花蔷薇根、叶组织中,富含酚类、多糖、
酯类及鞣酸 [6, 7], 因而需要对其总 RNA提取方法进行
优化。本实验以多花蔷薇无刺 4号的幼嫩根、叶为材
料,采用 CTAB /酸酚法、SDS /酸酚法、LiCl-尿素法及常
用的 RNA提取试剂盒提取其总 RNA, 比较研究各种方
法的提取效果后, 提出了适合多花蔷薇根、叶 RNA提
取的有效方法,并通过 RT - PCR验证了总 RNA质量。
1 材料与方法
1. 1 材 料
1. 1. 1 植物材料 ( 1)组培苗培养:选取多花蔷薇无
刺 4号当年生幼嫩茎段的中上部节位取材,每个外植
体一个腋芽。按常规方法进行外植体表面灭菌, 然后
置于 MS+ 6 - BA 0. 70mg /L+ GA30. 04mg /L+ 3%蔗糖
+琼脂 0. 5% ( pH5. 8)的培养基上培养,培养条件为:
温度 25 e ,光照 2 000 lux,光周期 14h /10h,侧芽长 3~
5cm时取嫩叶。 ( 2 )扦插苗培养:取 1年生枝条中上部
带芽 ( 3~ 4个 )茎段作插穗,蛭石、珍珠岩 ( 3: 1混合 )作
扦插基质, 取新生根系和嫩叶为试材。样品于液氮中
速冻后置于 - 80 e冰箱中备用。
1. 1. 2 生化试剂 C lon tech公司的 BD SMARTTM
PCR cDNA Synthesis Kit及 Q iagen的 RNeasy P lan tM in i
Kit购自香港基因有限公司, RNase抑制剂、DNase)、
Pyrobest聚合酶等购自宝生物 (大连 )工程有限公司,其
DOI：10.13523/j.cb.20050919
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 25 No. 9 2005
它试剂均为国产分析纯。
1. 2 方 法
RNA提取试剂的配制与所有器皿处理按萨姆布鲁
克等编著的《分子克隆》有关要求进行。
1. 2. 1 CTAB /酸酚法 主要参考文献 [ 8 ]的方法, 略
有改进。主要操作步骤如下: 在离心管中按 1B5~ 10
的比例加入预热 55e 的提取缓冲液 [ 2% ( w /v)
CTAB, 0. 1mol /L Tris-H3 BO4 ( pH 7. 4 ), 1. 7mol /L
NaC ,l 20 mmol /L EDTA ( pH 8. 0), 1% B - 巯基乙醇 ];
将材料在液氮中充分研磨成均匀的粉末,研磨时加入
2% PVPP;材料转入离心管后充分振荡混匀, 55e 水浴
约 10m in;冰浴冷却后加入 1 /10体积 5mol /L KAc( pH
4. 8)、1 /10体积无水乙醇、1倍体积氯仿, 冰浴振荡
30m in; 4e , 10 000g离心 10 m in,取上清,用氯仿再抽提
一次;上清加入 1 /3倍体积 10mol /L LiC ,l 0. 8倍体积异
丙醇, 4e沉淀过夜; 4e , 10 000g离心 30m in;取沉淀加
DEPC-H2O溶解,酸酚 /氯仿 ( 1B1)、氯仿抽提 2次; 上
清加入 1 /3倍体积 10mol /L LiC l于 -20e 放置过夜;
4e , 15 000 g离心 30m in,收集 RNA沉淀;沉淀用 70%
冷乙醇洗涤 2次, 真空抽干后加入 DEPC-H 2O 充分
溶解。
1. 2. 2 SDS /酸酚法 主要参考文献 [ 9 ]的方法, 略有
改进。提取 液: 0. 2 mol /L Tris-HC l ( pH 9. 0 ),
0. 2mol /L NaC,l 0. 02mol /L EDTA , 4% SDS, 2% B -巯
基乙醇, 2% (W /V ) PVPP。提取步骤:充分研磨的样
品中按 1B5~ 10的比例加入提取缓冲液, 同时加入等
体积的水饱和酚, 65e水浴约 10 m in; 4e , 12 000 g离
心 15m in;上清用酚 /仿、氯仿抽提 3次;取上清加入 1 /3
倍体积 10mol /L LiC l于 4e 沉淀 3~ 4h; 4e 12 000g离
心 15m in;用 70%冷乙醇洗沉淀物, 室温干燥;沉淀物
加入 DEPC-H2O充分溶解。
1. 2. 3 LiC l -尿素法 主要参考文献 [ 10 ]和文献
[11]的方法。提取缓冲液: 0. 1mol /L Tris-H 3BO4 ( pH
9. 0 ), 0. 4mol /L KC ,l 0. 2mol /L sucrose, 1. 4mol /L
NaC ,l 25mmol /L EDTA, 4% SDS, 7mol /L尿素 1. 5%
脱氧胆酸钠, 1. 5% Nonidet-40( NP-40), 2% PVPP,
2% B-巯基乙醇。样品充分研磨后按 1B10的比例加入
提取缓冲液,充分振荡 15 ~ 30m in; 4e 下 12 000r /m in
离心 10m in;上清用酚仿 ( 1B1)、氯仿抽提 2次;上清加
