全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (10) : 1491 - 1496
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 06 - 10; 修回日期 : 2008 - 09 - 20
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2006AA100109)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhaolj5073@ sina1com)
多花蔷薇胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株
陈　颖 , 梁建丽 , 陈晓丽 , 郭艳超 , 田传卫 , 赵梁军 3
(中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100193)
摘 　要 : 利用多花蔷薇 ‘无刺 3号 ’假珠芽诱导的胚性愈伤细胞悬浮系分离得到原生质体 , 并培养获
得再生植株。最佳酶液组成是 210%纤维素酶 , 015%离析酶 , 510 mmol·L - 1 MES, 015 mol·L - 1甘露醇 ,
015% CaCl2 ·2H2O。采用继代 3 d的悬浮细胞系 , 酶解 10 h, 原生质体产量最大 (26167 ×106 ·g- 1 ) , 活
力最高 (92121% )。采用液体浅层培养 , 肌醇比蔗糖更有利于纯化后的原生质体分裂和生长。愈伤组织形
成增殖培养基为 1 /2MS + 110 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 EBR + 10 g·L - 1 Ficoll + 500 mg·L - 1谷氨
酰胺 + 20 mg·L - 1甘氨酸 + 20 mg·L - 1天冬氨酸 , 在 1 /2MS + 10 mg·L - 1 TDZ + 500 mg·L - 1谷氨酰胺
+ 20 mg·L - 1甘氨酸 + 20 mg·L - 1天冬氨酸培养基中分化培养后转入 1 /2MS培养基上获得完整植株。
关键词 : 多花蔷薇 ; 原生质体 ; 细胞悬浮系 ; 植株再生
中图分类号 : S 685112　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2008) 1021491206
Protopla st Isola tion and Plan t Regenera tion from Soma tic Em bryogen ic Cell
Suspen sion Cultures in R osa m u ltif lo ra
CHEN Ying, L IANG J ian2li, CHEN Xiao2li, GUO Yan2chao, TIAN Chuan2wei, and ZHAO L iang2jun3
(A gronom y and B iotechnology College, China A gricultural U niversity, B eijing 100193, China)
Abstract: Protop lasts were successfully isolated from somatic embryogenic cell suspension induced by
p seudobulbils, shoots regeneration were achieved. Enzyme sort and concentration, treatment time and the cul2
ture time of cell suspensions had influence on p rotop lasts isolation. Enzyme solution contained 210% cellu2
lase, 015% macerozyme, 510 mmol·L - 1 MES, 015 mol·L - 1 mannitol, 015% CaCl2 ·2H2 O. Op timum
enzyme treatment time was 10 hours and cell suspensions subcultured for 3 days were adop ted. The yield and
viability were 26167 ×106 ·g- 1 and 92121%. Protop lasts were cultured on shallow liquid layers, where ino2
sitol was better than sucrose for p romoting cells division and growth. Calli induced and p roliferation medium
was 1 /2MS + 110 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 EBR + 10 g·L - 1 Ficoll + 500 mg·L - 1 glutam ine +
20 mg·L - 1 glycine + 20 mg·L - 1 aspartic acid. D ifferentiation medium was 1 /2MS + 10 mg·L - 1 TDZ +
500 mg·L - 1 glutam ine + 20 mg·L - 1 glycine + 20 mg·L - 1 aspartic acid. Shoots regenerated on 1 /2MS
medium.
