全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 111 - 116
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 04 - 13; 修回日期 : 2006 - 07 - 28
基金项目 : 教育部科学技术研究重点项目 (106092) ; 国家 ‘863’计划 ( 2006AA10ZIC9) ; 南京农业大学作物遗传与种质创新
国家重点实验室开放课题 ( ZW2004011) ; 江苏省高技术研究项目 (BG2004311)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl@ njau1edu1cn)
影响白菜游离小孢子培养关键因素分析
耿建峰 1, 2 , 侯喜林 13 , 张晓伟 2 , 蒋武生 2 , 原玉香 2 , 韩永平 2 , 姚秋菊 2 ,
成　妍 1 , 李　英 1
(1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095; 2 河南省农业科学院园艺研究所 , 郑州 450002)
摘 　要 : 对影响白菜游离小孢子培养的关键因素进行分析研究。单因素研究结果表明 : 54个基因型之
间的小孢子胚诱导率差异显著 ; 对供体材料低温处理 , 在 0～5 d范围内小孢子胚诱导率差异不大 , 超过
5 d则明显降低 ; 高温诱导在 12～60 h范围内差异不大 , 超过此范围则小孢子胚诱导率明显降低 ; NLN培
养基中添加生长素 (NAA) 和细胞分裂素 (62BA) 对小孢子胚诱导率影响不大 , 添加的浓度过大时小孢子
胚诱导率反而降低 ; 活性炭的有无和浓度大小对小孢子胚诱导率影响极大。通过基因型、生长素、细胞分
裂素、活性炭 4因素分析表明 : 基因型之间差异显著 , 活性炭不同浓度之间差异显著 ; 基因型与活性炭不
同浓度之间的互作差异显著 ; 其它的 5个一级互作、4个二级互作和 1个三级互作差异均不显著。
关键词 : 白菜 ; 小孢子培养
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120111206
Isola ted M icrospore Culture in B rassica cam pestris ssp. ch inensis
GENG J ian 2feng1, 2 , HOU Xi 2 lin13 , ZHANG Xiao 2wei2 , J IANGW u 2 sheng2 , YUAN Yu 2xiang2 ,
HAN Yong2p ing2 , YAO Q iu2ju2 , CHENG Yan1 , and L I Ying1
(1N ational Key Laboratory of Crop Genetic and Germ plasm Enhancem ent, N anjing Agricultural U niversity, N anjing 210095, China;
2 Institute of Horticulture, Henan Academ y of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China)
Abstract: Several factors affecting isolated m icrospore culture of non2heading Chinese cabbage
(B rassica cam pestris ssp. ch inensis) were studied in experiments. The results from mono2factor experiments
showed that there were significant differences in the frequency of m icrospore2induced embryos among different
genotypes. In the low temperature treatment, no significant differences were found during 0 - 5 days, while
the frequencies were obviously lower when the period was longer than five days. There were no significant
differences in high temperature when the incubation time was within 12 - 60 h, but the frequencies of
m icrospore2induced embryos were much lower over this duration. The addition of auxins (NAA ) and the
cytokinins ( 62BA ) in NLN medium showed no significant effect on the frequencies of m icrospore2induced
embryos, but when the concentration was excessive, the frequencies decreased. The p resence and
concentration of activated charcoal had a great influence on the frequency of m icrospore2induced embryos. Mo2
reover, four2factor analysis of genotype, auxin, cytokinins and activated charcoal concentrations indicated that
there were significant differences among different genotypes and activated charcoal concentrations,
respectively, and also significant differences among these two interactions, while other interactions remained
non2significant.
