全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 629 - 636
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 24; 修回日期 : 2007 - 04 - 12
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671412, 30270236) ; 科技部 ‘973’重大基础研究前期研究专项 (2004CCA05300)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xieby@mail1caas1net1cn)
辣椒 N 基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的
抑制性消减杂交 SSH分析
茆振川 1, 2 , 谢丙炎 23 , 杨宇红 2 , 冯东昕 2 , 冯兰香 2 , 杨之为 1
(1 西北农林科技大学植物保护学院 , 陕西杨凌 712100; 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 以含 N 基因的辣椒 (Capsicum annuum L. ) 为试验材料 , 接种南方根结线虫 (M eloidogyne in2
cognita) 12、24、36 h的根尖材料作为测验方 ( tester) , 相应的未接种根尖材料作为驱动方 ( driver) , 构
建一个南方根结线虫诱导 N基因表达早期的正向抑制消减杂交 cDNA文库 , 并结合文库高密度点阵膜杂交
差异筛选 , 获得了 237条表达序列标签 ( EST)。在 GenBank上进行 BLASTn与 BLASTx分析 , 得到 148条
功能已知的 EST序列 , 获得已知的上调抗性相关 EST 68个。分离出了具有 NBS2LRR结构的抗线虫蛋白和
类 LRR抗性蛋白的基因 , 防御作用相关的类萌芽素 ( GLP)、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因 ,
抗性相关的 WRKY、ERFBP等转录因子基因 , 以及 G蛋白、142323蛋白等多种信号蛋白基因。通过 Gene
Ontology分析 , N基因介导的早期表达抗病基因涉及病原物的识别、抗性信号传导、过敏性坏死、系统获得
性抗性以及植物细胞保护机制等多个方面 , 并有许多功能未知的基因有待于进一步的研究。
关键词 : 根结线虫 ; 辣椒 ; N 基因 ; 抑制性消减杂交 ; 抗线虫相关基因
中图分类号 : S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320629208
Ana lysis of Early Expression Genes Resistance to Root Knot Nema tode in N
Gene Pepper by SSH
MAO Zhen2chuan1, 2 , X IE B ing2yan23 , YANG Yu2hong2 , FENG Dong2xin2 , FENG Lan2xiang2 , and
YANG Zhi2wei1
(1 College of P lant Protection, N orthw est A & F U niversity, Yangling, Shaanxi 712100, China; 2 Institu te of V egetables and
Flow ers, Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: The nematode resistant gene N is a single dom inant gene in pepper cultivar Carolina Wonder
(Capsicum annuum L. ). To investigate the early up2regulated exp ression genes p rofile in cultivar Carolina
Wonder induced by root2knot nematode (M eloidogyne incogn ita , RKN ) , a forward subtracted cDNA library
was constructed using supp ression subtractive hybridization ( SSH). The cDNA of pepper seedling root tip s in2
oculated with J2 RKN for 12, 24 and 36 h were used as tester and that from untreated root tip s as driver. To2
tally 237 RKN2induced SSH cDNA fragments were selected with D IG Nonradioactive Nucleic Acid Labeling
and Detection System. Based on the sequencing and BLAST analyzing of 148 fragments, 68 up2regulated ex2
p ression EST fragmentswere identified, including the genes encode nucleotide2binding site / leucine2rich repeat
(NBS2LRR) disease resistant p roteins and LRR resistance p rotein2like; some defense p roteins, such as Germ2
in2like p rotein, HSR203J p rotein2like, Nectarin, and Snakin22; some biostress resistance related transcrip tion
factor like WRKY and ERFBP; some signal p roteins, such as GRP2like p rotein and 142323 fam ily p rotein.
The Gene Ontology analysis revealed that the up2regulated ESTs involved in the recognition to nematode, sig2
nal transduction, p rotection mechanism, HR and SAR. In addition, some ESTs of unknown function may be
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novel genes.
