全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 974～978
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 01 - 06; 修回日期 : 2006 - 04 - 27
基金项目 : 农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: rifei1sun@ caas1net1cn)
大白菜游离小孢子培养胚胎发生中的加倍机制
李　菲　张淑江　章时蕃　钮心恪　孙日飞 3
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 利用 Leica体视显微镜 , DAP I荧光染色观察比较大白菜小孢子正常发育为成熟花粉粒与游离
小孢子培养胚胎发生细胞核的分裂方式 , 探讨大白菜游离小孢子培养胚胎发生及其自然加倍的机理。观察
结果显示以 B途径为主要发育途径的大白菜小孢子 , 胚胎发生的启动机制是热激诱导下单倍体小孢子体积
膨大 , 染色体发生自然加倍 , 从而激发小孢子进入孢子体发育途径 ; 大白菜小孢子胚再生植株具有较高的
自然加倍率 , 这与小孢子培养热激诱导激发小孢子单核自然加倍为二倍体密切相关。
关键词 : 大白菜 ; 小孢子培养 ; DAP I荧光染色 ; 胚胎发生 ; 染色体自然加倍
中图分类号 : S 63411　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0520974205
Em bryogenesis and D oubling M echan ism of Isola ted M icrospore Culture in
Ch inese Cabbage ( B rassica rapa ssp. pekinensis)
L i Fei, Zhang Shujiang, Zhang Shifan, N iu Xinke, and Sun R ifei3
( Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricultura l Sciences, B eijing 100081, China)
Abstract: The pathway of nuclear divisions of isolated m icrospore at different development stages and
their embryogenesis p rocess in Chinese cabbage were investigated under a fluorescence m icroscopy by using
DAP I staining to understand embryogenesis and doubling mechanism of isolated m icrospore culture in Chinese
cabbage. The results showed that after heat shock p retreatment the isolated m icrospores expanded. Most of m i2
crospores exhibited B pathway, and nuclear chromosomes doubled at very early stage, then doubled hap loid
embryoids formed. That is why isolated m icrospore culture of Chinese cabbage usually p roduce high frequency
of spontaneously doubled hap loid p lants.
Key words: Chinese cabbage; M icrospore culture; DAP I fluorescence stain; Embryogenesis; Spontane2
ously doubled hap loid
自从 1982年 L ichter〔1〕首次报道甘蓝型油菜小孢子培养成功获得了小孢子胚及其再生植株 , 芸薹
属作物游离小孢子培养技术进入了快速发展阶段。1989年日本学者 Sato等〔2〕首次报道成功诱导出大
白菜游离小孢子胚和再生植株 , 1992年国内学者曹鸣庆等〔3〕也报道了大白菜游离小孢子培养获得成
功。此后的十几年来 , 研究人员对大白菜游离小孢子培养技术做了大量的研究工作〔4〕。其培养技术
得到不断完善 , 但是小孢子是如何被激发转入孢子体发育途径的这一核心问题仍未完全清楚。
单倍体小孢子培养获得胚状体 , 经染色体加倍变为二倍体植株是游离小孢子培养技术应用于植物
