全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 665 - 670
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 12 - 16; 修回日期 : 2007 - 04 - 16
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30471179) ; ‘948’项目 (200322228B211)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: SHL1606@cau1edu1cn; SHL1606@1631com)
芹菜胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株
韩清霞 , 沈火林 3 , 张振贤
(中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100094)
摘 　要 : 利用芹菜胚性细胞悬浮系成功分离得到大量原生质体 , 获得芹菜大量原生质体的最佳反应体
系为 : 酶液组成为 310%纤维素酶 Onozuka R210、110%离析酶 R210、11%甘露醇、015% CaCl2 ·2H2 O和
011% MES; 摇床转速为 80 r/m in, 温度 (25 ±2) ℃, 酶解时间 5～6 h; 原生质体产量为 25100 ×106 / g, 原
生质体活力 83141%。原生质体浅层培养 , 培养基为 1 /2 MS + 1 mg/L 2, 42D + 015 mg/L KT + 11%甘露
醇 + 500 mg/L水解络蛋白 , 两天后 , 重新再生细胞壁之后进行第 1次分裂 , 逐步降低渗透压至甘露醇 3% ,
大约 30 d形成小细胞团。小愈伤组织经增殖培养后在 1 /2 MS + 500 mg/L CH + 0125 mg/L KT固体分化培养
基诱导出不定芽 , 30 d后再转入 MS基本培养基 , 获得完整的再生植株。
关键词 : 芹菜 ; 悬浮系 ; 原生质体 ; 再生植株
中图分类号 : S 63613　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320665206
Protopla st Isola tion and Plan t Regenera tion from Soma tic Em bryogen ic Cell
Suspen sion of Celery ( A pium graveolens L. )
HAN Q ing2xia, SHEN Huo2lin3 , and ZHANG Zhen2xian
(A gronom y and B iotechnology College, Ch ina A gricu ltural U niversity, B eijing 100094, Ch ina)
Abstract: Protop lasts were successfully isolated from embryogenic suspensions incubating in enzyme so2
lution containing 310% cellulose Onozuka R210, 110% macerozyme R210, 015% CaCl2 ·2H2 O , 011%
MES and 11% mannitol. The enzyme m ixture was shaken (80 r/m in) for 6 h at (25 ±2) ℃. The yield and
viability were 25100 ×106 / g and 83141%. Purified p rotop lasts were cultured in mediem 1 /2 MS + 1 mg/L
2, 42D + 015 mg/L KT + 11% mannitol + 500 mg/L CH initially with shallow liquid layers. Two days later,
cell wall was regenerated and simultaneously intiated the first division, through reducing manntol, m ini2culli
were observed in 30 days. Shoots regenerated in medium 1 /2 MS + 0125 mg/L KT + 500 mg/L CH.
Key words: Celery; Suspension culture; Protop last; Regeneration
原生质体培养、融合和转化已经成为植物细胞改良创造新种质的新途径 , 并已在改变植物遗传性
的应用研究和基础研究中广泛应用。
芹菜的离体培养中 , 大多数研究集中在悬浮培养胚状体合成人工种子方面 (Nadel et al. , 1989,
1990; 闭静秀 等 , 1996) , 虽然也有关于芹菜原生质体培养获得再生株的报道 , 但用的是胚性愈伤组
织提取原生质体 , 没有涉及从胚性细胞悬浮系获得原生质体 , 而且没有对影响原生质体分离、培养的
诸多因素进行详细报道 (宛新杉 等 , 1988)。
虽然田间或温室栽培的叶片也可以用来分离原生质体 , 但因季节限制、环境条件的变化和表面灭
菌等操作原因使得原生质体产量很低 , 且很不稳定。
用胚性细胞悬浮系分离原生质体不但产量和活性高 , 稳定性好 , 而且取材方便 , 试验重复性好 ,
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这使得悬浮系成为分离获得原生质体的重要来源 , 绝大多数伞形科植物原生质体培养获得成功也都归