Key words: Root2knot nematode; Pepper; N gene; Supp ression subtractive hybridization ( SSH ) ;
Resistant2nematode gene
根结线虫 (M eloidogyne spp. ) 是植物主要病原物之一。在世界范围内 , 植物寄生性线虫每年造
成约 1 000亿美元的损失 (B ird & Koltai, 2000)。Hare (1957) 将在辣椒中发现的第一个抗线虫基因
定名为 N , 为单显性基因 , 抗南方根结线虫 (M. incogn ita)、爪哇根结线虫 (M. javan ica)、花生根
结线虫 (M. arenaria )。N 基因的抗性表达在高温下会明显降低甚至消失 ( Thies & Fery, 1998 )。
Fery等 (1998) 选育出含有 N 基因的辣椒品种 Carolina Wonder。
现在已经发现了多种抗线虫基因和抗性相关基因。抗线虫基因 (R基因 ) 主要存在于番茄、马
铃薯、辣椒、禾谷类作物等植物中。已被克隆或被定位的抗线虫基因主要有 : M i、M e、Hero、H1、
Gro1、GPa、HS1pro1、C re等 (W illiam son, 1999) , 它们对植物病原线虫相应的非毒性基因 (A vr) 的
识别决定着植物的抗性。通过 cDNA文库的筛选 , 确定了许多防御相关基因 , 如 : 过氧化物酶、酯氧
合酶、伸展蛋白、病程相关蛋白、变味蛋白、硫素等 (Hammond2Kosack & Jones, 1996; W illiam son,
1999)。植物寄生性线虫侵染也可以诱导一些转录因子 , 如 ERFBP、WRKY、TobRB7等的表达 , 其
中 ERFBP、WRKY等转录因子在许多植物的防御反应中起作用 (Mazarei et al. , 2002)。
虽然已经证实在辣椒中存在多个抗线虫基因 , 如 N、M e1～M e5等 , 但是对于这些基因的结构、
作用机制等仍然不明确 , 特别是关于 N 基因的定位、克隆以及 N 基因所介导的早期抗线虫基因的表
达等均缺乏详细的研究。只有分离出了 N 基因 , 掌握 N 基因所介导的早期不亲和互作表达基因谱 ,
才能有助于实现 N 基因在抗线虫育种中的进一步应用。
本研究旨在通过抑制消减杂交技术 ( Supp ression Subtractive Hybridization, SSH ) , 获得辣椒 N 基
因介导的不亲和反应的早期抗性相关基因 , 构建 cDNA SSH 文库 , 从中筛选出 N 基因和抗性相关基
因 , 构建抗病相关基因表达谱。通过基因功能分类分析 , 初步了解根结线虫与寄主不亲和互作中涉及
基因的功能、种类及数量 , 推断早期不亲和互作分子机制。
1　材料与方法
111　线虫
接种线虫为南方根结线虫 (M eloidogyne incogn ita) 生理小种 1, 采用单卵块繁殖方式在温室栽培
的茄门甜椒 (Capsicum annuum L. ) 上进行扩繁。收集成熟卵块 , 在 28℃的无菌水中孵化 , 收集 2龄
幼虫 , 在 24 h内进行接种处理 , 线虫悬浮液浓度为 1 000条 ·mL - 1。
112　植物材料
辣椒 (Capsicum annuum L. ) 品种 Carolina Wonder含 N 基因 , 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所
辣椒组惠赠。种子催芽 2 d, 播种于苗钵中 , 在光照培养箱中 25℃、16 h光照、8 h黑暗条件下培养。
4片真叶期 , 每钵一株移栽到小花盆中 , 以灭菌的沙子草炭混合土 (沙子 ∶草炭 = 2∶1) 为培养介质 ,
培养温度调整为 (2115 ±015) ℃ ( Thies & Fery, 1998) , 在移栽 10 d后进行接种处理 , 用于进行消减
杂交。辣椒品种茄门 (Capsicum annuum L. ) 为感线虫品种 , 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所病害
组提供 , 培养方法同辣椒品种 Carolina Wonder, 用于根结线虫侵染对比观察和根结线虫的繁殖。
113　接种
在幼苗根际打约 1 cm深的小孔 , 将 1 mL 2龄线虫悬浮液接种于孔内 , 对照用无菌水做模拟接
种。分别设 12、24、36 h时间点取样 , 每个处理 10株 , 重复 3次。取样时将幼苗根际的砂土轻轻冲
掉 , 取 110～115 cm长的根尖 , 迅速放入液氮中冷冻 , - 80℃冰箱中保存。每个时间点随机取 5株 ,
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　3期 茆振川等 : 辣椒 N 基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的抑制性消减杂交 SSH分析 　
根尖采用酸性品红染色方法在显微镜下检测线虫的侵染率及症状 , 并与感病辣椒品种茄门进行对比观