Key words: Rosa m ultif lora; p rotop last; cell suspension culture; shoot regeneration
原生质体是很理想的遗传转化受体。蔷薇属原生质体再生困难 , 成功的报道很少。Matthews等
(1991) 以蔷薇种间杂种 (R osa persica ×R osa xan th ina) 的根和光叶蔷薇 (R. w ichrua iana) 的无芽茎
段为外植体诱导愈伤组织并悬浮培养 , 从悬浮系分离原生质体并建立了再生体系 ; Kim等 ( 2003)
以杂种月季 (R. hybrida L. ‘Sumpath’) 合子胚胚性愈伤组织进行悬浮培养 , 从悬浮系分离原生质体
并建立了再生体系。但上述报道的原生质体植板率均较低。作者以自主建立的多花蔷薇 ‘无刺 3号 ’
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
假珠芽诱导、体细胞胚发生和植株高效再生的技术体系为基础 (田传卫 等 , 2008) , 通过假珠芽诱
导的胚性细胞悬浮系来分离和培养原生质体 , 为多花蔷薇乃至蔷薇属植物的基因工程改良奠定基础。
1　材料与方法
111　胚性细胞悬浮系的获得
选取多花蔷薇 ‘无刺 3号 ’成熟种子 , 参考田传卫等 ( 2008) 的方法培养初代外植体。将成熟
种子的子叶接种于 1 /2MS + 015 mg·L - 1 2, 42D的培养基上暗培养 30 d, 诱导愈伤组织 , 之后转入
1 /2MS + 10 mg·L - 1 TDZ + 011 mg·L - 1 GA3的培养基上光培养 20 d, 诱导愈伤组织分化。将分化后
的不定芽转入不含植物生长调节剂的 1 /2MS培养基上光培养 20 d, 诱导产生假珠芽。将假珠芽转入
1 /2MS + 015 mg·L - 1 2, 42D的培养基上暗培养 30 d, 使其脱分化成胚性愈伤组织。固体培养基中
均添加 215% Gelrite, pH 518。
选取生长均一、颜色鲜黄、质地疏松的胚性愈伤组织进行悬浮培养。初始接种量为 310% , 每隔
5 d继代 1次 , 约 4～5代后形成分散性好、均一稳定的胚性细胞悬浮系 (图版 , 1)。悬浮培养基为
1 /2MS + 015 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 BA, pH 514。暗培养 , 摇床转速为 100 r·m in - 1。
培养基均加入 3%蔗糖 , 培养温度为 (25 ±2) ℃。
112　原生质体分离和纯化
胚性细胞悬浮系经 1 000 r·m in - 1离心 3 m in, 收集悬浮培养物。培养物和酶液按 1∶10的比例
(质量体积比 ) 进行酶解。酶液为纤维素酶 R210 (Cellulase Onozuka) 和离析酶 R210 (Maceroyme On2
ozuka) , 酶采用酶母液 ( 510 mmol·L - 1 MES, 015 mol·L - 1甘露醇 , 015% CaCl2 ·2H2 O ) 进行溶
解 , pH 517～518。于摇床上 (25 ±2) ℃黑暗条件下振荡 (60 r·m in - 1 )。酶解后的原生质体和酶混
合液经 300目的尼龙网过滤后 , 以 600 r·m in - 1离心 3 m in沉降原生质体。向沉降的原生质体中再加
入洗液 (W5洗液 ) 和液体培养基各清洗 2次备用 , pH 517～518。用于研究酶的种类和浓度、酶解时
间、胚性悬浮细胞生长期对原生质体产量和活力的影响。
酶的种类和浓度 : 选取继代 3 d的悬浮细胞为材料 , 酶液为 : 1%、2%、3%、4%纤维素酶 R210
和 0、015%、1%离析酶 R210。酶解 10 h。
酶解时间 : 选取继代 3 d的悬浮细胞分离原生质体 , 酶液由 210%纤维素酶和 015%离析酶组成 ,
酶解 4～16 h, 每 2 h取样镜检。
胚性悬浮细胞生长期 : 采用继代培养不同时间 (2、3、4、7、10 d) 的胚性细胞悬浮系 , 酶液由
210%纤维素酶和 015%离析酶组成 , 酶解 10 h。
原生质体产量 (每克悬浮物酶解后获得的原生质体数量 ) 采用血球计数板计算 , 原生质体的活
力 (发荧光的原生质体数 /观察的原生质体总数 ) 用荧光素双醋酸酯 ( FDA ) 测定。每个样品重复 3
次 , 每重复统计 5个视野 , 取平均值。
113　原生质体培养
将原生质体密度调到 2 ×105 ·mL - 1 , 黑暗静置条件下 , 以 1 /2MS + 500 mg·L - 1谷氨酰胺 + 20
mg·L - 1甘氨酸 + 20 mg·L - 1天冬氨酸为基本培养基 , 研究植物生长调节剂组合、碳源和培养方式、
Ficoll浓度对原生质体分裂的影响。
植物生长调节剂组合 : 在培养基中加入不同浓度 (015、110、115 mg·L - 1 ) 2, 42D和不同浓度