Key words: B rassica cam pestris ssp. ch inensis; M icrospore culture
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
游离小孢子培养是在单细胞水平上获得纯系的有效方法。在芸薹属作物中 , L ichter (1982) 首次
在甘蓝型油菜上成功进行游离小孢子培养 , 并发现其胚胎诱导率及再生植株产量远高于花药培养。
1989年 , 日本学者 Sato等首次获得大白菜游离小孢子培养的再生植株。我国这方面的研究起步较晚 ,
但进展较快。栗根义等 (1993a, 1993b) 对大白菜游离小孢子培养的相关技术进行了研究 , 建立了
较完善的技术体系 , 并利用该技术育成大白菜、甘蓝、花椰菜系列新品种 (张晓伟 等 , 2001; 耿建
峰 等 , 2001, 2002) ; 曹鸣庆等 (1992) 首次报道不结球白菜游离小孢子培养获得成功 , 卢钢和曹
家树 (2001) 报道白菜和芜菁杂种小孢子培养获得成功。迄今还没有见到对白菜游离小孢子培养技
术进行系统研究的报道。为实现规模化生产双单倍体 (DH) 纯系并构建遗传图谱 , 使小孢子培养方
法能成功应用于育种实践 , 本研究中对影响白菜小孢子培养关键因素进行了单因素和多因素的系统分
析。
1　材料与方法
试材为从市场上和育种单位收集近 100个白菜 (B rassica cam pestris ssp. ch inensis Makino) 品种 ,
经过鉴定选取表现较好的 54个品种 (系 ) 进行试验 , 这些品种遗传基础丰富 , 代表性强 (表 1)。
小孢子的分离与培养方法 : 选取无病害的供体植株花蕾 , 2～3 mm长 , 花瓣、花药比 1 /3～4 /5,
镜检此时小孢子处于单核靠边期 (培养的最佳时期 ) , 用 75%酒精消毒 30 s, 011% HgCl2消毒 5 m in,
无菌水冲洗 3次。将消毒花蕾置于 10 mL试管中 , 加入 Keller213冲洗液 3～5 mL, 用玻璃棒挤破花蕾
散出小孢子 , 将小孢子悬浮液用 400目滤网过滤 , 800 r/m in下离心 3 m in, 沉降小孢子 , 弃上清液 ,
重复 3次。最后加入 NLN213培养液 , 将小孢子悬浮液分装于 60 mm ×15 mm培养皿中 , 每皿 2 mL,
镜检小孢子含量约 1 ×105个 /mL, 用 Parafilm封口。先放置培养箱 33℃暗培养 24 h, 然后转入摇床
(60 r/m in) 上 25℃暗培养 , 25 d以后统计小孢子胚诱导率 (每花蕾出胚数量 )。由于小孢子胚大多
很难培养形成正常的试管苗 , 本研究只统计容易成苗的子叶形胚数量。
单因素试验 : 选择有代表性的 6个基因型 (N16、N19、N20、N29、N30、N35) 分别进行接种
前 4℃低温处理和接种后高温 (33℃) 诱导试验。低温处理时间分别为 0、1、2、3、4、5、6和 7 d;
高温处理时间分别为 0、12、24、36、48、60、72和 84 h。另外选择有代表性的 6个基因型 (N16、
N19、N20、N29、N30、N35) 分别进行培养基添加生长素、细胞分裂素、活性炭试验。生长素浓度
分别为 0、011、012、013、014、015、016、017 和 018 mg/L; 细胞分裂素浓度分别为 0、0103、
0106、0109、0112、0115、0118、0121和 0124 m l/L; 活性炭浓度分别为 0、011、013、015、017、
019、111、113和 115 g/L。
多因素试验 : 分别选取有代表性的 3种基因型 (N20、N30、N35) 和单因素试验中 NAA、62
BA、活性炭各 3种浓度进行 4因素试验。3种培养基添加物各 3种水平 (NAA分别为 011、013和
015 mg/L , 62BA分别为 0101、0103和 0105 mg/L , 活性炭分别为 011、013和 015 g /L ) , 共组成
27种培养基。27种培养基与 3种基因型共组成 81个处理 , 每处理接种 3皿 , 每次间隔 7 d, 3次
重复。
多因素随机试验的观察值 yijklm的线性模型为 : yijklm =μ +A j + Bk + Cl + Dm + (AB ) jk + (AC) jl +
(AD) jm + (BC) kl + (BD ) km + ( CD ) lm + (ABC) jkl + (ABD ) jkm + (ACD ) jlm + (BCD ) klm + (AB2
CD) jklm +εijklm。其中 , μ为总体平均数 , A j、Bk、Cl和 Dm分别表示基因型、生长素、细胞分裂素和活