察。
114　m RNA的分离及提取
取每一时间点的接种样品、未接种样品各 500 mg, 分别在液氮中研磨 , 并根据检测到的线虫侵染
率 , 在相应的对照样品中加入等量的同一批 2龄根结线虫共同研磨 , 以消除线虫本身表达 mRNA对
试验的干扰。
总 RNA 按照提取试剂盒 ( Invethigen公司 ) 方法提取。mRNA采用 O ligo2dT纤维素 ( Sigema公
司 ) 方法分离纯化。检测各时期 mRNA样品的浓度、纯度与完整性 , 将 mRNA 的终浓度调至约 015
μg·μL - 1 , 将 3个接种时间点样品的 mRNA等量混合。
115　SSH cD NA文库构建及筛选
抑制消减杂交 ( SSH) 具体操作依照 Clontech公司的 PCR SelectTM cDNA Subtraction Kit进行。取
Carolina Wonder试验样品的 mRNA, 以接种南方根结线虫的材料作为试验方 ( tester) , 以对照作为驱
动方 ( driver)。通过 cDNA双链合成 , Rsa I酶消化 , 试验方 cDNA片段两端连接特殊接头 , 通过两
次杂交和两次选择性 PCR扩增 , 富集差异表达基因片段。 SSH 产物按 Tiangen公司 PCR产物纯化试
剂盒方法纯化 , 与 pGM 2T载体 ( Tiangen公司 ) 连接 , 用热激法转化于 Top10 感受态细胞中 ( E.
coli) , 在氨苄青霉素平板上进行阳性克隆筛选。
阳性克隆筛选 : 挑取白斑菌落进行振荡过夜培养 , 按照碱裂解法分离纯化质粒。用巢式引物 1
(5′2TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT23′) 和巢式引物 2R ( 5′2AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT23′) 进行
PCR, 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 , PCR产物进行点阵膜杂交。
EST点阵列杂交膜制备 : 将 PCR产物 1μL (约 5 ng) 点到尼龙膜上 , 每张膜 (815 cm ×12 cm )
上 308个点 , 包括阴性对照 (2 ×SSC、空载体扩增产物 ) 和阳性对照 (第 2次消减 PCR产物 ) , 每张
点阵膜至少 2张。
筛选探针制备与杂交 : 分别取接种和未接种根结线虫 12、24、36 h的辣椒根尖 mRNA等量混合 ,
采用双链 cDNA合成试剂盒 ( Takara公司 ) 合成双链 cDNA, 纯化后用 R sa I内切酶 (Clontech公司 )
进行消化 , 分别用地高辛标记合成 cDNA片段探针 (Roshi公司 ) , 2个标记的探针分别与高密度点阵
膜杂交 , 杂交方法参照 Roshi公司地高辛核酸标记指示系统试剂盒进行 , 每个杂交反应重复 2次。
序列分析 : 点阵膜杂交后获得的阳性表达克隆 , 以 T7或 SP6为测序引物 , 在 AB I3730测序仪上
完成测序。产生的序列去除载体和接头序列后 , 用 BLASTn和 BLASTx软件在 GeneBank中进行同源比
对。采用 Gene Ontology方法 , 并参照南方根结线虫基因功能分类方法对所获得消减 EST进行功能分
类 (James et al. , 2003 )。
2　结果与分析
211　试验检测
对随机取出的接种根尖进行酸性品红染色 , 在显微镜下检测南方根结线虫的侵染率。在 12、24、
36 h时接种处理中每条根尖的线虫侵入平均数分别为 0、2012、3113。对处理和对照的 mRNA进行检
测 , R比值 (OD260 /OD280) 分别为 11833、11851, 浓度分别为 01666、01675μg·μL - 1 , 符合试验
对 mRNA的要求。
图 1为两轮正向消减 PCR产物凝胶检测结果 , 第 1轮扩增产物的循环数为 30, 第 2轮扩增产物
的循环数为 16。
图 2为消减文库中阳性克隆 PCR随机检测结果 , 可知获得片段主要集中于 300～700 bp范围内。
PCR检测共获得了阳性克隆 305个 , 其平均长度为 306 bp。
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图 1　正向消减结果检测
1, 2: 正向消减第 1、2轮 PCR扩增产物 ; 3, 4: 未消减
第 1、2轮 PCR扩增产物。
F ig. 1　Ana lysis of subtracted products after
pr imary and secondary PCR
1, 2: Primary and secondary PCR p roducts of subtracted
tester cDNA; 3, 4: Primary and secondary PCR p roducts
of unsubtracted tester cDNA. M: DNA marker.