(0、012、014 mg·L - 1 ) 表油菜素内脂 ( EBR, Sigma) 进行液体浅层培养 , 碳源采用 6%肌醇。计
算第 1次分裂率和植板率。
碳源和培养方式 : 在最适植物生长调节剂组合 (110 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 EBR) 的基
础上 , 进行固体培养 (琼脂糖 112% ) 和液体浅层培养 , 并对比肌醇和蔗糖两种碳源。计算第 1次分
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　10期 陈 　颖等 : 多花蔷薇胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株 　
裂率和植板率。
Ficoll浓度 : 在最适植物生长调节剂组合 (110 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 EBR) 的基础上 ,
以 6%肌醇为碳源的液体浅层培养中加入不同浓度 ( 0、5、10、15、20 g·L - 1 ) 的 Ficoll ( Sigma)。
计算第 1次分裂率和植板率。
液体浅层培养每 5～7 d加入新鲜培养基 , 培养基的蔗糖和肌醇浓度依次降低 (6%、4%、3% )。
当形成肉眼可见的细胞团或小颗粒状愈伤组织后 , 转入 1 /2MS + 10 mg·L - 1 TDZ + 500 mg·
L - 1谷氨酰胺 + 20 mg·L - 1甘氨酸 + 20 mg·L - 1天冬氨酸 + 3%蔗糖的固体分化培养基进行暗培养 ,
形成不定芽后转接到无植物生长调节剂的 1 /2MS + 3%麦芽糖培养基上进行光照培养。培养过程中统
计愈伤组织形成和分化再生情况。
将长至 2～3 cm的再生苗移至添加 1 /2MS + 012 mg·L - 1 NAA + 3%蔗糖培养基上进行生根培养 ,
炼苗后移栽于泥炭、蛭石和珍珠岩比例为 2∶1∶1的基质中。
研究中所采用的培养温度为 (25 ±2) ℃。pH为 517～518。光强为 25μmol·m - 2 ·s- 1 , 光周期
为 16 h光 /8 h暗。愈伤组织分化、伸长及再生苗生根培养基中均添加 215% Gelrite。
2　结果与分析
211　酶的种类和浓度对原生质体产量和活力的影响
不同浓度酶液的组成对分离原生质体产量的影响存在显著差异 (表 1)。在 110% ～210%浓度范
围内 , 纤维素酶浓度与悬浮细胞的原生质体产量呈正相关 , 超过该浓度范围 , 原生质体产量和活力均
下降。这可能是高浓度酶液造成细胞质膜缺损 , 或导致原生质体破裂所引起的。
纤维素酶浓度为 110%时 , 随着离析酶浓度的升高 , 原生质体的产量和活力逐步升高 , 纤维素酶浓
度为 210% ～410% , 随着离析酶浓度的提高 , 原生质体的产量和活力先升高后下降 , 当纤维素酶浓
度为 210% , 离析酶浓度为 015%时 , 原生质体产量和活力最高 , 分别达到 26116 ×106 ·g- 1和
92103%。
表 1　纤维素酶和离析酶对分离原生质体的影响
Table 1　The effects of ellulose and maceroym e on protopla sts isola tion
纤维素酶 /%
Cellulase
离析酶 /%
Macerozyme
产量 / ×106 ·g - 1
Yield
活力 /%
V itality
110 0 0113 ±0102 j 63146 ±2186 d
110 015 0151 ±0103 gij 63102 ±0152 d
110 110 0165 ±0103 i 65158 ±1126 d
210 0 6123 ±0109 d 71195 ±1156 c
210 015 26116 ±0155 a 92103 ±1156 a
210 110 12161 ±0163 b 72178 ±0160 bc
310 0 4128 ±0117 e 63125 ±0196 d
310 015 9195 ±0103 c 74199 ±1156 b
310 110 6128 ±0116 d 64139 ±1118 d
410 0 1160 ±0107 h 52194 ±1154 e
410 015 3123 ±0111 f 64168 ±2156 d
410 110 2126 ±0104 g 54129 ±1110 e
　　注 : 所有数据是 3次重复的平均值 , 同列不同字母表示显著水平α = 0105。下同。
Note: Data were average of three measurements, different letters in the same column indicate level of significantα = 0105. The same below.