功于此 (贾敬芬 等 , 1989; 夏光敏 等 , 1991, 1993; 司家钢 等 , 2002) , 而利用胚性细胞悬浮系分
离芹菜原生质体并获得再生植株至今未见报道。
本研究是在建立芹菜胚性细胞悬浮系的基础上 , 从诸多因素探讨其对分离芹菜原生质体的产量和
活力的影响 , 并进行培养获得愈伤组织 , 进而再生完整植株 , 为今后的原生质体融合及遗传转化等打
下基础。
1　材料与方法
111　胚性细胞悬浮系的获得
芹菜 ‘文图拉’种子播于发芽培养基 (MS + 1 mg/L GA3 + 3%蔗糖 + 016%琼脂 ) 上。取生长 30 d
左右的无菌苗下胚轴切段 , 诱导愈伤组织 (MS + 1 mg/L 2, 42D + 1 mg/L KT + 3%蔗糖 + 017%琼脂 )。
愈伤组织经 3～5次继代培养 (MS + 1 mg/L 2, 42D + 015 mg/L BA + 4%甘露醇 + 500 mg/L CH +
3%蔗糖 + 017%琼脂 ) 后 , 选取生长均一、颜色鲜黄、质地疏松、分散性高的胚性愈伤组织进行悬
浮培养。悬浮培养物初始接种量为 1% ～2% , 每隔 7～15 d继代 1次 , 约 4～5次后形成分散性好 ,
均一稳定的胚性细胞悬浮系 (图版 , 1)。悬浮培养基为 MS + 1 mg/L 2, 42D + 015 mg/L BA + 4%甘露
醇 + 500 mg/L水解酪蛋白 , pH 516～518, 培养温度为 ( 25 ±2) ℃, 暗培养 , 摇床转速为 100～120
r/m in。
112　原生质体分离和纯化
芹菜胚性细胞悬浮系在 3 000 r/m in离心 8 m in, 以收集悬浮培养物。以 1∶10 (即 1 g培养物和 10
mL酶液 ) 的比例进行酶解。酶液为 2% ～5%纤维素酶 Onozuka R210, 0～1%离析酶 R210, 011%
MES, 015% CaCL2 ·2H2 O , 11%甘露醇 , pH 517～518。于摇床上 (25 ±2) ℃黑暗条件下振荡 5～10
h (80 r/m in)。
酶解后的原生质体和酶混合液经 250目的尼龙网过滤后以 800 r/m in离心 8 m in沉降原生质体。
向沉降的原生质体中再加入洗涤液和液体培养基各清洗 1次备用。洗涤液为 011% MES, 015%
CaCl2 ·2H2 O , 11%甘露醇 , pH 517～518。
113　原生质体产量和活力的测定
采用血球计数板计算原生质体产量 (每克悬浮物酶解后获得的原生质体数量 ) , 用荧光素双醋酸
酯 ( FDA ) 测定原生质体的活力 (发荧光的原生质体数 /观察的原生质体总数 )。每个样品重复 3次 ,
每重复统计 5个视野 , 取平均值。
114　原生质体培养
将原生质体密度调到 2 ×105 /mL。在 1 /2 MS + 1 mg/L 2, 42D + 015 mg/L KT + 11%甘露醇 + 500
mg/L水解络蛋白培养基中进行液体浅层和固液双层黑暗静置培养。每 5～7 d加入新鲜培养基 , 培养
基的甘露醇浓度依次降低 (11%、6%、3% ) , 葡萄糖浓度依次提高 (2%、4%、6% )。当形成肉眼
可见的细胞团或小颗粒状愈伤组织后 , 转入固体培养基中继代培养 , 进而转入分化培养基。培养过程
中统计细胞第 1次分裂、愈伤组织形成、继代生长和分化再生情况。
2　结果与分析
211　酶种类和浓度对原生质体产量和活力的影响
不同浓度的酶液组成对分离原生质体的产量存在显著差异 (表 1) , 在 210% ～310%浓度范围
内 , 纤维素酶的浓度与悬浮细胞的原生质体产量呈正相关。超过该浓度范围 , 原生质体产量和活力都
会下降。
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纤维素酶浓度为 310%时 , 随着离析酶浓度的升高 , 原生质体的产量逐步升高 , 离析酶浓度为
110%时 , 原生质体产量最高达 25100 ×106 / g, 而且活力达到 83141% ; 随着纤维素酶浓度的提高 ,
产量下降 , 同时在酶解混合液中有大量碎片存在。纤维素酶浓度为 510%时 , 原生质体产量和活力都
下降到最低点 , 分别为 10150 ×106 / g和 55152%。
表 1　纤维素酶和离析酶对分离原生质体的影响
Table 1　The effects of cellula se and maceroym e on protopla sts isola tion
　纤维素酶
　Cellulase ( % )
离析酶
Macerozyme ( % )
产量
Yield ( ×106 / g)
活力
V iability( % )
　210 0 0150 g 100 a
　210 015 1150 ±1100 fg 100 a
　210 110 4100 ±2100 f 89117 ±10110 b
　310 0 12117 ±4104 de 79119 ±4153 c
　310 015 21150 ±2165 b 83102 ±2164 bc
　310 110 25100 ±3100 a 83141 ±2105 bc
　410 015 23133 ±3106 ab 69119 ±2146 d
　410 110 16150 ±3161 c 64161 ±1117 de
　510 015 13117 ±4104 d 60168 ±2102 ef
　510 110 10150 ±3161 e 55152 ±0150 f
　　注 : 3次重复的平均值 ±标准差。
Note: Average ±standard deviation of 3 measurements.
