全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 609 - 614
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 03 - 20; 修回日期 : 2007 - 05 - 283 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: liuyongli@zju1edu1cn)
余甘子下胚轴离体再生体系的优化
胡海涛 1, 2 , 高　月 1 , 兰大伟 1, 3 , 刘永立 13
(1 浙江大学农业与生物技术学院 , 杭州 310029; 2 浙江师范大学化学与生命科学学院 , 浙江金华 321004; 3 浙江工商
大学统计与数学学院 , 杭州 310018)
摘 　要 : 以余甘子 ( Phyllanthus em blica L. ) 下胚轴为外植体 , 通过器官发生途径诱导形成不定芽 , 探
讨影响下胚轴器官发生和植株再生的因素 , 建立了下胚轴高效再生体系。结果表明 : 附加 AgNO3 1 mg·L - 1
和蔗糖 40 g·L - 1的 1 /2 MS培养基最适合不定芽的分化 ; 下胚轴不同部位不定芽再生能力由强到弱表现为 :
形态学上部 >中部 >下部 ; 前期暗培养有利于下胚轴不定芽的形成 , 暗处理 14 d效果最好。通过以上优化
措施可以使不定芽再生率达 100% , 平均每外植体不定芽数 1117个。不定芽较适生根培养基为胺鲜酯
(DA26) 3 mg·L - 1 +复硝酚钠 (CSN) 3 mg·L - 1 , 生根率达到 6218%。
关键词 : 余甘子 ; 愈伤组织 ; 植物生长调节剂 ; 下胚轴 ; 不定芽再生
中图分类号 : S 667　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320609206
The Establishm en t and O ptim iza tion of a H ighly Eff ic ien t System of Shoot
Regenera tion from Hypocotyl Explan ts of Phyllan thus em blica L.
HU Hai2tao1, 2 , GAO Yue1 , LAN Da2wei1, 3 , and L IU Yong2li13
(1 College of A gricu lture and B iotechnology, Zhejiang U niversity, Hangzhou 310029, Ch ina; 2 College of Chem istry and L ife Sci2
ence, Zhejiang N orm al U niversity, J inhua, Zhejiang 321004, Ch ina; 3 College of M athem atics and S ta tistics, Zhejiang Industry
and Comm erce U niversity, Hangzhou 310018, China)
Abstract: An efficient p lant regeneration p rotocol for Phyllan thus em blica L. was achieved via organo2
genesis from callus tissues formed on hypocotyl exp lants in vitro. In this paper, several factors affecting in vitro
regeneration of Phy llan thus em blica L. were exam ined. The op timum medium for shoot regeneration was 1 /2
MS medium containing 011μmol·L - 1 NAA , 5μmol·L - 1 BA, 40 g·L - 1 sucrose, 1 mg·L - 1 AgNO3. The
op timum exp lants were upper segments of hypocotyl of 282day2old seedlings. Under 14 d dark treatment,
100% of adventitious shoot regeneration frequency with 1117 shoots per exp lant was obtained. Excised shoots
rooted when they were transferred to 1 /2MS medium containing 3 mg·L - 1 22 ( diethylam ino) ethyl ester cit2
rate (DA26) + 3 mg·L - 1 compound sodium nitrophenolate ( CSN ) after 35 days and developed into
healthy p lantlets, which resulted in a rooting rate of 6218%. The results of this study will facilitate the app li2
cation of genetic transformation methods in Phy llan thus em blica L.