育种和获得 DH群体的重要环节。从理论上讲 , 小孢子只携带供体植株一半的染色体 , 由小孢子产生
的再生植株应该都是单倍体。但是实际情况并非如此 , 小孢子再生植株出现了不同比例的二倍体植
株。如在甘蓝型油菜中 , 小孢子再生植株的自然加倍率可达 10% ～26%〔5〕, 在大白菜小孢子再生植
株中 , 多数基因型经自然加倍的二倍体植株可达 50%以上 , 有的材料甚至高达 70%以上〔6〕。很显然 ,
大白菜的小孢子培养比其他芸薹属作物更易获得二倍体植株。因而探讨大白菜游离小孢子培养胚胎发生
及其自然加倍的机理 , 从而达到自主操控小孢子的发育途径 , 大大提高大白菜小孢子培养的出胚率和胚
　5期 李 　菲等 : 大白菜游离小孢子培养胚胎发生中的加倍机制 　
胎的自然加倍率 , 使这一技术在育种和相关的基础研究中得到更广泛的应用具有十分重要的意义。
本研究以大白菜为试材 , 通过显微观察 , 了解小孢子经诱导、启动到开始分裂形成胚状体的过程
以及小孢子的细胞核分裂特点 , 从而探讨大白菜游离小孢子培养胚胎发生的启动机制和植株自然加倍
机理 , 以便更好地完善小孢子培养技术。
1　材料与方法
111　材料
供体植株为易出胚大白菜材料中白 50、中白 83、中白 85等 (中国农科院蔬菜花卉研究所白菜育
种课题提供 )。洗涤培养基 B5213 (蔗糖浓度为 13%的 B5培养基 )。小孢子培养的基本培养基 NLN2
13 (蔗糖浓度为 13%的 NLN培养基 ) 加适量活性炭。
DAP I荧光染液母液 : 1 mg DAP I加 1 mL双蒸水溶解 ; 缓冲液 : 01605 g B is Tris + 1 000 mL双蒸水 +
015 mL Triton100; 使用前用 1 mol/L HCl调缓冲液 pH 710, 将母液用缓冲液稀释为 0105μg/L。
112　试验方法
小孢子的常规培养 : 取适期大白菜花蕾 , 用 7%饱和次氯酸钠溶液表面消毒 15 m in, 无菌水冲洗
3次。将无菌花蕾放于研钵中 , 加少量 B5213洗涤培养基 , 用研棒轻轻挤压材料使小孢子游离于溶液
中 , 用 300目孔径尼龙网纱过滤收集滤液 , 离心机 100 ×g离心 3次 , 每次 4 m in, 离心后将小孢子悬
浮于过滤灭菌的 NLN213基本培养基 , 调整适宜浓度后分装于 60 mm ×15 mm培养皿 , 每皿 2 mL, 石
蜡膜封口 , 33℃热激诱导 24 h后转到 25℃暗培养直至出胚。
显微观察 : 利用 DAP I荧光染色法观察小孢子正常发育和离体诱导成胚过程中细胞核的分裂形式。
DAP I (4, 6 -二脒基 -二苯基吲哚 ) 是常用的 DNA特异性荧光染料 , 由于其只对细胞核进行染色 , 专
一结合在 DNA的 A2T碱基区 , 因而能够得到极低甚至没有细胞质背景干扰的核染结果 , 在紫外光激发
时发射明亮的蓝色荧光 , 可直接在荧光显微镜下对核染色后的细胞进行形态学变化观察 , 通过细胞核荧
光染色面积和荧光强度即可计算细胞核的相对 DNA含量 , 初步判断染色材料的倍性〔7, 8〕。
取不同长度花蕾的大白菜小孢子 , 用 DAP I荧光染色 , Leica体视荧光显微镜下观察大白菜小孢
子正常发育形态和相应的核分裂状态。
以单核靠边期小孢子为对照 , Leica体视荧光显微镜下观察比较大白菜小孢子离体培养下小孢子
经诱导启动后在不同发育阶段的核分裂方式。
2　结果与分析
211　大白菜小孢子自然发育为成熟花粉粒形态及核分裂特点
在被子植物中 , 花粉常用于指 2 -细胞或 3 - 细胞时期的雄配子体 , 为了与此区别 , 一般把从四
分体释放出来到形成成熟花粉之前的雄配子体称为小孢子〔9〕。在显微镜下观察可见大白菜的小孢子
母细胞经过减数分裂形成 4个单倍体的小孢子即四分体小孢子 (图版 , 1) , 当小孢子从四分体释放
后 , 进一步形成明显的壁 , 同时体积迅速增大。随着体积的增大 , 小孢子的细胞质发生液泡化 , 细胞
核从中央移到细胞的一侧 , 即单核靠边期小孢子 (图版 , 2)。此后小孢子在正常的配子体发育途径
中经历两次分裂 , 第 1次分裂形成 1个营养核和 1个生殖核 , 称为双核期小孢子 (图版 , 3) , 同时两
核间形成弧形的细胞板 , 小孢子分裂为两个高度不均等的细胞。第 2次分裂即生殖核发生分裂形成两
个精子 , 小孢子发育为具有 1个营养核和两个精核的成熟花粉粒 (图版 , 4)。大白菜单核期小孢子
发育为成熟花粉粒 , 其外部形态和体积也相应的发生明显的改变 , 这为大白菜游离小孢子培养选取适
宜发育阶段的小孢子提供了可靠的形态依据。
212　大白菜小孢子离体培养的诱导启动与核的分裂特点
一般单核靠边期是大白菜游离小孢子培养诱导成胚的最佳时期〔2〕, 此时小孢子为圆球型 , 有 3条
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明显的萌发沟 , 细胞核从中央移到细胞一侧 (图版 , 2) ; 离体小孢子经 33℃热激诱导 14 h后 , 显微