入 1 /4体积无水乙醇、1 /4体积的 8mol /L LiC l 0e 冰浴
20m in; 12 000r /m in, 4e 离心 15m in;上清用氯仿抽提 2
次;上清加入 1 /10体积的 3mol /L NaAc( pH5. 4), 3倍
体积的无水乙醇 - 20e 放置 30 m in; 4e , 12 000g离心
20m in;其余步骤同上。
1. 2. 4 常用 RNA提取试剂盒提取总 RNA ( 1)按照
Qiagen的 RNeasy P lan tM in iKit试剂盒说明书进行,主
要改进方法:磨样 (每次样品 [ 0. 08g)时加入 1% (W /
V) PVPP ;增加每一步的离心时间;最后洗脱步骤增加
为 2次。 ( 2)按照 P romega的 TotalRNA iso lation system
( Z5111)试剂盒说明进行。
1. 2. 5 DNA酶解 所有方法提取的总 RNA均有基因
组 DNA污染,采用如下体系进行 DNA酶解:每 400L l
RNA溶液中加入: RNase Inh ib iter 3L ,l DNase) 5 L ,l 10
@RNase - free DNase buffer 50 L ,l DEPC-H 2O 42L ,l于
37e 水浴 30m in;加入等体积水饱和酚抽提; 4e , 12 000
g离心 20m in; 酚 /仿 ( 1: 1 )、氯仿抽提;上清加入 1 /10
体积的 3mol /L NaAc ( pH 5. 4)、3倍体积的无水乙醇沉
淀;其余步骤同上。
1. 2. 6 总 RNA完整性、得率及纯度检测 取 5L l总
RNA溶液在 1%的甲醛琼脂糖变性胶上电泳, 观察
RNA的完整性;取经 DNA酶解的总 RNA溶液 1L ,l适
当稀释后采用 Beckman公司的 DU800型紫外分光光度
仪测 OD260 /OD280的比值 (以 DEPC-H 2O水为空白 ) 以
检测 RNA样品的纯度并计算得率。
1. 2. 7 RT-PCR 以 CTAB /酸酚法、LiC l -尿素法提取
的根系总 RNA 经 DNA 酶解后反转录合成 cDNA。
cDNA合成按照 C lon tech的 BD SMARTTM PCR cDNA
SynthesisK it说明书进行。以合成的单链 cDNA为模
板,根据抗病基因同源序列设计简并引物扩增抗病基
因同源片段: Sense: 5c-GGIATGGGIGG IGTIGGIAARACN
ACN-3c; An tisense: 5c- ICCIAGIACYTTIAR IGC IAR IGGI
ARWCC-3c[12]。 PCR反应体系为 50L :l cDNA 100ng, 10
@Taq buffer 5. 0L ,l 2. 5mmol /L MgC l2, 200Lmol /L
dNTP, 0. 5 Lmol /L sense /an tisense primer, 2. 5 U
Pyrobest Taq polymerase。 PCR反应条件: 95e 5m in;
95e 1m in, 50e 1m in, 72e 2m in, 30 个循环; 72e
10m in。
2 结果与分析
2. 1 不同方法提取的总 RNA完整性检测
图 1反映了不同提取方法、不同材料来源以及材
料与提取液的不同比例对多花蔷薇无刺 4号提取的总
RNA质量的影响。从图中可以看出,以 LiC l-尿素法提
取的多花蔷薇无刺 4号扦插苗嫩根、嫩叶总 RNA样品
90
2005, 25( 9) 赵小兰 等:多花蔷薇总 RNA提取方法
(泳道 1和 2)、以 Qiagen的 RNeasy Plan tM in iK it试剂
盒提取的组培苗嫩叶总 RNA 样品 (泳道 3 )以及
CTAB /酸酚法提取的扦插苗嫩根总 RNA样品 (泳道 6)
其 28S和 18S条带清晰明亮, 28S条带亮度是 18S条带
的 1. 5~ 2. 0倍, 5S条带浅,表明提取的总 RNA完整
性好。
CTAB /酸酚法提取多花蔷薇无刺 4号扦插苗嫩叶
总 RNA,材料与提取液比例分别为 1B5(泳道 4)和 1B10
(泳道 9),其 18S条带明显比 28S亮,泳道 4边缘发亮、
弥散,为明显的多糖污染, 说明材料与提取液之比越
大,总 RNA降解、多糖污染越严重。以 SDS /酸酚法提
取的多花蔷薇无刺 4号扦插苗嫩叶总 RNA,其 18S与
28S条带的相对亮度差异不大,且在 5S处有浓亮条带,
说明样品发生了部分降解 (泳道 5和 8),该方法不适合
用于多花蔷薇无刺 4号总 RNA提取。
采用 P romega的 TotalRNA isolation system( Z5111)
试剂盒提取扦插苗嫩叶总 RNA时, 沉淀为粉红色, 不
溶于水,把这部分沉淀挑走, 其水溶液电泳则不见核酸
存在 (泳道 7), 说明该试剂盒不适合提取该材料总
RNA。