性炭的主效 , (AB ) jk、 (AC) jl、 (AD ) jm、 (BC) kl、 (BD ) km和 (CD ) lm分别表示主效两因素间互作效
应 , (ABC) jkl、 (ABD) jkm、 (ACD ) jlm和 (BCD ) klm分别表示主效 3因素间互作效应 , (ABCD ) jklm表示
主效 4因素间的互作效应 , εijklm为随机误差。试验结果利用 SAS812软件进行分析。
211
　1期 耿建峰等 : 影响白菜游离小孢子培养关键因素分析 　
表 1　供试白菜及来源
Table 1　 Code and or ig in of tested genotypes
代号
Code
基因型
Genotype
来源
O rigin
代号
Code
基因型
Genotype
来源
O rigin
代号
Code
基因型
Genotype
来源
O rigin
N1 青梗 308 ( F1 ) 日本 N19 寒笑 ( F1 ) 江苏 N37 200321212222 ( F5 ) 江苏
Q inggeng 308 ( F1 ) Japan Hanxiao J iangsu J iangsu
N2 苏州青 江苏 N20 暑绿 ( F1 ) 江苏 N38 200321212328 ( F5 ) 江苏
Suzhouqing J iangsu Shulü( F1 ) J iangsu J iangsu
N3 绿星青菜 ( F1 ) 江苏 N21 绿星 ( F1 ) 江苏 N39 93H秋 22328 ( F3 ) 江苏
Lüxingqingcai( F1 ) J iangsu Lüxing( F1 ) J iangsu J iangsu
N4 绿领上海青 江苏 N22 绿优 1号 ( F1 ) 江苏 N40 20022828212 ( F4 ) 江苏
Lülingshanghaiqing J iangsu Lüyou 1 ( F1 ) J iangsu J iangsu
N5 丰乐上海青 安徽 N23 矮抗 5号 ( F1 ) 江苏 N41 早生金品 21 ( F1 ) 新西兰
Fengleshanghaiqing Anhui A ikang 5 ( F1 ) J iangsu Zaoshengjinp in 21 ( F1 ) New Zealand
N6 矮脚黄 江苏 N24 矮抗 6号 ( F1 ) 江苏 N42 金夏时青梗菜 ( F1 ) 日本
A ijiaohuang J iangsu A ikang 6 ( F1 ) J iangsu J inxiashiqinggengcai( F1 ) Japan
N7 黄心菜 广东 N25 四季中萁 湖北 N43 日本青菜 日本
Huangxincai Guangdong Sijizhongqi Hubei R ibenqingcai Japan
N8 热优 2号 江苏 N26 黑白菜 湖北 N44 青帮油菜 香港
Reyou 2 J iangsu Heibaicai Hubei Q ingbangyoucai Hongkong
N9 超级奶白菜 ( F1 ) 辽宁 N27 黑心乌 湖北 N45 香港油菜 香港
Chaojinaibaicai( F1 ) L iaoning Heixinwu Hubei Xianggangyoucai Hongkong
N10 超级上海青 辽宁 N28 黑叶白菜 广东 N46 精选黄心菜 北京
Chaojishanghaiqing L iaoning Heiyebaicai Guangdong J ingxuanhuangxincai Beijing
N11 四季黄 山东 N29 台湾大头清江白菜 台湾 N47 奶奶芥菜 韩国
Sijihuang Shandong Datouqingjiangbaicai Taiwan Nainaijiecai Korea
N12 日本上海青 ( F1 ) 日本 N30 黄邦 ( F1 ) 辽宁 N48 金光快菜 ( F1 ) 韩国
R ibenshanghaiqing( F1 ) Japan Huangbang( F1 ) L iaoning J inguangkuaicai( F1 ) Korea
N13 新丰青菜 河北 N31 福州山西白 福建 N49 三宝小型白菜 ( F1 ) 韩国
Xinfengqingcai Hebei Fuzhoushanxibai Fujian Sanbaoxiaoxingbaicai ( F1 ) Korea
N14 五月慢 北京 N32 乌塌菜 湖北 N50 抗热青菜 河北
W uyueman Beijing W utacai Hubei Kangreqingcai Hebei
N15 改良奶白菜 ( F1 ) 北京 N33 超群优白菜 福建 N51 夏冬青 上海
Gailiangnaibaicai( F1 ) Beijing Chaoqunyoubaicai Fujian Xiadongqing Shanghai