图 2　消减文库中阳性克隆 PCR随机检测
1～10: 随机挑取克隆。
F ig. 2　PCR ana lysis of som e random ly p icked
clones from the subtracted library
1 - 10: Random ly p icked clones. M: DNA marker.
212　差示筛选 SSH cD NA文库结果
对获得的 PCR阳性克隆片段进行高密度点阵膜杂交筛选 , 通过两个标记探针的两次重复杂交 ,
两种点阵膜杂交斑点结果对比 , 克隆分为 4类 : ( a) 出现在 tester探针杂交膜上 , 而未出现 driver探
针杂交膜上的克隆 ; ( b) 在两种杂交膜上均出现杂交斑点 , 但杂交信号强度 tester高于 driver 2倍以
上的克隆 ; ( c) 出现在 driver探针杂交膜上 , 未出现 tester探针杂交膜上的克隆 ; ( d) 在 2种杂交探
针膜上均存在 , 且没有明显的信号强度差别的克隆。前两类 ( a、b) 说明获得基因片段只在处理中
表达或是处理中表达量明显高于对照 , 判断为阳性表达 , 进一步的进行测序分析 , 图 3为部分克隆片
段的杂交对比图。综合两次重复对比 , 共得到 237个阳性克隆 , 占全部克隆的 7718%。
图 3　消减文库的杂交筛选
左 : 正向 cDNA探针杂交 ; 右 : 反向 cDNA探针杂交 ; 1～10: 点阵膜列 ; A～H: 点阵膜行。
F ig. 3　D ifferen tia l screen ing for the subtracted library
Left: Hybridized with forward2subtracted cDNA p robes; R ight: Hybridized with reversed2subtracted cDNA p robes.
1 - 10: The clones order in column; A - H: The clones order in row.
213　SSH cD NA序列分析
对阳性 EST克隆提取质粒 , 选质粒提取效果好且大于 200 bp的片段进行测序 , 得到 148条序列 ,
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　3期 茆振川等 : 辣椒 N 基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的抑制性消减杂交 SSH分析 　
结果在 GenBank中进行 BLASTn和 BLASTx同源比较 , 共有 95条为已知的序列 , 占全部的 6412%。
BLASTx的比较结果中有 86条 76种 EST功能已知 , 占全部 EST的 5811% , 其中与抗病相关的基因为
75条 68种。表 1为消减文库中与防御、保护机制及转录相关的 EST对比结果。就获得的所有 EST片
段 BLAST对比来看 , 同源性最高的基因主要源于拟南芥 ( 2412% )、马铃薯 ( 1417% )、水稻
(914% ) , 辣椒中的只占 (814% )。
表 1　部分测序克隆的 BLAST结果
Table 1　Fea tures of som e sequenced clones and results of BLAST search
序列
Clone
长度
Length ( bp)
同源基因产物
BLAST
同源基因
Accession
期望值
Expect
来源
Source
防御相关 Defense
Ca229 255 过氧化氢酶 Catalase CAA59444 2e208 Cam pylobacter jejun i
Ca270 626 类 LRR抗性蛋白 LRR resistance p rotein2like p rotein ABG66965 9e218 Gossypium arboreum
Ca2120 375 蜜腺蛋白 Nectarin 5 (Nec5) BAE48250 1e219 Cannabis sa tiva
Ca2127 240 类病程相关蛋白 5 PR52like p rotein AAG34078 1e245 Capsicum annuum
Ca2178 232 NADPH细胞色素 P450还原酶 AAC09468 4e233 P isum sativum
NADPH2cytochrome P450 reductase
Ca2192 253 病程相关蛋白 10 PR10 CA I51309 1e230 Capsicum chinense
Ca2281 360 过氧化物酶 Peroxidase BAA01950 5e224 V igna angularis
Ca2286 327 依赖于铁氧化还原蛋白的谷氨酸酯合成酶 AAO45843 1e209 A rabidopsis tha liana
Ferredoxin2dependent glutamate synthase
