全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (4) : 487 - 492
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 12 - 27; 修回日期 : 2008 - 02 - 27
基金项目 : 山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目 (01DS48)3 E2mail: qingrongsun@hotmail1com; sunqr@ sdip1cn
梨韧皮部特异表达启动子 At SUC2驱动下的 GUS
基因的转化和表达
孙清荣 13 , 孙洪雁 1 , 赵　衍 2 , 茹斯·海门得 2 , 罗伯特·戴维斯 2
(1 山东省果树研究所 , 山东泰安 271000; 2 美国农业部百思维尔农业研究中心 , 植物分子病理实验室 , 马里兰 20705,
美国 )
摘 　要 : 以 ‘O ld Home’梨无菌苗叶片为外植体 , 利用根癌农杆菌介导将专一在韧皮部表达启动子
A tSUC2驱动下的 GUS基因转入 ‘O ld Home’中。筛选出了 ‘O ld Home’梨叶片高效遗传转化的最佳条件 :
农杆菌和外植体在液体培养基上共培比在固体培养基上共培转化率提高 5倍。PCR分析和 Southern杂交鉴
定表明 GUS基因已整合到转基因植株的基因组中 , 组织化学检测和 W estern杂交鉴定证明了 GUS基因在转
基因植株韧皮部中的表达。
关键词 : 梨 ; 启动子 ; 韧皮部特异表达 ; 基因转化
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0420487206
Tran sgene Expression in Pear ( Pyrus comm un is L . ) D r iven by Phloe m 2
spec if ic Prom oter A tSUC2
SUN Q ing2rong13 , SUN Hong2yan1 , ZHAO Yan2 , Rosemarie Hammond2 , and Robert E. Davis2
( 1 Shandong Institu te of Pom ology, Taipian, Shandong 271000, Ch ina; 2M olecu lar Plan t Pathology L aboratory, USDA 2A griculture
R esearch Service, B eltsville, MD 20705, U1S1A. )
Abstract: Leaves of‘O ld Home’pear ( Pyrus comm unis L. ) in vitro were selected as exp lants. GUS
(β2glucuronidase) reporter gene ( u idA) under the control of the A rabidopsis sucrose2H + symporter gene (A t2
SUC2) p romoter which is phloem2specific was introduced into‘O ld Home’by Ag robacterium tum efaciens.
Op timal conditionswere established for efficient transformation from leaf exp lants of‘O ld Home’. H igh trans2
formation efficiency was achieved by an imp roved induction stage following initial A grobacterium infection. In
the induction stage, A grobacterium cells and parent leaf exp lantswere co2cultivated on a liquid induction medi2
um, which yielded a five2fold increase of transformation frequency over conventional co2cultivation on a solid
medium. The integration was checked by PCR and Southern hybridization. The exp ression of u idA gene was
analyzed by GUS histochem ical detection and W estern2B lot analysis.
Key words: pear; p romoter; phloem2specific exp ression; transgene
梨树易感梨衰退病 ( Garcia2Chapa et al. , 2003)。该病害由专门寄生于韧皮部薄壁细胞的植原体
细菌引起 , 主要发生在欧洲和北美 , 造成梨树大量死亡 , 在我国被列为检疫性病害。
控制梨衰退病的发生比较困难 , 目前没有有效的治疗方法并且缺少抗或耐植原体病的梨品种。人
工工程化抗性基因的出现为植物疾病的控制提供了新的途径。
为了进行抗植原体病的基因工程改良 , 确定在韧皮部表达的启动子是非常需要的。
拟南芥蔗糖 - H + A tSUC2基因专一在光合成叶片的韧皮部伴胞中表达 ( Stadler & Sauer, 1996;
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Stadler et al. , 2005)。A tSUC2基因的启动子活性已在转基因的拟南芥、烟草及草莓中得到了证明
( Truem it & Sauer, 1995; Im lau et al. , 1999; Zhao et al. , 2004)。A tSUC2启动子和 GFP融合研究表
明在伴胞中产生的 GFP蛋白可以通过胞间连丝进入相邻的筛管分子并在韧皮部内迁移 ( Im lau et al. ,