Key words: Phyllan thus em blica L. ; Callus; Plant growth regulator; Hypocotyl; Shoot regeneration
余甘子 ( Phy llan thus em blica L. ) 系大戟科 ( Euphorbiaceae) 叶下珠属 ( Phy llan thus) 植物 ,
是一种原产于亚洲热带、亚热带地区的野生果树 , 具有极高的营养价值和药用价值。余甘子富含
维生素、氨基酸、有机酸、矿物元素等营养成分 , 又含有黄酮、生物碱等药用成分 (陈智毅 等 ,
2004)。
我国具有丰富的余甘子资源 , 但大多数还处在野生或半野生状态 , 适合园艺化栽培的品种还很
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
少 , 所以余甘子的品种改良对其大面积推广种植至关重要。
由于余甘子遗传背景较复杂 , 许多园艺性状的遗传规律尚不清楚 , 使常规育种受到了很大的限
制。植物基因工程技术在果树上的应用 , 为余甘子品种改良提供了新的途径。在通过基因工程对品种
改良时 , 建立高效的离体再生体系是关键。目前有关余甘子组织培养方面的研究已有少量报道
(Rahman et al. , 1999; 张守英 等 , 2002a, 2002b; 胡海涛 等 , 2006) , 但都存在再生效果不理想 ,
再生芽生根比较困难等问题。
作者以云南的一种野生余甘子为试材 , 研究了几种影响其下胚轴器官形成和植株再生的因素 , 以
期建立余甘子高效再生体系 , 为今后通过基因工程改良性状提供参考。
1　材料与方法
111　材料
余甘子材料为云南的一个野生种 , 其种子由中国林业科学院亚热带林业研究所姚小华研究员赠
送。以暗培养 28 d的无菌苗下胚轴为试材 , 切取长约 015 cm接种于培养基中。
112　方法
11211　培养基筛选　选 BW、MS、1 /2MS、W PM、B5为基本培养基 , 附加 NAA 011μmol·L - 1、BA
5μmol·L - 1、琼脂粉 7 g·L - 1、蔗糖 30 g·L - 1 , 用 011 mol·L - 1的 HCl或 NaOH调 pH值至 518,
121℃高压 (112 kg·cm - 2 ) 灭菌 20 m in。
灭菌后的培养基分装到直径 9 cm的无菌培养皿中 , 每培养皿 25 mL。
接种外植体后将培养皿置于温度 ( 25 ±2) ℃, 光照强度 3 000 lx, 光照时间 16 h·d - 1条件下
培养。
每培养皿接种 6个外植体 , 每处理 4个皿。35 d后统计每个处理再生不定芽数 (以肉眼能够看
到的独立不定芽为标准 )、每个外植体再生的芽数和生根株数 , 计算不定芽再生率、每个外植体平均
再生芽数 , 确定再生的最适培养基。
11212　下胚轴部位对不定芽再生的影响 　将萌发种子的下胚轴切成上、中、下 3部分 , 然后每部分
都切成 015 cm的小段 , 接种于 1 /2MS + BA 5μmol·L - 1 + NAA 011μmol·L - 1的培养基上 , 蔗糖 30
g·L - 1 , 琼脂粉 7 g·L - 1 , 培养条件同上。
11213　蔗糖浓度对不定芽再生的影响 　蔗糖浓度设置 5个处理 : 10、20、30、40、50 g·L - 1 , 以下
胚轴的上部为外植体 , 基本培养基与培养条件同 11212。
11214　AgNO3对不定芽再生的影响 　AgNO3浓度设置 7个处理 : 0、1、2、5、10、15、20 mg·L - 1 ,
试验材料、基本培养基与培养条件同 11213。
11215　暗处理对余甘子下胚轴不定芽形成的影响 　暗处理时间设置为 7、14、21、28 d, 其他同
上。
11216　不定芽的生根 　用再生不定芽进行生根试验。在诱导生根前 , 先转到不添加任何植物生长
调节剂的 1 /2M S培养基中培养 21 d, 目的是使不定芽伸长生长 , 同时减少不定芽诱导试验中植物
生长调节剂对生根的影响。
切下长 115 cm以上的独立不定芽接种在 1 /2M S生根培养基上附加 DA 26 /CSN ( 1、3、5、10