镜下可观察到一定比例的小孢子体积明显膨大为原来的 115～310倍 , 对比单核靠边期小孢子 DAP I
荧光染色发现 , 在荧光强度基本相同情况下 , 此时膨大的小孢子核荧光面积明显增大 , 接近单核靠边
期小孢子核荧光面积的 2倍 , 由于细胞核的 DNA含量可以通过荧光染色的荧光强度和荧光面积作为
衡量指标〔7〕, 由此可以初步判断小孢子核发生了加倍 , 由原来的单倍体自然加倍为二倍体 (图版 ,
5、6) ; 33℃热激诱导 24 h后 , DAP I荧光染色显微镜下观察可见膨大的二倍体单细胞开始正常的有
丝分裂 , DNA发生复制分裂形成两个细胞核 (图版 , 7) ; 转入 25℃暗培养 24 h后取样观察发现膨大
的小孢子发生第 1次细胞分裂 , 二倍体单细胞对称分裂为两个子细胞 , 两个细胞核均匀分配给两个子
细胞 (图版 , 8～10) ; 小孢子离体培养第 3天取样 , DAP I荧光染色观察已可见对称分裂形成的四细
胞团 (图版 , 11、12)。在随后的离体培养中 , 细胞团继续对称分裂 , 遵循典型的 B途径小孢子胚胎
发育方式〔9〕, 即小孢子有丝分裂形成两个均等的细胞而不分化为营养细胞和生殖细胞 , 这两个均等
细胞再继续分裂 , 最终形成胚状体。小孢子离体培养第 8～9天 , 肉眼已可观察到极其幼小的胚性细
胞团 ; 离体培养两周后 , 培养皿可同时看见发育不同步的球形胚、星形胚、鱼雷期胚和子叶期胚。
以单核靠边期小孢子为对照 , DAP I荧光染色观察 , 在荧光强度基本一致下 , 经诱导启动膨大的
小孢子单核荧光染色面积接近为单核靠边期小孢子核荧光染色面积的 2倍 , 在此后的取样观察中 , 分
裂的细胞团直至形成的胚状体 , 细胞核的荧光染色面积始终接近单核靠边期小孢子核荧光染色面积的
2倍 (图版 , 5～17)。由此可以初步判断大白菜游离小孢子培养 , 胚状体的自然加倍发生在胚胎诱导
的初期 , 即从小孢子诱导启动开始就可以完成核的自然加倍。
3　讨论与结论
本试验利用 DAP I荧光染色 , 显微镜下观察大白菜游离小孢子培养与小孢子正常发育为成熟花粉
粒过程 , 比较两者在小孢子形态与核分裂方式的差别。结果显示单核靠边期小孢子在不同发育途径下
其外部形态和细胞核分裂方式都发生了明显改变 : 沿配子体途径正常发育的小孢子从单核期到双核前
期 , 圆球形小孢子体积有所增大 , 但双核后期小孢子即由圆球形变为椭圆形。正常发育下单核小孢子
发生不均等分裂 , 形成一个大的营养细胞 , 营养细胞内包含一个小的生殖细胞 ; 而诱导向孢子体途径
发育的小孢子 , 经热激启动后小孢子仍保持圆球形 , 但体积明显膨大 , DAP I荧光染色观察 , 在荧光
强度基本一致下 , 启动膨大的小孢子细胞核荧光染色面积接近单核靠边期小孢子核荧光染色面积的 2
倍 , 由此可以初步判断热激启动的小孢子核发生了自然加倍 , 单核小孢子变为二倍体的单细胞。此后
体积膨大的二倍体单细胞发生一系列的对称分裂 , 最终形成胚状体。
关于单核小孢子在诱导启动后就自然加倍的现象 , 在禾本科作物的小孢子培养中也有相关报道。
李文泽等〔10〕在大麦小孢子培养中用甘露醇预处理小孢子的脱分化 , 显微观察发现小孢子在预处理过
程中染色体的数目就已完成了加倍 , 同时小孢子的胚胎发生以 B途径为主要途径 ; 而在低温预处理
下 , 大多数小孢子的细胞核为单倍体 , 胚胎发生以 A途径 (小孢子诱导脱分化启动后 , 小孢子核由
正常的有丝分裂形成一个大的营养细胞和一个小的生殖细胞。以后营养细胞继续分裂 , 产生一个单倍
体的球型胚状体 , 胚状体最终由于花粉外壁的破裂而被释放出来 ) 为主要途径。周嫦等〔11〕在大麦小
孢子培养中也观察到相同现象 , 并认为甘露醇预处理有利于小孢子胚胎的染色体加倍 , 并且加倍的时
期很早。本研究在大白菜游离小孢子培养中 , 观察到小孢子在诱导培养初期就可以完成胚胎的自然加
倍 , 这与前人对其他作物的研究报道相吻合。在 33℃热激诱导下 , 我们发现大白菜小孢子的胚胎发
生是 A、B途径并存的 , 但以 B途径为主要发育途径。观察显示 , 大量启动膨大、核发生自然加倍的
小孢子胚胎发生便是沿 B途径发育 , 即小孢子有丝分裂形成两个均等的细胞而不分化为营养细胞和
生殖细胞 , 这两个均等细胞再继续分裂 , 最终形成胚状体〔9〕。由此可以推断 , 沿 B途径发育的大白
菜小孢子胚胎发生的启动机制就是单倍体的小孢子感受外界诱导发生自然加倍变成二倍体的单细胞 ,
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从而激发小孢子背离配子体的发育途径而转向孢子体发育。
观察结果也说明 , 短期的热激处理是整个大白菜游离小孢子培养技术体系的关键 , 热激引起了单