1999)。但是针对梨衰退植原体病开展基因工程研究国内外还未见报道。
本研究旨在建立梨有效的转化和再生体系 , 并证明专一韧皮部表达启动子 A tSUC2能指导 GUS基
因在梨转化植株中的韧皮部中表达 , 为进行梨抗植原体病基因工程育种奠定基础。
1　材料与方法
111　植物材料
‘O ld Home’梨 ( Pyrus comm unis L. ) 无菌苗从美国俄勒冈 Corvallis国家种质资源库获得。无菌
苗在 MM培养基 (MS + BA 110 mg·L - 1 + IBA 012 mg·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 ) 上保存和增殖。
112　质粒载体
以质粒 pB I121为骨架 , 用专一韧皮部表达启动子 A tSUC2替代 CaMV35S启动子启动下游 GUS报
告基因 u idA , 构建成的质粒命名为 pB ISPG, 新霉素磷酸转移酶编码基因 ( nptⅡ) 为植物转化细胞提
供抗卡那霉素 ( Km) 抗性。
质粒 pB ISPG的 T2DNA结构如图 1。
图 1　质粒 pB ISPG的 T2D NA结构图
F ig. 1　D iagram of T2D NA reg ion of pB ISPG
113　菌株培养
表达载体质粒的菌株为 EHA105。将菌株接种于含 50 mg·L - 1 Km的 5 mL LBg (LB培养基附加
015%葡萄糖 ) 培养液中 , 28 ℃振荡培养过夜 , 然后转接到 50 mL含 50 mg·L - 1 Km的 LBg培养液
中 , 在同样条件下培养至 OD600 = 016～018。菌液离心 , 沉淀用不定梢诱导培养基 IM (NN69 + TDZ
4 mg·L - 1 + NAA 013 mg·L - 1 +乙酰丁香酮 20μmol·L - 1 ) 悬浮 , 使其 OD600 = 016, 用于侵染转
化。
114　转化和转基因植株再生
垂直于叶片中脉预切伤的叶片外植体放入菌液中浸染 30 m in。取出叶外植体 , 转入两种培养基共
培 : (1) 固体培养基 IM , (2) 铺有一层滤纸的液体培养基 IM , 共培养 3 d, 分别接种 30～45个外植
体 , 重复 2次 ; 转入预培养培养基 : IM +头孢噻肟钠 ( cef) 100 mg·L - 1 +羧苄西林 ( carb) 100
mg·L - 1 , 培养 3 d; 转入筛选培养基 : 预培养培养基 + Km 25 mg·L - 1 , 每周继代 1次 , 继代培养 6
周产生抗性不定芽。
不定芽转入附加 Km 25 mg·L - 1的 MM培养基上增殖并进一步进行抗性选择 , 淘汰白化梢 , 保留
绿梢。每个存活的绿梢单独编号 , 记做 1个转基因株系。根据产生 Km抗性绿色不定芽叶片数占接种
总叶片数的百分数来计算转化率。
转基因植株生长高度达 1 cm以上时转入含 Km 10 mg·L - 1的生根培养基上进行诱导生根。试验
重复 2次。
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　4期 孙清荣等 : 梨韧皮部特异表达启动子 A tSUC2驱动下的 GUS基因的转化和表达 　
115　转基因株系的分子鉴定
用改良 CTAB法从转基因株系和非转基因对照的新鲜无菌苗组织中提取总 DNA ( Tel2Zur et al. ,
1999)。用 GUS特定的引物 GUS F 5′2caacgaactgaactggcaga23′和 GUS R 5′2tttttgtcacgcgctatcag23′进行 PCR
扩增。
反应体积 50μL, 反应条件 : 94 ℃ 8 m in, 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 35次循环 ; 72 ℃
10 m in。
Southern杂交分析 : 从 PCR阳性株系和非转基因植株取大约 10μg的基因组 DNA 用 X baⅠ酶切 ,
在 1%的琼脂糖凝胶上分离 , 将 DNA转移到带正电荷的尼龙膜上 , 用 D IG标记的 GUS基因片段作为
探针。
用抗 D IG碱性磷酸酶结合 Fab片段及其底物 CDP2star的化学发光法检测杂交信号。
116　GU S基因表达的 W estern2Blot分析
参照 Mohamed等 (2004) 的方法从两个代表性的转基因植株及非转基因植株的根和绿苗中提取
总蛋白。
取 10μg总蛋白在 10% ～20% Novex Tris2Glycine胶 ( invitrogen life technologies) 上电泳 , 电泳后
把蛋白转移到 PVDF膜。多克隆抗体抗β -葡糖苷酸酶兔 IgG用做第 1抗体 , 抗兔 IgG ( Fc) AP (p ro2
mega) 做第 2抗体。
杂交信号检测同上述 Southern杂交。
117　GU S基因表达的组织化学分析
参照 Jefferson (1987) 的 GUS染色法对转基因株系不同部位的 GUS基因表达活性进行分析。
2　结果与分析
211　共培养方法对转化频率的影响
结果表明 , 共培养方法明显影响转化率 , 液体共培养比固体共培养产生更多的 Km抗性转化绿
梢 , 平均转化率 (5218% ) 是固体培养基 (915% ) 的 5倍。
212　转基因株系的 PCR分析和 Southern2Blot检测
共获得 Km抗性转化绿梢 62个 , PCR分析了 40个转化梢 , 都扩增出了预期的目的片段 0183 kb,
但未转化的对照没检测到扩增片段。
图 2是几个代表转化梢的 PCR。
图 2　转基因株系 PCR检测
M: 1 kb DNA分子量标准 ; CK: 未转基因对照 ; 1～11: 转基因株系。
F ig. 2　PCR ana lysis of represen ta tive puta tive tran sgen ic lines
M: 1 kb DNA marker; CK: Non2transgenic control;
1 - 11: Putative transgenic lines.