212　酶解时间对原生质体产量和活力的影响
在 (25 ±2) ℃黑暗条件下 , 酶解 2 h后 , 每隔 1～2 h取样镜检 , 测定原生质体的产量和活力。
结果表明 , 酶解 2 h后 , 有少量原生质体释放出来 , 但是个体比较小 , 活力低。4 h后 , 大量原生质
体开始释放 , 6 h原生质体产量达到最高峰 , 10 h后原生质体产量已经下降。
原生质体产量最高峰和活力最高峰几乎是同步的 , 6 h原生质体活力最大 , 随着酶解时间的延
长 , 原生质体的活力不断下降 , 因此要选择适宜的酶解时间。
213　胚性悬浮细胞生长期对原生质体分离的影响
获得大量纯净且生命力强的原生质体 , 其关键就是选择活力旺盛的胚性悬浮系。
悬浮细胞继代时间对原生质体的产量和活力有很大影响。不同培养时间 (2、4、7、10、15 d) 的
悬浮细胞及细胞团在酶液 (310% 纤维素酶 Onozuka R210、110 %离析酶 R210、015% CaCl2 ·2H2O、
011% MES和 11%甘露醇 ) 中 80 r/m in振荡 6 h后 , 分离得到的原生质体产量和活力 (图版 , 2、3) 差
异显著 (表 2)。
悬浮培养 4 d时 , 胚性细胞及细胞团处于对数生长期 , 细胞分裂活动最旺盛 , 分离得到的原生质
体产量最大 , 活力最强 , 分别为 25117 ×105 / g和 90178% , 且原生质体细胞质浓 , 液泡小。
悬浮培养时间过短或过长 (短于 4 d或长于 7 d) , 原生质体产量和活力均下降 , 不适合用来分离
原生质体。
表 2　悬浮细胞生长期对原生质体产量和活力的影响
Table 2　Y ield and v ita lity of em bryogen ic suspen sion2der ived protopla sts a t d ifferen t culture tim e
　培养时间 Culture time ( d) 产量 Yield ( ×105 / g) 活力 V iability ( % )
　 2 11183 ±2186 c 85186 ±2186 a
　 4 25117 ±2152 a 90178 ±1183 a
　 7 16117 ±2152 c 85143 ±2177 a
　10 9183 ±1153 d 64134 ±4192 b
　15 4133 ±2108 e 53103 ±2163 c
　　注 : 3次重复的平均值 ±标准差。
Note: Average ±standard deviation of 3 measurements.