212　酶解时间对原生质体产量和活力的影响
酶解 4 h后 , 每 2 h取样镜检 , 测定原生质体的产量和活力如表 2所示。酶解 4 h后 , 原生质体
产量和活力很低 , 只观察到少量原生质体。酶解 10 h原生质体产量和活力达到最高峰。随着酶解时
间进一步延长 , 原生质体产量和活力显著下降 , 并在混合液中可以观察到大量细胞碎片。
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表 2　酶解时间对原生质体分离的影响
Table 2　The effect of enzym e tim e on protopla sts isola tion
酶解时间 / h
Enzyme time
产量 / ×106 ·g - 1
Yield
活力 /%
V itality
4 2130 ±0106 f 3129 ±0106 e
6 6143 ±0131 e 4132 ±0109 de
8 16170 ±0124 b 63187 ±0154 b
10 26146 ±0111 a 92131 ±0197 a
12 14143 ±0112 c 62178 ±0175 b
14 7133 ±0110 d 25133 ±0170 c
16 2121 ±0113 f 5137 ±0109 d 表 3　悬浮细胞系生长期对原生质体分离的影响Table 3　The effect of cell suspen sion s a t d ifferen tculture tim e on protopla sts isola tion培养时间/ dCulture time 产量 /×106 ·g - 1Yield 活力 /%V itality2 6127 ±0106 d 52195 ±0153 d3 26167 ±0112 a 92121 ±0128 a4 17167 ±0167 b 68116 ±0133 b7 8143 ±0115 c 64190 ±0113 c10 4137 ±0113 e 42172 ±0196 e
213　胚性悬浮细胞生长期对原生质体产量和活力的影响
悬浮细胞继代时间对原生质体的产量和活力有很大影响。不同培养时间 (2、3、4、7、10 d) 的
悬浮细胞及细胞团分离得到的原生质体产量和活力差异显著 (表 3)。悬浮培养 3 d时 , 细胞分裂活
动最旺盛 , 分离得到的原生质体产量最高 , 活力最强 , 且原生质体细胞质浓 , 液泡小。
214　原生质体培养及植株再生
　　由表 4可知 , 在 EBR浓度一定的情况下 , 随
着 2, 42D浓度的提高 , 原生质体第 1次分裂率和
植板率先上升后下降 ; 在 2, 42D浓度一定的情况
下 , 随着 EBR的浓度的提高 , 原生质体分裂也呈
现先上升后下降的趋势。多花蔷薇原生质体培养
最适植物生长调节剂组合为 110 mg·L - 1 2, 42D
+ 012 mg·L - 1 EBR。
在最适植物生长调节剂组合的基础上 , 比较
不同培养方式和碳源对原生质体分裂增殖的影响。
由表 5可以看出 , 多花蔷薇原生质体更适合采用
液体浅层培养 , 可能是因为液体浅层培养比固体
培养透气性好 , 对原生质体的伤害小。碳源方面 ,
表 4　植物生长物质组合对原生质体分裂增殖的影响
Table 4　The effect of plan t growth substances com b ina tion
on protopla sts d iv ision and propaga tion
2, 42D /
(mg·L - 1 )
EBR /
(mg·L - 1 )
第 1次分裂频率 /%
First division
frequency
植板率 /%
Planting
efficiency
015 0 0107 ±0102 i 0104 ±0101 h
015 012 3128 ±0101 e 0126 ±0101 d
015 014 1149 ±0102 g 0113 ±0101 e
110 0 1123 ±0102 h 0108 ±0101 f
110 012 8136 ±0102 a 0161 ±0101 a
110 014 5135 ±0103 c 0137 ±0101 b
115 0 2136 ±0101 f 0105 ±0101 g
115 012 8127 ±0102 b 0132 ±0101 c
115 014 5125 ±0102 d 0113 ±0101 e
肌醇比蔗糖更有利于纯化后原生质体分裂和生长。