Ca2372 545 蛇毒素肽 Snakin22 CAC44012 2e244 Solanum tuberosum
Ca2402 458 内几丁质酶 Endochitinase AAY90154 4e272 Capsicum annuum
Ca 2498 406 细胞色素 C氧化酶亚基 V Ia前体 NP_9098551 9e224 O ryza sativa
Putative cytochrome C oxidase subunit V Ia p recursor
Ca2507 623 Kunitz型蛋白酶抑制剂前体 AAZ94198 1e238 Solanum tuberosum
Kunitz2type p rotease inhibitor p recursor
Ca2583 375 类 HSR203J蛋白 HSR203J2like p rotein BAD11070 6e242 Capsicum chinense
Ca2605 639 类 GRP蛋白 GRP2like p rotein ABG75999 4e279 Gossypium hirsutum
Ca2630 267 辣椒酯酶 Pepper esterase AAF77578 4e219 Capsicum annuum
Ca2668 429 类伸展素蛋白 Extensin2like p rotein CAA06000 1e223 Solanum tuberosum
Ca2950 521 酯氧合酶 L ipoxygenase AAB67865 2e291 Solanum tuberosum
Ca21041 529 类萌芽素 Germ in2like p rotein XP_465765 4e222 O ryza sativa
Ca21290 433 生物胁迫相关蛋白 B iostress2resistance2related p rotein AAM29178 2e213 Triticum aestivum
Ca21367 646 抗性相关蛋白 Putative disease resistance p rotein BAD15107 5e212 N icotiana tabacum
保护机制 Protection
Ca2364 472 微染色体维持缺陷蛋白 XP_468275 7e239 O ryza sativa
M inichromosome maintenance deficient p rotein
Ca2682 597 推导的微染色体维持缺陷蛋白 XP_468275 9e237 O ryza sativa
Putative m inichromosome maintenance deficient p rotein
Ca2705 507 谷胱苷肽转移酶 14 Glutathione S2transferase GST 14 AAG34804. 1 2e215 Glycine m ax
Ca2897 590 小分子类泛素修复蛋白 Small ubiquitin2like modifier NP_200327 3e241 A rabidopsis tha liana
Ca21046 455 矮化因子 DWARF1 /D IM INUTO AAT90376 2e280 L. esculen tum
Ca21266 407 程序性死亡抑制因子 Bax inhibitor AAR28754 2e216 L. esculen tum
Ca21536 202 谷胱苷肽转移酶 1 Glutathione S2transferase GST1 AJ879121 2e247 Capsicum annuum
转录因子 Transcrip tor
Ca21369 434 lim 1转录因子 Transcrip tion factor lim 1 BAD91878 7e226 Eucalyptus globulus
Ca2418 208 类桶状蛋白 Tubby2like p rotein XP_4673711 8e222 O ryza sativa
Ca2457 257 HLH DNA绑定蛋白 Helix2loop2helix DNA2binding p rotein ABE93168. 1 3e223 M edicago truncatu la
Ca2ERF 365 乙烯转录因子 Ethylene2responsive element binding protein DQ412079 0. 0 Capsicum annuum
Ca2W RKY 307 WRKY2转录因子 DNA2binding p rotein 2 AAD16139 9e242 N icotiana tabacum
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将所得的 148条 EST序列进行拼接 , 共得到 130个 EST序列 , 在 W EGO网站上进行功能分类 ,
通过 Gene Ontology确定具体 EST的分子功能 (图 4)。由图 4可以看出 : 在生物途径中 , 与生理代谢
