全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (2) : 405～407
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 07 - 27; 修回日期 : 2005 - 12 - 09
基金项目 : 山东省优秀中青年奖励基金资助项目 (2005BS02015)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: chenm in@ sdu1edu1cn)
莴苣高效瞬时表达体系的建立
李　静 1, 2 　陈　敏 23 　刘现伟 2 　沈法富 1 　王　鹏 23
(1 山东农业大学农学院 , 作物生物技术重点实验室 , 泰安 271018; 2 山东大学生命科学学院 , 微生物技术国家重点实
验室 , 济南 250100)
摘 　要 : 以 GUS基因作为报告基因 , 利用农杆菌真空渗透法 , 采取正交试验设计对莴苣 (L actuca
sativa L. sp) 的瞬时表达条件进行研究 , 建立了高表达水平的瞬时转化体系 (乙酰丁香酮 200μmol/L、菌
液密度 OD600值 018、真空处理 30 m in、共培养 6 d)。应用结果表明 : 优势组合的表达水平比对照的表达水
平提高 1613倍。
关键词 : 莴苣 ; 农杆菌 ; 真空渗透 ; GUS; 瞬时表达
中图分类号 : S 63612　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0220405203
A H ighly Eff ic ien t System Establishm en t of Tran sien t Expression in L ettuce
L i J ing1 , Chen M in23 , L iu Xianwei2 , Shen Fafu1 , and W ang Peng23
(1 The Key L aboratory of C rop B iology of Shandong, School of A gronom y, Shandong A gricu ltura l U niversity, Ta ipian 271018,
China; 2 The S ta te Key Labora tory of M icrobial Technology, School of L ife Science, Shandong U niversity, J ipinan 250100, China)
Abstract: U sing A grobacterium vacuum infiltration method the p lant bivalent exp ression vector pB I121
containing GUS as a report gene was transformed into lettuce (L actuca sa tiva L. sp). Through orthogonal ex2
periment, a highly efficient system of transient exp ression was observed in p lant intact leaves when they were
treated with 200 μmol/L acetosyringone, 018 OD600 bacterium density, vacuum 30 m in and co2culture 6
days. Transgenic exp ression level of the op timal condition is imp roved 1613 times than that of the control.
Key words: L actuca sa tiva; A grobacterium tum efaciens; Vacuum infiltration; GUS; Transient exp ression
1　目的、材料与方法
植物瞬时表达系统 , 是不同于稳定遗传转化的有效转化方法。它在启动子分析、基因功能分析和
生产重组蛋白方面有着更为广泛的用途〔1〕。瞬时表达体系具有较多的优点。1. 简单快速 : 转化基因
可在转化的一周内进行分析 , 避免了繁杂的组织培养过程 ; 2. 表达水平高 : 当单链的 T2DNA进入植
物细胞后 , 许多未整合到植物基因组中的游离外源基因同样可以表达。3. 安全有效 : 瞬时表达中的
基因转移及其表达是一个独立的过程 , 不受植物生长发育过程的影响 , 不产生可遗传的后代 , 试验结
果更为直观可靠 , 且不存在基因漂移的生态风险。因此人们对此开展了大量的研究 , 但多集中在基因
枪的转化方面 , 而利用农杆菌真空渗透法进行瞬时表达直到 1997年才被人们发现和重视〔2〕, 由于它
的简便高效性使其在植物研究中迅速推广。2005年 Tadeusz等利用该方法对拟南芥、烟草、莴苣进行
研究发现 , 莴苣的瞬时表达水平最高 , 且表达水平与供试的农杆菌菌株的基因型有关 , 但关于该体系
的优化研究至今未见报道。本试验利用正交设计 , 分析了试验中关键因素 : 诱导物乙酰丁香酮
( acetosyringone, AS) 的浓度、培养的菌液密度、真空处理时间和共培养时间对 GUS表达水平的影
响 , 以期筛选到高表达水平的转化条件。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
本试验以日本软玻叶用莴苣 ‘京都 10号 ’为转基因植物材料 , 选用含有 GUS的质粒 pB I121、农
杆菌菌株 GV3101进行研究。取 20 d左右的无菌实生莴苣真叶 , 在含有不同菌液密度 (OD值 014、
016、018)、不同诱导物乙酰丁香酮浓度 (0、200、400μmol/L) 的渗透培养基 (1 /2MS, 10 mmol/L
MES, pH 516) 中进行不同时间 (10、20、30 m in) 的真空 (10 Pa) 处理 , 然后用无菌水将叶片冲
洗 3次 , 放置在铺有滤纸的培养皿中 , 24℃、16 h /d光照培养。分别于 2、4、6 d后取叶片进行 GUS
染色 , 同时取叶片称重进行 GUS定量检测〔3〕。
设 4因子 (菌液密度、乙酰丁香酮浓度、真空处理时间和共培养天数 ) 3水平试验 , 选用 L9
(34 ) 的正交表 , 方案见表 1, 试验重复 2次 , 每次取 15个叶片。采用唐启义的 DPS数据处理系统
(210C) 进行分析。
2　结果分析与讨论
211　不同因素的重要性分析及处理组合的择优
9次处理均获得瞬时表达转化叶片 (图版 ) , 但处理间的 GUS表达水平不同 (表 1) : 处理 3 (0
μmol/L乙酰丁香酮 , OD600值 018的菌液密度 , 真空处理 30 m in、共培养 6 d) 的瞬时表达水平最高 ,