mg·L - 1 ) 及蔗糖 30 g·L - 1和琼脂粉 7 g·L - 1。以空白培养基作为对照。每个生根处理包含 24个
外植体。
35 d后统计生根情况 , 记录每个外植体的生根数 , 计算生根率。
113　试验数据的记录与处理
在每次进行数据记录的同时记录外植体的生长状态及愈伤组织的形态等。不定芽再生率 ( % ) =
016
　3期 胡海涛等 : 余甘子下胚轴离体再生体系的优化 　
(再生不定芽外植体数 /接种外植体数 ) ×100; 平均再生不定芽数 =再生不定芽总数 /能再生的外植
体数。
邓肯氏新复极差法进行数据差异显著性测验。
2　结果与分析
211　培养基种类对余甘子下胚轴不定芽形成的
影响
从表 1可以看出 , BW、MS、1 /2MS、W PM、
B5等 5种不同基本培养基对余甘子下胚轴愈伤组
织形成率影响不大 , 但对不定芽的形成影响较显
著。
不定芽再生频率以 1 /2MS效果最佳 , 这可能
与 NH4 + /NO3 - 盐浓度有关。Fasolo等 (1989) 的
研究表明 : 降低 NH4 + /NO3 - 的浓度有利于提高
木本植物的不定芽再生频率 ( 1 /2MS的 NH4 + /
NO3
- 浓度为 MS的一半 , 其他不变 )。
表 1中显示基本培养基不仅影响不定芽形成
表 1　培养基种类对余甘子下胚轴外植体不定芽再生的影响
Table 1　Effect of m ed ium form ula tion on shoot forma tion from
hypocotyl of P. em blica L. after 35 days of culture
培养基种类
Medium
formulation
外植体数
Number of
exp lantstested
不定芽形成率
Shoots formation
rate ( % )
平均不定芽数
Number of shoots
per exp lant
BW 24 7912 3183 b
MS 24 8313 7104 a
1 /2MS 24 8715 8191 a
W PM 24 2510 3133 b
B5 24 3313 2175 b
　　注 : 表中相同字母表示经邓肯氏新复极差法检测无显著差异
( P = 0105)。
Note: The same letters indicate insignificantly at P = 0105 by
Duncanpis new multip le range test.
率而且影响每个外植体再生不定芽的个数。最高
的平均每个外植体再生芽数 ( 8191个 /外植体 )
也发生在 1 /2MS培养基上 , 说明 1 /2MS为余甘子
下胚轴不定芽诱导的较适培养基。
212　下胚轴部位对不定芽再生的影响
余甘子下胚轴不同部位的不定芽再生能力差
异显著 , 下胚轴的形态学上部切段再生能力较强 ,
每外植体分化不定芽数较多 , 其次为中部切段 ,
下部切段再生能力较差 (表 2)。下胚轴外植体不
同部位分化能力的差异可能是下胚轴的极性生长
造成的。
表 2　下胚轴切段来源对不定芽再生的影响
Table 2　Effects of seedling age on shoot regenera tion
from hypocotyl explan ts of P. em blica L.
下胚轴部位
Position of
hypocotyl
外植体数
Number of
exp lants tested
不定芽形成率
Shoots formation
rate ( % )
平均不定芽数
Number of shoots
per exp lant
上 Upper 24 9117 1017 a
中 M iddle 24 8313 818 ab
下 Lower 24 7912 715 b
　　注 : 表中相同字母表示经邓肯氏新复极差法检测无显著差异
( P = 0105)。
Note: The same letters indicate insignificantly at P = 0105 by
Duncanpis new multip le range test.