Ficoll是蔗糖的多聚物 , 在培养基中添加 Ficoll, 可以在不影响渗透压变化的前提下提高培养基通
透性。试验结果 (表 6) 表明 , 加入 Ficoll可以促进多花蔷薇原生质体的分裂和进一步生长发育。随
着 Ficoll浓度的增加 , 第 1次分裂频率和植板率也相应的增加 , 在 Ficoll浓度为 10 g·L - 1时 , 第 1次
分裂频率和植板率分别达到了 10133%和 0192%。 Ficoll浓度继续提高 , 不会显著促进原生质体的分
裂和生长 , 因此多花蔷薇原生质体培养中添加 Ficoll的最适浓度为 10 g·L - 1。
表 5　碳源和培养方式对原生质体分裂增殖的影响
Table 5　The effect of carbonhydra te and culture type
on protopla st d iv ision and propaga tion
培养方式
Culture type
碳源
Carbon2
hydrate
第 1次分裂频率
/% First division
frequency
植板率 /%
Planting
efficiency
固体培养 蔗糖 Sucrose 2135 ±0106 d 0112 ±0115 c
Solid culture 肌醇 Inositol 3147 ±0123 c 0116 ±0101 c
液体浅层培养 蔗糖 Sucrose 6180 ±0104 b 0139 ±0101 b
L iquid culture 肌醇 Inositol 8140 ±0108 a 0163 ±0101 a 表 6　F icoll浓度对原生质体分裂增殖的影响Table 6　The effect of F icoll concen tra tion onprotopla st d iv ision and propaga tionFicoll /( g·L - 1 ) 第 1次分裂频率 /%First division frequency 植板率 /%Planting efficiency0 8136 ±0102 c 0162 ±0101 c5 8183 ±0107 b 0176 ±0102 b10 10133 ±0102 a 0192 ±0102 a15 10137 ±0102 a 0194 ±0102 a20 10141 ±0102 a 0194 ±0102 a
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　10期 陈 　颖等 : 多花蔷薇胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株 　
　　培养 2～5 d后可观察到细胞第 1次分裂 (图版 , 2) , 10 d左右开始进行第 2次分裂 (图版 , 3) ,
40 d形成小细胞团 (图版 , 4)。
当小细胞团直径为 2～3 mm时 (图版 , 5) , 转入 1 /2MS + 10 mg·L - 1 TDZ + 500 mg·L - 1谷氨
酰胺 + 20 mg·L - 1甘氨酸 + 20 mg·L - 1天冬氨酸 + 3%蔗糖固体分化培养基诱导出不定芽 (图版 ,
6) , 分化率为 10131% , 25 d后转入 1 /2MS + 3%麦芽糖培养基中再生出完整植株 (图版 , 7)。将长
至 2～3 cm的再生苗移至添加 1 /2MS + 012 mg·L - 1 NAA + 3%蔗糖培养基上 , 炼苗后移栽于泥炭、
蛭石和珍珠岩 (2∶1∶1) 的基质中 , 移栽成活率达 80% (图版 , 8)。
图版说明 : 1. 胚性细胞悬浮系 ; 2. 原生质体第 1次分裂 ; 3. 原生质体第 2次分裂 ; 4. 培养 40 d后的细胞团 ; 5. 培养 60 d后的愈
伤组织 ; 6. 分化芽 ; 7. 培养基中的再生植株 ; 8. 移栽成活的再生植株。
Explana tion of pla tes: 1. Embryogenic cell suspension; 2. First cell division of p rotop lasts; 3. Second cell division of p rotop lasts; 4. Colony
formed after 40 days of culture; 5. Calli formed after 60 days of culture; 6. Redifferentiated shoots; 7. Protop last2derived p lantlets on medium;