泳道 10为 CTAB /酸酚法提取的根系总 RNA经
DNA酶解后的电泳图, 比较泳道 6和 10可以发现, 经
过 DNA酶解过程,总 RNA的基因组 DNA污染已经排
除, 28SB18S比值更接近 2B1,且经过再次的酚仿抽提
总 RNA样品的杂质减少。
上述结果表明, LiC l-尿素法可以用于提取多花蔷
薇嫩根和嫩叶总 RNA; CTAB /酸酚法仅能用于提取多
花蔷薇幼嫩根系的总 RNA; Q iagen的 RNeasy P lan tM in i
K it试剂盒可用于提取多花蔷薇组培苗嫩叶总 RNA, 且
DNA污染较少。
2. 2 不同方法提取总 RNA纯度与得率
根据总 RNA电泳结果,取 CTAB /酸酚法提取的扦
插苗嫩根总 RNA、LiCl -尿素法提取的扦插苗根、叶总
RNA以及 RNeasy Plan tM in iK it提取的组培苗嫩叶总
RNA进行 DNA酶解,之后测定 A260、A280及 A260 /
A280比值以检测总 RNA纯度并计算相应的得率,结果
如表 1。
从表 1可见, 3种方法提取的总 RNA 的 A260 /
A280比值在 1. 73~ 2. 04之间,纯度高。但在得率上比
其它材料上报道的要低 [8, 9, 13 ], 可能与总 RNA 经过
图 1 不同提取方法得到的多花蔷薇根、
叶总 RNA琼脂糖凝胶电泳图谱
F ig. 1 E th id ium b rom id e - sta ined 1% agarose
forma ldehyde gel of tota l RNA isola ted from youn g lea f
and root t issues ofRosa mu ltif lora / Inerm is N o40
1: RNA from root t issue of cu ttage p lants with L iC l - Urea protocol
and th e ratio of samp le weigh t and ext raction bu ffer volume was 1: 7
; 2: RNA from leaf tissu e of cuttage p lantsw ith L iC l - U rea protocol
and th e ratio of samp le weigh t and ext raction bu ffer volume was 1: 7
; 3: RNA from leaf tissue of in vi tro cu ltured p lant letsw ith RNeasy
P lan tM in iK it ( Q iagen) ; 4: RNA from leaf tissue of cu ttage p lan ts
w ith CTAB /acid phenol p rotocol and th e rat io of samp le weight and
extract ion bu ffer volume was 1: 5 ; 5: RNA from leaf tissue of
cut tage p lantsw ith SDS /acid pheno lp rotocol and the ratio of samp le
weigh t and extraction bu ffer volume was 1: 5 ; 6: RNA from root
tissu e of cu ttage plan tsw ith CTAB /acid phenol protocoland the ratio
of sample weigh t and extraction buffer volume was 1: 5; 7: RNA
from leaf tissue of cu ttage p lan tswith TotalRNA isolation system K it
( Promega, Z5111) ; 8: RNA from leaf tissue of cu ttage p lantsw ith
SDS /acid phenol protocol and the ratio of samp le weigh t and
extract ion buffer vo lume was 1: 10 ; 9: RNA from leaf tissue of in
vitro cu ltu red p lant letswithCTAB /acid phenolp rotocol and the ratio
of sample weigh t and extraction buffer volume was 1: 10 ; 10: Total
RNA from root tissue e lim in ated DNA con tam ination with DNase
DNA酶解有关。根据 RNeasyP lan tM iniK it说明 , 每