213　蔗糖浓度对余甘子下胚轴不定芽形成的影响
蔗糖浓度对余甘子下胚轴离体不定芽形成有
明显的影响 (表 3)。当蔗糖浓度达到 40 g·L - 1
时 , 不定芽再生率和平均芽数达到最大 , 分别
为 100%和 7150个。10 g·L - 1蔗糖处理中产生
的芽生长缓慢 , 很难伸长 , 这可能与后期生长
过程中碳源不足有关 , 而较高浓度的蔗糖 ( ≥
50 g·L - 1 ) 处理造成渗透势提高 , 也不利于不
定芽的形成。
214　AgNO3浓度对余甘子下胚轴不定芽形成的
影响
从表 4可以看出 , 适宜浓度的 AgNO3对余甘
表 3　蔗糖浓度对余甘子下胚轴外植体不定芽再生的影响
Table 3　Effect of d ifferen t concen tra tion s of sucrose on
shoot forma tion from hypocotyl of P. em blica L.
after 35 days of culture
蔗糖浓度
Concentration of
sucrose (g·L - 1 )
外植体数
Number of
exp lants tested
不定芽形成率
Shoots formation
rate ( % )
平均不定芽数
Number of shoots
per exp lant
10 24 2912 0125 d
20 24 6215 4125 c
30 24 8313 7125 ab
40 24 100 7150 a
50 24 9518 5125 bc
　　注 : 表中相同字母表示经邓肯氏新复极差法检测无显著差异
( P = 0105)。
Note: The same letters indicate insignificantly at P = 0105 by
Duncanpis new multip le range test.
116
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
子下胚轴离体不定芽形成有明显促进作用。
1 mg·L - 1 AgNO3处理 35 d后不定芽再生率
和平均芽数分别是 100%和 10150个。但随着
AgNO3浓度的增加不定芽再生率和平均芽数都降
低。
Radke等 (1992) 报道 , 分化培养基中添加
AgNO3可以促进芽原基的产生和伸长。
在本试验中也发现类似的结果 , 与对照相比 ,
附加有 AgNO3的培养基上诱导的愈伤组织及分化
的不定芽呈浓绿色 , 再生不定芽健壮 , 不定芽伸
长较长 (图版 , A～C) , 而对照中分化的再生芽
呈褐色 , 不定芽伸长较短。
表 4　AgNO 3浓度对余甘子下胚轴外植体不定芽再生的影响
Table 4　Effect of AgNO 3 concen tra tion s on shoot forma tion
from hypocotyl of P. em blica L. after 35 days of culture
硝酸银浓度
Concentration of
AgNO3 (mg·L - 1 )
外植体数
Number of
exp lants tested
不定芽形成率
Shoots formation
rate ( % )
平均不定芽数
Number of shoots
per exp lant
0 24 8313 7104 b
1 24 100 10150 a
2 24 8715 7129 b
5 24 7912 5133 bc
10 24 7510 3179 cd
15 24 7018 2133 d
20 24 6215 2171 d
　　注 : 表中相同字母表示经邓肯氏新复极差法检测无显著差异
( P = 0105)。
Note: The same letters indicate insignificantly at P = 0105 by
Duncanpis new multip le range test.
215　暗处理对余甘子下胚轴不定芽形成的影响
试验结果 (表 5) 表明 , 暗培养有利于愈伤
组织的生长 , 而对愈伤组织形成率 (均为 100% )
没有影响。
但在暗培养过程中没有一个外植体形成不定
芽。当暗处理结束转到光下 2～3 d内 , 愈伤组织
颜色变深接近对照。
7、14、21、28 d暗培养处理 , 不定芽在转到
光下一周内迅速形成。
暗培养 14 d效果最好 , 35 d后不定芽形成率
达 100% , 平均芽数为 1117个。
216　胺鲜酯 ( DA26) 和复硝酚钠 ( CSN) 对再
生不定芽生根的影响
从表 6中可以看出 , DA 26和 CSN对余甘子
再生不定芽的生根有很大的促进作用 , 尤其是
在 DA 26和 CSN联用时 , 余甘子的生根率大大提
高。
最佳组合为 DA 26 3 mg·L - 1 + CSN 3 mg·
L - 1 , 最大生根率为 6218% , 而且 DA 26 /CSN诱
导形成的不定根是直接从不定芽基部的形成层
长出的 (图版 , D )。
3　讨论
下胚轴的不同部位对不定芽再生有重要的影
响。在诱导植物离体不定芽再生中 , 极性现象普
遍存在 ( Yang et al. , 1992; 尚爱芹 等 , 2005;
朱丽华 等 , 2005)。我们在诱导余甘子下胚轴不
定芽分化时 , 也看到明显的极性现象 ———下胚轴
表 5　暗处理对余甘子下胚轴不定芽再生的影响
Table 5　Effect of dark trea tm en ts on shoots forma tion
from hypocotyl of P. em blica L.