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214　渗透压稳定剂及其浓度对分离原生质体的影响
不同浓度渗透压稳定剂甘露醇、蔗糖和葡萄糖 , 对分离原生质体的产量有明显影响 (图 1)。
培养 4 d左右的悬浮细胞在含 310%纤维素酶 Onozuka R210, 110%离析酶 R210和不同浓度的渗透
压稳定剂 (7% ～15% ) 调节下酶解 , 结果表明 : 在一定范围 (7% ～11% ) 内 , 随着甘露醇浓度的
提高 , 原生质体产量明显上升 , 游离的原生质体圆球型 , 胞质浓 , 内含物丰富 , 但浓度进一步升高 ,
其产量逐渐下降。
与甘露醇相比 , 用蔗糖和葡萄糖作渗透压稳定剂 , 原生质体产量明显低很多 , 不宜选用。
原生质体活力在甘露醇 11% ～13%浓度之间没有显著差别 , 显著高于其它浓度下原生质体的活
力 (图 1)。相对高浓度的甘露醇 , 使细胞维持在高渗状态下 , 导致质壁分离 , 有利于酶解。较高浓
度的甘露醇即较高的渗透压 , 可以阻止原生质体破裂和出芽 , 更有利于保持分离得到的原生质体的完
整性 , 但是易同时抑制原生质体的分裂。
图 1　渗透压稳定剂对原生质体产量和活力的影响
F ig. 1　Effect of osm otic pressure of enzym e solution on y ield and v iab ility of protopla sts
215　原生质体培养及植株再生
纯化后的原生质体分别进行液体浅层培养和固液双层培养。结果表明 , 液体浅层培养效果好
(表 3) , 4～5 d后就观察到细胞第 1次分裂 (图版 , 4 ) , 细胞培养在以葡萄糖为碳源的培养基上 ,
发生第 1次分裂的细胞数 , 显著高于培养在以蔗糖为碳源的培养基上。10 d左右有些细胞开始进行第
2次分裂 (图版 , 5) , 30 d形成小细胞团 (图版 , 6)。5周后统计微克隆的形成率 , 培养在葡萄糖培
养基上的形成率为 26% , 显著高于培养在蔗糖培养基的。
表 3　碳源和培养方式对原生质体分裂增殖的影响
Table 3　Effect of carbohydra te and culture type on protopla st d iv ision
培养方式
Culture type
糖
Sugar
第 1次分裂频率
First division frequency( % )
微克隆形成率
M icroclony frequency( % )
液体浅层培养 L iquid culture 蔗糖 Sucrose 9 ±2 10 ±2
葡萄糖 Glucose 16 ±3 26 ±5
双层培养 L iquid and solid culture 蔗糖 Sucrose 2 ±1 3 ±1
葡萄糖 Glucose 4 ±2 6 ±1
　　注 : 3次重复的平均值 ±标准差。
Note: Average ±standard deviation of 3 measurements.
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采取固液双层培养的原生质体 , 3～5 d后也观察到了细胞的第 1次分裂 , 但是后期的持续分裂能
力差 , 无论以葡萄糖还是以蔗糖为碳源 , 形成的微克隆数都显著低于液体浅层培养方式。
由以上结果得出 , 对芹菜来说 , 液体浅层培养效果好于固液双层培养 , 葡萄糖比蔗糖更利于原生
质体的分裂和增殖。
形成小细胞团后经继代增殖培养成为愈伤组织 (图版 , 7) , 愈伤组织再经增殖培养 2～3次 , 然
后转入 1 /2 MS + 500 mg/L CH + 0125 mg/L KT固体分化培养基诱导出子叶期胚状体 (图版 , 8) , 30 d
后转入 MS培养基中再生出完整植株 (图版 , 9) , 共 56株。
图版说明 : 1. 芹菜的胚性细胞悬浮系 ; 2. 原生质体的释放 (400 ×) ; 3. 原生质体活力鉴定 ; 4. 原生质体第 1次分裂 ( 400 ×) ; 5.
第 2次分裂 (400 ×) ; 6. 培养 30 d后的小细胞团 (400 ×) ; 7. 培养 60 d后的愈伤组织 ; 8. 分化芽 ; 9. 再生植株。
Explana tion of pla tes: 1. Embryogenic cell suspension cultures; 2. Isolated p rotop lasts (400 ×) ; 3. V iability of p rotop lasts by FDA; 4. First
cell division of p rotop lasts after 3 - 7 days of culture (400 ×) ; 5. Second cell division of p rotop lasts after 10 days of culture (400 ×) ; 6. M icro2
colony formed after 30 days of culture (400 ×) ; 7. Calli formed after 60 days; 8. Redifferentiated shoots from p rotop last2derived cultures after 90
days; 9. Protop last2derived p lantlet.
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