0. 1g材料可获得 20~ 60Lg总 RNA,但在本实验中其总
RNA得率明显低于 LiC l-尿素法。从材料来源分析,其
材料为组培苗幼叶, 含水量高; 而方法上, 其主要应用
的试剂为异硫氰酸胍,依靠单一的试剂来裂解细胞显
然不够彻底,而如果增加 55e 水浴裂解过程,常造成总
RNA降解;又由于多花蔷薇富含多糖及多种次生代谢
物,磨样时不添加 PVPP通常不能得到完整的总 RNA,
而添加之后增加了样品的粘度,影响其后的离心效果,
最终影响其得率。实验也曾使用该试剂盒提取扦插苗
幼叶总 RNA,但极易降解。
91
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 25 No. 9 2005
表 1 不同方法提取多花蔷薇根、叶总 RNA纯度及得率
Tab le 1 Y ie ld and pu r ity of tota l RNA from th e lea f and
root tissu e ofRosa mu ltiflora by va r iou s isola tion p rotocols
方 法 材 料 A260 /A280比值 总 RNA得率
CTAB /酸酚法 根 (扦插苗 ) 1. 73~ 1. 85 115~ 130
LiCl-尿素法 根 (扦插苗 ) 1. 85~ 1. 90 120~ 140
叶 (扦插苗 ) 1. 75~ 2. 00 190~ 230
RNeasy P lantMiniK it 叶 (组培苗 ) 1. 92~ 2. 04 130~ 140
2. 3 RT-PCR扩增抗病基因同源片段
根据目前已经克隆的抗病基因的 2个保守域 P-
loop和 GLPL设计同源引物,其扩增片段应该为 500~
540bp。图 2扩增的片段正好位于 500bp附近,符合文
献中的描述。以 CTAB /酸酚法和 LiC l-尿素法提取的根
系总 RNA均能成功反转录,并能扩增出低丰度的抗病
基因同源片段,说明这两种方法提取的 RNA质量能满
足下一步分子生物学的实验要求。该片段的获得也为
克隆抗病同源基因全长奠定了基础。
图 2 从多花蔷薇根系 cDNA中扩增出的
抗病基因同源片段电泳图
F ig. 2 Aga rose ge l e lectrophoretic ana lysis ofRT-PCR-
amp lified cDNA fragm ent of a d isea se re sistan ce
hom ologu es from the root tissue ofRosa mu ltif lora
/ In erm is N o40
M: DNA marker DL2000; 1: PCR fragmen t amp lified by the
temp late of cDNA and the tota l RNA with CTAB /acid phenol
p rotocolwas u sed to reverse transcript ion reaction; 2: PCR fragmen t
amp lified by the temp late of cDNA and the total RNA w ith LiCl -
U rea p rotocolwas used to reverse transcription reaction
3 讨 论
采用 Q iagen的 RNeasy P lan tM in iKit提取多花蔷
薇总 RNA操作简单、快捷 (只需 1h)且 DNA污染少,但
成本高,仅适合 RNA的少量提取。因而需要提取 RNA
进行 Northern b lotting试验或需要纯化 mRNA进行下一
步试验时该方法并不适合。
Hu等 [8 ]利用 CTAB /酸酚法成功提取了葡萄、苹
果、猕猴桃等果实及叶片的总 RNA。该方法采用在抽
提液中同时加入 1 /10体积的无水乙醇和 1 /10体积的
5mol /L醋酸钾 ( pH4. 8 )并在高浓度 Na+或 K+离子存
在条件下,通过苯酚、氯仿抽提除去部分多糖。该方法
提取的多花蔷薇根系 RNA完整性好,纯度高也充分体
现了其优点。但提取多花蔷薇叶片 RNA时出现明显
降解,这可能与叶片内源 RNase活性高以及该方法有
55e 裂解过程有关, 这一点前人也有过相关报道 [ 14 ]。
此外,整个提取过程需要 2~ 3d时间, 比较费时。而
LiC l-尿素法利用高浓度的尿素和 SDS促使细胞裂解更
为充分;提取液中添加高浓度的中性盐如: KC l、NaC l既
可以促使蛋白质与核酸的分离,也增加了黏多糖在盐
溶液中的溶解; SDS、EDTA、脱氧胆酸钠、NP-40均能有
效抑制 RNase活性。该方法效果稳定, 整个提取过程
只需 3~ 5h, 因而是比较理想的多花蔷薇 RNA提取
方法。
试验表明,材料与提取液的比例 (W /V )必须达到
1B7~ 10。即使提取方法比较成熟,但如果材料与提取