与其他处理达到极显著差异。极差分析 (表 2) 表明 , 菌液密度是瞬时表达的关键因素 , 以 OD600值
018最优 ; 真空处理时间次之 , 以 30 m in最佳 ; 其次是共培养的天数、诱导物 AS的浓度 , 分别以 6
d和 200μmol/L最佳。
表 1　试验方案和 GUS表达情况
Table 1　Arrangem en t and expression level of GUS
处理
Treatment
A
AS
水平
Level
浓度
Concentration
(μmol/L)
B
菌液 Bacterium
水平
Level
密度
Bacterium
(OD600 )
C
真空处理 Vacuum
水平
Level
时间
time
(m in)
D
共培养 Co2culture
水平
Level
天数
day
( d)
GUS活性 GUS activity
( nmol·mg - 1 ·m in - 1 )
1 1 　0 1 014 1 10 1 2 1111 eE
2 1 　0 2 016 2 20 2 4 4178 dCD
3 1 　0 3 018 3 30 3 6 12117 aA
4 2 200 1 014 2 20 3 6 5119 dCD
5 2 200 2 016 3 30 1 2 10101 bB
6 2 200 3 018 1 10 2 4 6175 cC
7 3 400 1 014 3 30 2 4 3181 dD
8 3 400 2 016 1 10 3 6 5105 dCD
9 3 400 3 018 2 20 1 2 8184 bB
表 2　影响 GUS表达的因素间重要性分析和单因素不同水平的比较
Table 2　Ana lysis of the im portance of d ifferen t factors and d ifferen t levels of a single factor
水平
Level
A
均值
Average
显著水平
Significance
5% 1%
B
均值
Average
显著水平
Significance
5% 1%
C
均值
Average
显著水平
Significance
5% 1%
D
均值
Average
显著水平
Significance
5% 1%
1 6102 b B 3137 c C 4130 c C 6165 b B
2 7131 a A 6161 b B 6127 b B 5111 b B
3 5190 b B 9125 a A 8167 a A 7147 a A
极差 Extremum difference 1142 5188 4136 2136
调整极差 Adjusted extremum difference 1127 5130 3193 2112
　　α = 2, LSR0105 = 01314, LSR0101 = 01457; α = 3, LSR0105 = 01327, LSR0101 = 01482。
212　不同因素对瞬时表达水平的影响
菌液密度和真空处理时间对瞬时表达水平的影响达到极显著水平 (表 2)。曾有报道〔1, 2〕, 菌液密
度 (OD600 ) 以 013～018可以达到较好的表达效果 , 大于 110时 , 会引起组织变黄枯萎。本试验以
OD600值 018的菌液密度达到更高的表达水平 , 且表达水平随着菌液密度的增加而提高。抽真空的时
604
　2期 李 　静等 : 莴苣高效瞬时表达体系的建立 　
间一般采用 20 m in〔1, 2〕, 本试验发现当真空作用 30 m in时可增加表达水平 , 但真空作用太长则会使菌
液的温度下降 , 限制农杆菌的活性 , 影响转染〔1〕。共培养天数和诱导物乙酰丁香酮的浓度对瞬时表
达水平的影响达显著水平。共培养的天数一般在 10 d以后逐渐下降 , 本试验以幼嫩叶片为材料 , 发
现共培养 6 d瞬时表达水平最高。乙酰丁香酮作为农杆菌中 vir基因的诱导物 , 可有效的促进 T2DNA
的转移 , 提高外源基因的表达 , 本试验发现添加一定量 ( 200μmol/L ) 的乙酰丁香酮可提高表达水
平 , 当浓度过高 (400μmol/L) 时反而不利于表达。
以处理 A1B1 C1 D1 (0μmol/L乙酰丁香酮、OD600值 014 、真空处理 10 m in、共培养 2 d) 作对照 ,
采用筛选到的高效瞬时表达体系 A2 B3 C3 D3 (200μmol/L乙酰丁香酮、OD600值 018的菌液、真空处理
30 m in、共培养 6 d) 进一步试验。结果发现 : 优势组合的瞬时表达水平 (MU ) 21139 nmol·mg- 1 ·
m in - 1 〔MU为 4 -甲基伞形酮 , 为 GUS与 MUG (4 -甲基伞形酮 -β - D - 葡萄糖苷酯 ) 的产物 〕比
对照 MU 1131 nmol·mg- 1 ·m in - 1高出 1613倍 , 表明该体系可有效地提高外源基因的瞬时表达水平。
当然该表达体系还受供试材料基因型的限制 , 若对其它植物进行转化还应进一步试验。
参考文献 :
1　W roblewski T, Tomczakt A, M ichelmore R. Op tim ization of agrobacterium2mediated transient assays of gene exp ression in lettuce, tomato and
A robidop sis. Plant B iotechnology Journal, 2005, 3: 259～273
2　Kap ila J, R iet D R, Van M M, Angenon G. An agrobacterium2mediated transient gene exp ression system for intact leaves. Plant Science,
1997, 122: 101～108
3　Jefferson R A, Kavanagh T A, Eenan M W. GUS fusion: β2glucuranidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher p lants.
Embo. Journal, 1987, 6: 3901～3907
图版说明 : 不同处理 GUS表达情况　0. 无菌水处理 ; 1. 处理 1; 2. 处理 2; 3. 处理 3; 4. 处理 4; 5. 处理 5; 6. 处理 6; 7. 处
理 7; 8. 处理 8; 9. 处理 9。
Explana tion of pla tes: GUS expression of d ifferen t trea tm en ts　01Sterile water treatment; 11Treatment 1; 21Treatment 2; 31Treatment 3;
41Treatment 4; 51Treatment 5; 61Treatment 6; 71Treatment 7; 81Treatment 8; 91Treatment 9.
704