8. Regeneration p lant after trantsp lanted.
3　讨论
本研究中建立的多花蔷薇原生质体再生体系的植板率高达 0194% , 与前人报道的 01017% (Mat2
thews et al. , 1991; Kim et al. , 2003) 差异极为明显。其原因可能是蔷薇属不同种的原生质体再生难
易程度不同 , 或者是由于基本培养基以及培养基中生长素种类的差异所致。
油菜素内酯是一种甾类物质 , 有促进细胞伸长和分裂 , 促进光合作用 , 延迟衰老等作用 , 同时可
以促进矮牵牛 ( Petun ia hybrida) 和大白菜 (B rassica ch inesis) 叶肉原生质体的分裂和增殖 (Nakajima
et al. , 1996; Oh & Clouse, 1998) , 被认为是第六大植物激素 (顾庆龙 , 2002)。表油菜素内酯是一种
人工合成的油菜素内酯拟似物 , 它可促使拟南芥愈伤组织增殖和愈伤组织转绿 (陈季楚 等 , 1996) ,
但在原生质体培养方面尚未见报道。本试验中发现 , 表油菜素内酯可促进多花蔷薇原生质体的分裂 ,
为拓展表油菜素内酯应用领域提供了参考。
在已有的报道中 , 研究者多将 Ficoll配制成阶梯溶液 , 用于密度梯度离心法来分离纯化原生质体
(吴旺泽 等 , 2004) , 但在原生质体培养基中应用得较少。本研究在培养基中加入适量 Ficoll (10 g·
L - 1 ) , 能显著提高多花蔷薇原生质体分裂和植板率 , 这与在甘蓝型油菜 (B rassica napus) 原生质体
培养中得到的结果 ( Simmonds et al. , 1991) 相一致。这可能是由于 Ficoll是蔗糖的多聚物 , 它不影
响渗透压变化而提高培养基的通透性 , 改善了液体培养基的微环境。
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本研究中建立了一套多花蔷薇原生质体再生的技术体系 , 再生频率较高 , 可用于多花蔷薇的细胞
工程育种和基因工程育种 , 也为蔷薇属植物的细胞生物学研究和细胞分子育种提供了参考。
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《中国作物及其野生近缘植物·花卉卷》
《中国作物及其野生近缘植物 ·花卉卷 》属 《中国作物及其野生近缘植物 》系列 , 由费砚良 , 刘青林 , 葛红主
编 , 全国 14家单位多位专家编写。概述了花卉的定义、我国和世界花卉业的现状、花卉的多样性和我国花卉种质资
源的特点 , 并从观赏价值与栽培概况、形态特征与生物学特性、栽培起源与品种演变、性状遗传、品种分类、野生近
缘种等方面详细介绍了梅花、牡丹、菊花、兰花、月季、杜鹃花等重点花卉 20种 (类 ) , 和一、二年生花卉、多年生
花卉、球根花卉、观赏蕨类、多浆植物、兰科花卉、木本花卉等一般花卉 60种 (类 ) , 涉及 80属 1 065种。围绕物种
多样性和遗传多样性 , 详细论述了种质资源研究的最新进展 , 尤其是现代分子生物学和生物技术的应用 ; 同时突出起
源、演变和性状遗传 , 以求拓宽基因资源、指导育种实践。附录中收录了中国观赏植物及野生近缘植物 5 600余种 ,
包括学名 (含定名人 )、生活型和用途等 , 是迄今国内较全面、权威的著作。
　　本卷共 28章 , 约 120万字 , 内容丰富 , 图文并茂。可供花卉种质资源、遗传育种和繁殖栽培有关的科研、
教学和生产工作者参考 , 也可作为研究生的教学参考书。本书由中国农业出版社出版。
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