N16 京绿 2号 ( F1 ) 北京 N34 超群倐白菜 福建 N52 新矮青 上海
J inglü2 ( F1 ) Beijing Chaoqunyoubaicai Fujian Xinaiqing Shanghai
N17 京绿 3号 ( F1 ) 北京 N35 VS240120 ( F1 ) 台湾 N53 港种奶白菜 香港
J inglü3 ( F1 ) Beijing Taiwan Gangzhongnaibaicai Hongkong
N18 京绿 7号 ( F1 ) 北京 N36 2003212121211 ( F5 ) 江苏 N54 港种园叶白菜 香港
J inglü7 ( F1 ) Beijing J iangsu Gangzhongyuanyebaicai Hongkong
2　结果与分析
211　不同基因型对小孢子胚诱导率的影响
供试的 54个基因型中有 37个诱导出胚 , 占 6815%。通过多重比较 , 将其分为高诱导率、中诱
导率、低诱导率和难诱导 4类基因型。其中 , 高诱导率基因型 4个 , 占 714% , 诱导率最高的是 N29,
达到 9212胚 /蕾 ; 中诱导率的 18个 , 占 3313% , 低诱导率的 15个 , 占 2717% , 未诱导出胚的 17个 ,
占 3115% (表 2)。
212　低温处理和高温诱导对小孢子胚诱导率的影响
从图 1可以看出 , 供试花蕾接种前放在 4℃条件下处理 , 对小孢子胚诱导率影响不大 , 处理时间
超过 5 d, 诱导率则明显下降。从图 2可以看出 , 高温诱导对是小孢子诱导出胚的关键因素。不经过
高温诱导 , 所有基因型均未诱导出胚 , 在 12～60 h范围内诱导率差异不大 , 超过此范围则明显降低。
311
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
表 2　不同基因型的小孢子胚诱导率
Table 2　Frequency of m icrospore2induced em bryos from d ifferen t genotypes
基因型代号
Genotype code
胚诱导率
Frequency
基因型代号
Genotype code
胚诱导率
Frequency
基因型代号
Genotype code
胚诱导率
Frequency
基因型代号
Genotype code
胚诱导率
Frequency
N29 9212a N3 2816b N54 719c N13 0d
N31 8113a N32 2711b N53 615c N21 0d
N30 7515a N36 2710b N50 514c N22 0d
N10 7015a N38 2519b N43 514c N23 0d
N35 3517b N37 2416b N34 416c N24 0d
N19 3318b N41 2018b N20 414c N25 0d
N18 3219b N44 1913b N16 411c N26 0d
N42 3116b N49 1910b N15 316c N27 0d
N51 3116b N1 1113c N11 211c N28 0d
N52 3116b N8 1015c N2 0d N45 0d
N17 3019b N33 919c N4 0d N46 0d
N9 2919b N39 918c N5 0d N47 0d
N12 2919b N40 918c N6 0d
N14 2819b N48 817c N7 0d
　　注 : 不同字母表示差异达到显著水平 ( P≤0105) ; 胚诱导率为平均每蕾产生的胚数。Note: The different letters behind the number
indicat significant difference at P≤0105; Frequency rep resents the No. of embryos per bud.
213　NL N培养基中添加不同浓度的生长素 NAA对小孢子胚诱导率的影响
从图 3可以看出 , 培养基中添加不同浓度的生长素 , 不同基因型反应不尽相同。对易诱导基因型
N29、N30在低浓度情况下 ( < 015 mg/L ) 几乎没有影响 , 超过 015 mg/L时 , 诱导率明显下降 ; 中
诱导率基因型和低诱导率基因型则表现有先升后降的趋势 , 在低浓度 ( < 015 mg/L ) 情况下 , 虽有
上升的趋势 , 但幅度较小 , 超过 015 mg/L时 , 诱导率同样明显下降。
214　NL N培养基中添加不同浓度的 62BA或活性炭 ( AC) 对小孢子胚诱导率的影响
培养基中加入不同浓度的 62BA , 所有基因型的诱导率都有降低的趋势 , 在低浓度时降低较小 ,
