全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 481 - 484
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 07 - 21; 修回日期 : 2006 - 12 - 29
基金项目 : 国家 ‘863’资助项目 (2001AA241144)
苹果花药培养植株倍性及其纯合基因型的鉴定
张利义 1 , 杨振英 1 , 丛佩华 1 , 张开春 2 , 刘建利 3 , 薛光荣 1
(1 中国农业科学院果树研究所 , 辽宁兴城 125100; 2 北京市农林科学院林业果树研究所 , 北京 100093; 3 西北第二民
族学院生命科学系 , 银川 750021)
摘 　要 : 用倍性分析仪对 3株苹果花药培养植株进行了倍性鉴定 , 并用 AS2PCR分子标记分析其是否
为纯合体。流式细胞法测定其倍性分别为二倍体、三倍体和四倍体 ; AS2PCR分析证明它们为纯合基因型。
可认为花药培养植株的多倍化现象可能是在组织培养条件下 , 由起源于单倍体的细胞发生自然加倍所形成
的结果。
关键词 : 苹果 ; 花药培养 ; AS2PCR; 倍性 ; 纯合基因型
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220481204
Ana lysis of Plo idy and Hom ozygous Genotype of Apple Plan ts O bta ined by
An ther Culture
ZHANG L i2yi1 , YANG Zhen2ying1 , CONG Pei2hua1 , ZHANG Kai2chun2 , L IU J ian2li3 , and XUE Guang2rong1
(1 Institu te of Pom ology, Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, X ingcheng, L iaon ing 125100, Ch ina; 2 Institu te of Forestry
and Pom ology, B eijing A cadem y of A gricu lture and Forestry Sciences, B eijing 100093, China; 3D epartm en t of L ife Sciences, the
Second N orthw est U niversity forM inorities, Y inchuan 750021, Ch ina)
Abstract: In this paper, the p loidy and homozygous genotype of three app le p lants obtained by anther
culture were analyzed by using methods of the flow cytometric analysis and AS2PCR marker, in order to con2
firm their hap loid origin. The results have p roved that they all have a true homozygous status by AS2PCR anal2
ysis although they are now dip loid, trip loid and tetrap loid respectively by Ploidy Analyser, which is possibly
regarded as a result of spontaneous polyp loidisation from hap loid cell during tissue culture.
Key words: App le; Anther culture; AS2PCR; Ploidy; Homozygous genotype
对于苹果这样遗传背景高度复杂的多年生木本果树 , 利用 DH (Double Hap loid, 简称 DH) 材料
进行遗传分析和品种选育等研究 , 具有重要的价值 (薛光荣和杨振英 , 1990; 何道一 等 , 2001;
HÊfer et al. , 2002)。
已有报道 (薛光荣和牛健哲 , 1984; 牛健哲 等 , 1994; HÊfer & Grafe, 2000) , 苹果花药培养植
株试管苗早期染色体记数观察发现其单倍体细胞占优势 , 后经过长时间的组织培养以及在田间栽培 ,
发现染色体数在不断变化 , 常发生自然加倍现象。另外 , 花药培养的植株可能起源于单倍体配子 , 也
可能起源于 2n配子或体细胞。因而 , 苹果花药培养植株往往为单倍体、加倍单倍体及其他倍性等混
合群体。
尽早鉴定出真正起源单倍体的植株尤为必要 , 这是了解其遗传背景和进一步应用的前提。本研究
中采用倍性分析仪对 3株苹果花药培养植株进行了倍性鉴定分析 , 并用 S ( Self2incompatibility) 基因
AS2PCR (A llele2Specific PCR, 简称 AS2PCR) 分子标记技术就它们是否为纯合体进行了鉴定分析 , 以
期为进一步开展苹果花药培养纯系杂交育种和创建苹果 DH群体奠定研究基础。
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
1　材料与方法
试材采自中国农业科学院果树研究所试验基地 , 为 1987年嫁接成活的金冠苹果花药培养植株 ac1
和 ac2 , 以及 2002年嫁接成活的嘎拉苹果花药培养植株 ac3。
分别取 3～5个叶片 , 放在有冰块的冰壶中 , 带到华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,
采用流式细胞法 (张俊娥 等 , 2003) 测定单个细胞核的 DNA总量 , 每个样品测定 5 000个细胞。以
花药培养植株相对应的母本叶片的 DNA含量为对照。DNA含量的分布曲线由倍性分析仪自动测定 ,
采用 PartecDPAC软件自动统计分析。
用于 S基因 AS2PCR分析的 DNA采用 CTAB法提取 (Doyle & Doyle, 1990) , 但提取缓冲液组成
略有变动。其组成为 100 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 810; 114 mol·L - 1 NaCl; 60 mmol·L - 1 EDTA , pH
810; 2% CTAB; 1%疏基乙醇 ; 2% PVP。将提取的 DNA溶于适量的 TE中 , 经紫外分光光度法和琼
脂糖电泳定量法进行模板 DNA定量。