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Southern2B lot检测 T2DNA插入植物染色体组的数量和位点 , 3个 PCR阳性植株都有杂交信号 , 都
只插入了一个拷贝 , 但插入的位点不同 , 而未转化植株没有任何杂交信号 (图 3)。
图 3　转基因株系 Southern杂交
M: D IG标记的分子量 ; CK: 未转基因对照 ; 1～3: 转基因株系。
F ig. 3　Southern2Blot of represen ta tive puta tive tran sgen ic lines
M: D IG2labeled DNA marker; CK: Non2transgenic control;
1 - 3: Rep resentative transgenic lines.
213　专一韧皮部表达启动子 A tSUC2启动下 GU S基因的表达
A tSUC2启动下的 GUS基因在转基因植株的叶、茎和根的不同组织中都表现很强的活性 (图 4,
A、B、C) , 但在嫩梢顶部的分生组织、侧芽分生组织及根尖组织中未检测到 GUS活性。这与报道的
A tSUC2启动的报告基因的表达仅限于源组织的韧皮部的结果 ( Zhao et al. , 2004) 一致。
图 4　GUS基因在转基因植株和未转基因对照植株中表达的组织化学分析
A, B, C: 转基因植株 , A: 叶 ; B: 茎 ; C: 根 ;
D, E: 未转基因对照 , D: 叶 ; E: 根。
F ig. 4　H istochem ica l ana lysis of GU S expression in tran sgen ic and non2tran sgen ic plan ts
A, B, C: Transgenic p lants, A: Leaf; B: Stem; C: Root.
D, E: Non2transgenic control, D: Leaf; E: Root.
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　4期 孙清荣等 : 梨韧皮部特异表达启动子 A tSUC2驱动下的 GUS基因的转化和表达 　
未转化的对照无 GUS活性表达 (图 4, D、E)。
214　转基因植株中 GU S表达的 W estern2Blot分析
W estern杂交结果证明 : 转基因植株中有所期望大小的表达蛋白 (图 5)。但在组织发育的不同阶
段 , 其表达水平不同 : 充分生长具有功能叶片的顶梢比正在生长的嫩梢具有更高表达水平的 GUS活
性 , 如图 5中的 1和 3, 2和 4。
根中表达水平与充分生长顶梢中的表达水平相似。
这一蛋白表达水平结果与上述 GUS表达的染色结果一致 : 幼嫩的分生组织未观察到 GUS染色 ,
但功能叶片和茎表现很强的 GUS染色。这些结果与前人报道的 A tSUC2启动子的活性要经历源和库的
传递 ( Kathryn et al. , 2003) 相一致。
图 5　转基因株系 W estern杂交
CK: 未转基因对照植株 ; 1, 2: 转基因植株 1和 2的幼嫩梢 ;
3, 4: 转基因植株 1和 2充分生长的顶梢 ;
5, 6: 转基因植株 1和 2的根。
F ig. 5　W estern2Blot of represen ta tive puta tive tran sgen ic lines
CK: Non2transgenic control; 1, 2: Young shoot tip s of transgenic line 1 and line 2;
3, 4: Fully matured shoots of transgenic line 1 and line 2;
5, 6: Roots of transgenic line 1 and line 2.