差异不大 , 超过一定浓度则明显降低 , 不同基因型该极限浓度不尽相同 (图 4)。例如 N29当浓度超
过 0112 mg/L时诱导率开始明显下降 , N30则当超过 0109 mg/L时即开始明显下降。
411
　1期 耿建峰等 : 影响白菜游离小孢子培养关键因素分析 　
　　从图 5可以看出 , 在培养基中添加不同浓度
的活性炭 , 所有基因型的诱导率都明显提高 , 但
浓度高时增加幅度减小或不再增加 , 甚至降低。
215　多因素分析
21511　多因素方差分析 　方差分析结果表明 , 4
个单因素中只有不同基因型间和活性炭不同浓度间
差异极显著 , 2因素间互作只有活性炭和基因型间
互作差异极显著 , 其它的 2因素间互作、3因素间
互作和 4因素间互作差异均不显著。
21512　单因素差异显著多重比较 　不同基因型间 图 5　活性炭对小孢子胚诱导率的影响F ig. 5　Em bryo frequenc ies influenced by d ifferen t AC( activa ted charcoa l) concen tra tion
和活性炭不同浓度间各水平多重比较结果表明 , 基因型之间差异均达到极显著水平 , 即基因型 N30、
N35、N20间差异均达到极显著水平 ; 活性炭各水平间差异也达到极显著水平 , 即处理浓度 015、
013、011 g /L间差异均达到极显著水平。
21513　互作差异显著多重比较 　活性炭水平 3 ( 015 g/L ) 和基因型 2 (N30) 之间的互作与活性炭
水平 2 (013 g/L) 和基因型 2 (N30) 之间互作差异不显著 , 但是这两者与活性炭水平 3 (015 g/L )
和基因型 3 (N35) 之间互作差异极显著 ; 活性炭水平 3 ( 015 g /L ) 和基因型 3 (N35) 的互作与其
余的 6个互作之间差异极显著 , 而这 6个互作之间差异不显著。
3　讨论
游离小孢子培养这一具有重要理论意义和实践价值的生物技术越来越引起科研工作者的重视 , 并
得到广泛的应用 , 但是在应用中还存在着许多理论和实际问题。
第一 , 基因型的差异已被所有研究者在不同作物中所证实 , 但是差异的原因以及怎样克服诱导率
低等问题仍无定论。本研究中的 54个供试基因型小孢子胚诱导率差别极大 , 并明显地被分为 4类 ,
可以推断小孢子胚诱导率的高低是由少数基因控制的 , 张凤兰和高田义人 ( 2001) 通过对甘蓝型油
菜研究发现其小孢子胚诱导率由具有加性效应特点的两个基因位点控制的。笔者通过测定小孢子胚诱
导率高、中、低 3类基因型内源激素水平 (生长素和细胞分裂素 ) 试图发现其差异规律 , 但遗憾的
是不同基因型之间及其在初花、盛花、末花期之间内源激素水平差异均不显著 , 可能内源激素与诱导
率之间并无直接关系。
第二 , 在低温预处理方面 , 本研究发现接种前 4℃预处理花蕾对其小孢子胚诱导率影响差异不大 ,
超过 5 d诱导率反而下降 , 这和 Dunwell等 (1985) 在甘蓝型油菜小孢子培养中得出的结论一致。但是
O solnicd等 (1993) 报道低温 (3～5℃) 处理几天可以明显提高甘蓝型油菜小孢子胚诱导率。
第三 , 在高温诱导方面。本研究发现接种后置于 33℃黑暗条件下诱导 12～60 h差异不大 , 超过
此范围则明显下降 , 这和栗根义等 (1993a) 在大白菜中得到的结论一致。
第四 , 本研究发现在 NLN培养基中添加生长素 (NAA ) 和细胞分裂素 (62BA ) 对小孢子胚诱导
率影响不大 , 浓度过大时反而下降。L ichter (1982) 也报导在大白菜小孢子培养中省去植物生长调节
剂可以提高小孢子胚产量 , 李岩等 (1993) 在白菜中发现在培养基中添加一定浓度的激素有利于小
孢子胚的发生。
第五 , 本研究发现培养基中添加一定浓度的活性炭能明显促进小孢子胚的发生。 Silva ( 1999)
在甘蓝类蔬菜中、郭金英等 (2002) 在白菜中均报道在培养基中加入适量浓度的活性炭有利于小孢
子胚的发生。
第六 , 影响小孢子胚诱导的因素是多方面的 , 而各因素之间又不是相互独立的甚至存在着显著的
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
互作 , 因此通过多因素分析建立一个包括各方面因素的线性模型才能更准确地反映各因素的独立作用
及其互作。
本试验仅选用基因型、生长素、细胞分裂素、活性炭 4因素各 3个水平进行研究 , 结果表明 : 各
因素的单独作用与单因素分析基本一致 , 而且发现活性炭和基因型之间的互作差异显著 , 但多因素分
析表明活性炭不同水平与不同基因型间互作有的差异不显著。显然通过多因素分析 , 可以得到更多更
全面的信息。
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