液比例过高,通常会出现不同程度的多糖污染或 RNA
降解。细胞破碎后,内源 RNase释放出来,而提取液中
添加的成分主要起抑制 RNase活性的作用而不是灭活
作用,因而必须保证有足够的抑制剂起作用。
多花蔷薇 RNA提取方法的摸索既为进行下一步
相关研究工作奠定了良好的技术基础, 也为月季等重
要的蔷薇科观赏植物和其它富含多糖及次生代谢物的
植物材料的 RNA提取有很好的借鉴作用。
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RNA Isola tion from Var iou s T issues ofRosa mu ltiflora
ZHAO Xiao- lan1, 3 SU Xiao-hua2 ZHAO Liang- jun1
( 1 Departmen t ofO rnamen ta lH orticu lture and Landscape Archi tecture, Ch ina Agricu ltu ralUn iversity Beijing 100094, Ch ina)
( 2 Forest ry Research Ins titu te, Ch inese Acad emy ofForestry Bei jing 100091, Ch ina)
( 3 Bio logical Science and Technology Schoo,l HuBei Inst itu te forN ationa lities En sh i 445000, Ch ina)
Ab stra ct The isolation procedu re of total RNA from young root and leaf tissue ofRosa multiflora was
optimized according to the integrity, purity and yie ld ofRNA. The electrophoresis pattern showed that the quality
ofRNA isola ted from root tissue of cu ttage p lants with CTAB /acid-phenol protocol and RNA from root and leaf
tissue of cu ttage plants w ith LiCl - U rea protocol and RNA from lea f tissue of in vitro cu ltured p lantlets we re
excellen,t shown by c learly visib le 28S and 18S ribosoma l RNA bands w ith no apparen t degradation and the
A260 /A280 ra tio of the isola ted tota l RNA was 1. 73~ 2. 04. Isolated RNA was intact and had been proven
su itable for fu rthe rmolecular applica tions byRT-PCR resul.t These p rotocols provided us with the yield as 120~
140Lg total RNA /g freshweight of root tissue or in vitro cultu red leaf tissue and 190~ 230L g tota lRNA /g fresh
we ight of leaf tissue of cuttage p lants). By contras,t RNA isolated from leaf tissue with CTAB /acid - phenol
protocol and RNA isola ted from root and leaf tissue w ith SDS / acid - phenol protocol contained polysaccharide
contam ination w ith appa rent degradation. The RNA extraction protocol provided by the kit of total RNA isola tion
system( Z5111, P romega) was unsuitable forRosa mu ltiflora.
K ey word s Rosa mu ltiflora RNA isolation LiCl-U rea protocol CTAB /acid - phenol protocol
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