和细胞代谢相关的 EST最多 , 分别为 44和 41个 ; 其次是生物调控和刺激反应相关的 EST分别为 16
和 12个 , 涉及到生物分子互作的有 3个。在细胞组分功能分类中 , 与细胞和细胞器组成相关的 EST
最多分别为 49、39个 , 其次是内膜组分 (16) 和蛋白组分 (14)。在分子功能分类中 , 分子绑定及
催化功能相关的 EST数量最多分别为 30、28。通过 N 基因介导的早期抗线虫相关基因的功能分类可
以看出 , 在根结线虫侵染后寄主在细胞组份及生物代谢中发生了明显的变化 , 许多具有绑定功能和催
化功能的分子大量表达 , 使细胞进程、生理代谢和刺激反应加强 , 而这些基因的表达与抗性紧密相
关。
图 4　部分 SSH筛选 EST的功能分类分析
1: 细胞 ; 2: 细胞组分 ; 3: 包膜 ; 4: 细胞外基质 ; 5: 细胞外基质组分 ; 6: 细胞外区域 ; 7: 细胞外区域组分 ; 8: 附属膜内腔 ;
9: 细胞器 ; 10: 细胞器组分 ; 11: 蛋白复合体 ; 12: 绑定 ; 13: 催化 ; 14: 酶调控子 ; 15: 启动子 ; 16: 蛋白靶标 ;
17: 结构分子 ; 18: 转录调控子 ; 19: 翻译调控子 ; 20: 转运子 ; 21: 细胞过程 ; 22: 发育 ; 23: 生长 ; 24: 生物互作 ;
25: 生理学过程 ; 26: 色素沉着 ; 27: 生物过程调控 ; 28: 繁殖 ; 29: 刺激反应。
F ig. 4　The cla ssif ica tion ana lysis of som e EST function
1: Cell; 2: Cell part; 3: Envelope; 4: Extracellular matrix; 5: Extracellular matrix part; 6: Extracellular region; 7: Extracellular
region part; 8: Membrane2enclosed lumen; 9: O rganelle; 10: O rganelle part; 11: Protein comp lex; 12: B inding; 13: Catalytic;
14: Enzyme regulator; 15: Motor; 16: Protein tag; 17: Structural molecule; 18: Transcrip tion regulator; 19: Translation regulator;
20: Transporter; 21: Cellular p rocess; 22: Development; 23: Growth; 24: Interaction between organism s; 25: Physiological p rocess;
26: Pigmentation; 27: Regulation of biological p rocess; 28: Rep roduction; 29: Response to stimulus.
214　抗根结线虫相关基因表达
根结线虫在接种 12 h开始侵入辣椒根尖 , 在 24 h时就会有大量根结线虫侵入。在 N 基因辣椒根
尖中 , 接种线虫 24 h时就可以观察到被侵染的根尖出现变色反应 , 由白色变成浅黄褐色。通过酸性
品红染色 , 在显微镜下可以看到在线虫周围有许多被染成深红色的坏死细胞 , 并且以头部的周围细胞
出现较多 , 而周围正常的细胞呈现为无色或是浅红色 , 在 36 h时反应更加明显。在感病品种茄门接
种根结线虫 12 h以后也会有大量的线虫侵入 , 但根尖没有变色现象 , 也没有发现线虫周围有坏死细
胞。在试验中分离到过氧化物酶、HSR203J类蛋白、类萌芽素 ( GLP)、蜜腺蛋白、细胞程序性死亡
因子等均可对病原物胁迫产生过敏性反应 , 试验中同时筛选到病原物识别基因和过敏性反应基因 , 从
分子水平上说明在 N 基因介导的抗性中发生了过敏性坏死反应。由于辣椒品种 Carolina Wonder中含
有抗线虫的 N 基因 , 可以推断根结线虫侵入后发生了 N 基因介导的抗性反应 , 并且这一抗性反应与
过敏性坏死相关。
为进一步了解功能已知 EST所涉及的反应 , 对获得的早期抗线虫表达基因谱进行分析 , 可知 EST
为 : 抗病蛋白基因 ( 2 ) , 信号传导基因 ( 17 ) , 转录因子基因 ( 5 ) , HR 和 SAR 抗性相关基因
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　3期 茆振川等 : 辣椒 N 基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的抑制性消减杂交 SSH分析 　
(18) , 代谢相关基因、植保素相关基因 ( 2) , 细胞保护机制基因 (7) , 功能未知及其它蛋白基因