3　讨论
本研究的最终目的是将抗植原体的抗菌基因转移到靶细胞中 , 用专一调控基因在韧皮部中表达的
启动子更具有实际意义 , 这样可以缩小或避免不必要的非靶细胞的暴露和抗菌基因的消耗。本研究结
果表明 A tSUC2启动子能够指导 GUS基因专一在梨的韧皮部中表达 , 为进一步进行抗植原体的梨转基
因工程研究奠定了基础。
将共培养培养基改良为液体培养 , 整个试验过程附加 Km抗性筛选 , Km抗性芽转化率平均为
5218% , 比汤绍虎等 (2007) 报道的 (‘雪青 ’梨 , 34124% ) 和 Yancheva等 (2006) 报道的 (‘Spa2
dona’梨 , 3% ～4% ) 大大提高。其原因由于基因型不同之外 , 可能与共培养方法有关。本研究为
液体共培养 , 叶片更易于吸收培养基内的养分及其所含的菌液 , 农杆菌侵染植物细胞的可能性更多 ,
从而获得转化细胞的几率就高 , 导致获得转基因植株率高。
References
Garcia2Chapa M, Medina V, V iruelM A, LaviÌa A, Batlle A. 2003. Seasonal detection of pear decline phytop lasma by nested2PCR in different
pear cultivars. Plant Pathology, 52: 513 - 520.
Im lau A, Truernit E, Sauer N. 1999. Cell2to2cell and long2distance trafficking of the green fluorescent p rotein in the phloem and symp lastic unloa2
ding of the p rotein into sink tissues. Plant Cell, 11: 309 - 322.
Jefferson R A. 1987. A ssaying chimeric genes in p lants: The GUS gene fusion system. PlantMol B iol Rep, 5: 387 - 405.
194
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
Kathryn M W right, A lison G Roberts, Helle J Martens, Norbert Sauer, Karl J. 2003. Structural and functional vein maturation in develop ing to2
bacco leaves in relation to A tSUC2 p romoter activity. Plant Physi, 131: 1555 - 1565.
Mohamed F, Lydia F, Nobuyo K, Masum i I, H ideo I. 2004. Acibenzolar2S2methyl2induced resistance to Japanese pear scab is associated with po2
tentiation of multip le defense response. Phytopathology, 94 (6) : 604 - 612.
Stadler R, Sauer N. 1996. The A rabidopsis tha liana A tSUC2 gene is specifically exp ressed in companion cells. Bot Acta, 109: 299 - 306.
Stadler R, W rightM W , Lauterbach C, Ammon G, GahrtzM, Feuerstein A, Oparka K J, SauerN. 2005. Exp ression of GFP2fusions in A rabidop2
sis companion cells reveals extensive non2specific p rotein trafficking into sieve elements, and identifies a novel post2phloem domain in roots.
Plant J, 41: 319 - 331.
Truem it E, Sauer N. 1995. The p romoter of the A rabidopsis tha liana SUC2 sucrose2H + symporter gene directs exp ression of beta2glucuronidase to
the phloem: Evidence for phloem loading and unloading by SUC2. Planta, 196: 564 - 570.
Tel2Zur N, Abbo S, Myslabodski D, M izrahi Y. 1999. Modified CTAB p rocedure for DNA isolation from ep iphytic cacti of the genera Hylocereus
and Selen icereus (Cactaceae) . PlantMol B iol Rep, 17: 249 - 254.
Tang Shao2hu, Sun M in, L iao Zhi2hua, Zhou Q i2gui, L i Dao2gao. 2007. Obtainment of transgenic‘Xueqing’pear p lantswith a synthetic C ry1Ac
gene mediated by Agrobacterium tum efaciens. Acta Horticulturae Sinica, 34 (1) : 59 - 62. ( in Chinese)
汤绍虎 , 孙　敏 , 廖志华 , 周启贵 , 李道高. 2007. 根癌农杆菌介导 Cry1A c基因转化 ‘雪青’梨获得转基因植株. 园艺学报 , 34
(1) : 59 - 62.
Yancheva S D, Shizerman L A, Golubowicz S, Yabloviz Z, Perl A, Hanania U, Flaishman M A. 2006. The use of green fluorescent p rotein
( GFP) imp roves A grobacterium 2mediated transformation of‘Spadona’pear ( P ryus comm unis L. ) . Plant Cell Rep, 25 (3) : 183 - 189.
Zhao Y, L iu Q, Davis Robert. 2004. Transgene exp ression in strawberries driven by a heterologous phloem2specific p romoter. Plant Cell Rep, 23
(4) : 224 - 230.
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