核小孢子核的加倍。但热激诱导不是大白菜小孢子培养启动的唯一途径 , 激素处理或其他诱导方法同
样能引起单倍体小孢子核的加倍〔12〕。
本试验以单核靠边期小孢子为对照 , 通过 DAP I荧光染色 , 大量观察诱导启动的小孢子、分裂的
细胞团以及形成的幼胚 , 比较取样与对照的核荧光强度和面积 , 都可初步判断发生了自然加倍 , 反映
出本试验的供试材料诱导获得的大白菜小孢子胚状体有较高的自然加倍率。但有报道认为小孢子再生
植株自然加倍率受基因型和外植体的预处理方式的影响。对小麦小孢子进行 4℃低温预处理 , 再生植
株的自然加倍率可达 79% , 而进行高温饥饿预处理时其只有 18%〔13, 14〕; J ip ing在甘蓝型油菜的游离
小孢子培养中用秋水仙素预处理获得的小孢子再生植株加倍率达 90% , 明显高于高温预处理获得的
小孢子植株 6%的二倍体比例〔12〕。这不仅证明小孢子培养胚胎的自然加倍发生在胚诱导的初期 , 也
说明自然加倍率受培养方式影响。目前对大白菜游离小孢子培养 , 高温热激预处理是诱导小孢子启动
的有效方法 , 其它诱导小孢子胚胎自然加倍率的方法还未见报道。
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图版说明 : 1. DAP I荧光染色四分体小孢子 ; 2. DAP I荧光染色单核靠边期小孢子 ; 3. DAP I荧光染色双核期小孢子 ; 4. DAP I荧光染
色成熟花粉粒 ; 5, 6. 单核靠边期小孢子经 33℃热激诱导 14 h后 , 体积明显膨大 , 核同时发生加倍的小孢子 ; 7. 33℃热激诱导 24 h
后 , 二倍体单细胞细胞核复制 ; 8～10. 二倍体单细胞第 1次对称分裂形成两个子细胞 , 细胞核荧光面积为单核靠边期小孢子 2倍 ;
11, 12. 第 2次分裂形成对称的四细胞团 ; 13. 四细胞团与单核靠边期小孢子荧光染色细胞核比较 ; 14, 15. 较大细胞团与单核靠边
期小孢子荧光染色细胞核比较 ; 16. 球形胚的荧光染色 ; 17. 球形胚体细胞与单核靠边期小孢子 DAP I荧光染色细胞核比较。
Explana tion of pla tes: 1. DAP I staining to visualize tetrad m icrospores; 2. DAP I staining to visualize late uninucleate m icrospore; 3. DAP I stai2
ning to visualize m icrospore of one vegetative nucleus and one generative nucleus; 4. DAP I staining to visualize pollen of one vegetative nucleus
and two generative nucleus; 5, 6. Late uninucleate m icrosporepis size expand and nucleus doubled after 33℃ 14 hours culture; 7. Nucleus rep ro2
duce of dip loid m icrospore after heat shock and 24 hours 25℃ culture; 8 - 10. The first symmetric division of dip loid m icrospore growth two2cell,
DAP I staining to visualize nucleus fluorescence section is redup lication contrast to late uninucleate m icrosporepis; 11, 12. The second symmetric di2
vision of dip loid m icrospore growth four2cell; 13. Nucleus fluorescence section of four2cell contrast to late uninucleate m icrosporepis; 14, 15. Nu2
cleus fluorescence section of multicellular m icrospore contrast to late uninucleate m icrosporepis; 16. DAP I staining to visualize globular embryo;
17. DAP I staining to compare the globular embryo cellpis nucleus with the late uninucleate m icrosporepis.
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