(70) 等。结合 W EGO分析结果 , 可以推断 N 基因介导的抗线虫机制包括对病原物的识别作用 , 抗
病信号的传递 , 转录因子的调控 , 防御相关基因的表达 , 次生代谢等一系列过程。
3　讨论
判断一个基因是否为抗线虫基因主要从两个方面进行考虑 : 第一 , 抗线虫基因通常在植物中是成
簇存在的 , 如 M i和 Cf2、Cf5、M eul; 第二 , 抗病基因的同源克隆已经被确定 , 如 M i、Grol、C re3等
均编码含有 NBS2LRR结构域的蛋白 , 它们都是抗线虫基因 (W illiam son & Hussey, 1996)。现在已经
克隆的抗线虫基因 M i、Gpa2、HS1pro1均属于具有 NBS2LRR结构的基因 (W illiam son, 1999)。M i为
来自于番茄 (L. escu len tum ) 的抗根结线虫基因 , 表现为过敏性坏死 , 具有热敏感性 (Hwang & W il2
liam son, 2003)。马铃薯 (Solanum tuberosum ) 的 Gpa2基因对马铃薯孢囊线虫 (Globodera pa llida) 具
有专化抗性 (Bakker et al. , 2003)。在试验材料辣椒中含抗线虫 N 基因 , 抗南方根结线虫、爪哇根结
线虫和花生根结线虫 , 具有温敏性 , 这些特性均与 M i基因相似。通过试验观察证实 N 基因介导早期
的过敏性抗性反应 , 这与 NBS2LRR所介导的 HR反应相一致。试验中分离到的 Ca21367和 Ca270两个
基因片段 , 其编码蛋白具有 NBS2LRR结构 , 均为抗病蛋白 , 特别是 Ca21367与 Gpa2具有 60%的氨
基酸序列同源性。结合 Ca21367克隆的基因结构及功能分析 , 与两个已克隆抗线虫基因 M i、Gpa2综
合对比 , 可推断 Ca21367为 N 基因片段或是与 N 基因直接相关 , 由于没有关于 N 基因染色体定位、
克隆的相关报道 , 所以 Ca21367克隆与 N 基因之间的关系有待于进一步确定。
试验中采用抑制性消减杂交结合高密度的点阵膜杂交相结合 , 有效的分离出线虫诱导的差异表达
抗性基因 , 试验是在 12～36 h进行取样 , 所以可以初步了解 N 基因介导的早期抗线虫相关基因的转
录水平差异。在试验中分离到的过氧化物酶、酯氧合酶、细胞程序性死亡因子等在抗线虫作用中均已
被证明 (Montes et al. , 2004) , 氧爆发是抗病反应的本质 (Hammond2Kosack & Jones, 1996)。在消减
文库中许多抗性相关基因均说明了寄主与根结线虫的分子不亲和互作 , 如纤维素合成酶、伸展蛋白等
促进细胞壁合成 , 微染色体维持缺陷蛋白、矮化因子等阻止染色体 DNA复制及巨型细胞形成 , 这些
与根结线虫的β21, 4内切葡聚糖酶、分支酸变位酶等酶的作用相反 ( Takei et al. , 2002) , 而正是这
些分子间的不亲和互作使寄主表达了抗性。分离到的病程相关蛋白、多肽抗生素 , 以及与次生代谢相
关的酶等 , 进一步说明根结线虫的侵入引发了系统的抗性表达。在试验中筛选到的许多抗性信号和转
录因子等均反映了 N 基因介导的不亲和互作具有复杂的调控体系。报道已经证实这些抗病信号大多
与水杨酸、茉莉酸以及乙烯等调控体系紧密相关 (Chen et al. , 2006; Park et al. , 2006)。另外 , 有些
是作用机制不明确的基因 , 如细胞程序性死亡抑制因子 (B I21) , 可以修复受损细胞 , 也可以抑制过
氧化氢 (H2O2 ) 和水杨酸 ( SA) 介导的细胞程序性死亡 ( Kawai et al. , 2004) , 因此基因 B I21的具
体作用仍需进一步的研究。
综合整个消减文库分析 , 可以看到 N 基因所介导的早期不亲和互作涉及对病原线虫的识别、信
号传递、转录调控、过敏性坏死、系统获得性抗性以及保护机制等多个方面。其中部分基因和前人报
道相一致 , 如分离到的过氧化物酶、几丁质酶、伸展蛋白、蛋白酶抑制剂、病程相关蛋白、乙烯转录
因子等 ( Zacheo et al. , 1993; W illiam son & Hussey, 1996; B renner et al. , 1998; Lambert et al. , 1999;
Jammes et al. , 2005; Mazarei et al. , 2007)。同样 , 在试验中还筛选到了许多在抗线虫作用中没有报道
的如 : 抗病蛋白、类抗病蛋白、细胞程序性死亡因子、微染色体缺陷蛋白、HSR203J类蛋白、蛇毒素
肽、类萌芽素等。特别是抗病蛋白基因 (Ca21367) , 它是在辣椒中得到的一个新的抗线虫基因片段 ,
而在试验中分离的许多功能未知的基因可能是一些新的与抗线虫相关的基因。
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
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