根据文献 (B roothaerts et al. , 1995; Janssens et al. , 1995) , 金冠品种 S基因型为 S2S3, 嘎拉为
S2S5。根据已明确的 S基因序列 , 对其保守序列设计特异引物 , 进行 PCR扩增。本研究所用引物引
自 B roothaerts (2003) 发表的文章 , 具体见表 1。
表 1　S基因特异性 PCR引物
Table 1　PCR pr im ers spec if ic for S genes
基因
Gene
引物 (5′- 3′)
Primers (5′- 3′)
退火温度
Annealing temperature (℃)
片段大小
Band size ( bp)
S2 Sf: GTTCAAACGTGACTTATGGG 64 449
Sr: GGTTTGGTTCCCTTACCATG
S3 Sf: CAAACGATAACAAATCTTAC 54 500
Sr: TATATGGAAATCACCATTCG
S5 Sf: GTAATTGCAACGGGTCAAAATATGAG 62 346
Sr: ACAACTCAGTATTAGTTGCTGGATCA
PCR反应体系 : 1 ×PCR buffer, 115 mmol·L - 1 MgCl2 , 200μmol·L - 1 dNTPs, 两种引物各 1
μmol·L - 1 (上海生工生物公司合成 ) , 015 U Taq DNA聚合酶 ( Promega公司产品 ) , 50 ng DNA模
板 , 总反应体积 20μL。
PCR程序 : 94℃预变性 3 m in; 然后按 94℃ 1 m in, 各 S基因引物的退火温度 (表 1) 30 s, 72℃
延伸 1 m in, 30个循环 ; 72℃延伸 5 m in。
将金冠对照及其 ac1、ac2花药培养植株的 S2 PCR产物分别与其相对应的 S3 PCR产物混匀 , 同样
将嘎拉的对照及其 ac3花药培养植株的 S2 PCR产物分别与其相对应的 S5 PCR产物混匀 , 在 310 % 的
琼脂凝胶上电泳 , 经 EB 染色后凝胶呈像系统中照相。试验重复 3次。
2　结果与分析
211　花药培养植株倍性的鉴定
倍性分析仪测定结果 (图 1) 显示 , 花药培养植株 ac1、 ac2和 ac3分别为二倍体、三倍体和四倍
体。这和 HÊfer等 (2000) 采用流式细胞法测定苹果花药培养植株倍性所得到相类似的结果。但是这
3株花药培养植株究竟是起源于二倍体细胞 (如花药的药壁、药隔以及未减数 2n配子等 ) , 还是起源
于单倍体细胞在培养条件下发生自然加倍 , 还不能确定。
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　2期 张利义等 : 苹果花药培养植株倍性及其纯合基因型的鉴定 　
图 1　苹果花药培养植株的 D NA流式细胞分析
F ig. 1　Flow cytom etry of nuclear D NA con ten t of apple an ther2cultured plan t
212　S基因 AS2PCR扩增
苹果是典型的配子体型自交不亲和性果树 , 其自交不亲和性是由复等位基因的单一位点控制 , 也
称单位点自交不亲和性 (B roothaerts et al. , 1995)。就苹果品种自交不亲和性基因型而言 , 迄今在苹
果上已鉴定出了数十个 S等位基因 ( van Nerum et al. , 2001; B roothaerts, 2003)。双亲 S基因型与后
代 S基因型有着必然的联系 , 后代 S 基因型是父母本所包含的一对 S 基因之一的随机组合的结果
(Verdoodt et al. , 1998; 张绍铃 等 , 2003)。由此推断 , 二倍体品种含两种不同的 S基因 , 单倍体品
种只含一种 S基因。通过花药培养所获得植株 , 不管最终加倍变成几倍体 , 如果其为单倍体起源 , 应
只具有其亲本之一的一种 S基因 , 如果为二倍体细胞起源 , 应该具有和亲本相同的两种 S基因。譬如
金冠 S基因型为 S2S3, 其花培植株如果起源于单倍体 , 不管最终加倍变成几倍体 , 其分子标记要么
是 S2, 要么是 S3, 如果是二倍体细胞起源 , 那么必同现 S2和 S3。我们的试验结果证实了这一点。
所选用的 3株花培植株均缺失一条谱带 ; 金冠 ac1为 S2 (449 bp ) , 缺失 S3, 而 ac2为 S3 (500 bp ) ,
缺失 S2 (图 2, A)。嘎拉 ac3为 S5 (346 bp) , 缺失 S2 (图 2, B )。而对照 (CK+ ) 均出现了两条标
记谱带 , 金冠分别为 S3 (500 bp) 和 S2 (449 bp) , 嘎拉分别为 S2 (449 bp) 和 S5 (346 bp) , 与预
料的一致。
图 2　AS2PCR鉴定苹果及其花培植株的 S等位基因的扩增结果
M. PCR marker; A: CK + . 阳性对照 (金冠 ) ; ac1 , ac2. 金冠花培植株 ; CK - . 阴性对照。
B: CK + . 阳性对照 (嘎拉 ) ; ac3. 嘎拉花培植株。
F ig. 2　AS2PCR ana lysis of S2a lleles from apple and its an ther2cultured plan ts
M. PCR marker; A: CK + . Positive control; CK - . Negative control; ac1 and ac2. Anther2cultured p lants.
B: CK + . Positive control ( Gala) ; ac3. Anther2cultured p lant.
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Verdoodt等 (1998) 在对 B raeburn品种的 30株花培植株进行 AS2PCR标记鉴定后发现仅有一株 S
基因和亲本一样 , 其余 29株均缺失一种 S等位基因。Verdoodt等 (1998) 和本试验结果均说明通过
花药培养获得的再生植株主要是单倍体起源 , 也即纯合体 , 并说明苹果花药培养植株自然加倍频率极
高。这也与 HÊfer等 (2002) 用 SSR标记方法分析苹果花药培养植株所得到结论相同。
此外 , 通过花药培养还可获得倍性丰富的纯合体植株 , 这为今后开展苹果倍性遗传育种研究提供
了丰富的试材。
综上可见 , 通过苹果花药培养可获得倍性丰富的纯合基因型植株 , 这为今后开展苹果纯系和倍性
遗传育种研究提供了基础材料。另外 , 对已明确 S基因型品种的花药培养再生植株如同时使用流式细
胞法和 AS2PCR分子标记法 , 不仅可以快速确定其倍性 , 还能确定其是否为纯合体。
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