暗培养时间
Time of dark
treatment( d)
外植体数
Number of
exp lants tested
不定芽形成率
Shoots formation
rate ( % )
平均不定芽数
Number of shoots
per exp lant
0 24 100 917 b
7 24 100 817 bc
14 24 100 1117 a
21 24 9117 719 bc
28 24 7912 518 c
　　注 : 表中相同字母表示经邓肯氏新复极差法检测无显著差异
( P = 0105)。
Note: The same letters indicate insignificantly at P = 0105 by
Duncanpis new multip le range test.
表 6　胺鲜酯 ( DA26) 和复硝酚钠 ( CSN) 对余甘子再生
不定芽生根的影响
Table 6　Effect of d ifferen t concen tra tion s of 22( d iethylam ino)
ethyl ester c itra te ( DA26) and com pound sod ium n itrophenola te
( CSN) on rooting of in vitro regenera ted shoots of P. em blica L.
植物生长调节物质
Growth regulator (mg·L - 1 )
DA26 CSN 外植体数量Number ofexp lants tested 生根率Rooting rate( % )
0 0 24 0
1 0 24 4218
3 0 24 5115
5 0 24 3712
10 0 24 3514
3 1 24 5014
3 3 24 6218
3 5 24 5718
3 10 24 3912
　　注 : 表中相同字母表示经邓肯氏新复极差法检测无显著差异
( P = 0105)。
Note: The same letters indicate insignificantly at P = 0105 by
Duncanpis new multip le range test.
216
　3期 胡海涛等 : 余甘子下胚轴离体再生体系的优化 　
的形态学上部切段不定芽再生能力强 , 而中部和下部再生能力较弱。
目前的研究普遍认为植物生长调节物质的极性运输导致这种现象发生 ( Yang et al. , 1992; 尚爱
芹 等 , 2005; 朱丽华 等 , 2005)。由于生长素的极性运输 , 使合成的生长素从顶芽向远端极性运输 ,
使生长素在远端积累 , 因此下胚轴靠近顶芽的一端比远离顶芽的一端内源生长素含量要低 , 而外源生
长素和细胞分裂素的含量在整个外植体中的分布基本一致 , 所以靠近顶芽的一端分裂素与生长素之比
高于远离顶芽的一端 , 从而导致了下胚轴在靠近顶芽的一端先发生不定芽且不定芽发生的数量较多。
大量研究表明 , 在分化培养基中加入适当浓度的 AgNO3 , 可以显著地促进不定芽分化和提高植株
再生率 (Chi et al. , 1989; Khalid et al. , 1991; Pua et al. , 1993 )。本研究表明 , 适宜浓度的 AgNO3
能够提高余甘子下胚轴的分化频率和平均每外植体再生不定芽数。有关 AgNO3促进不定芽发生的作用
机理尚未完全清楚。目前的研究认为 , 植物细胞和组织在离体培养过程中容易产生乙烯 , 乙烯对细胞
生长发育有毒害作用。Ag+是一种乙烯抑制剂 , 能竞争性作用于乙烯作用部位从而促进器官发生 (张
鹏 等 , 1997)。另外的研究则认为 , AgNO3和另一种物质多胺有着密切关系 , AgNO3不是直接作用于
乙烯的作用位点 , 而是抑制乙烯的合成 , 促进多胺的合成 , 从而达到促进体细胞胚形成和器官发生的
效果 ( Feirer et al. , 1984)。而 Roustan等 (1990) 的研究认为 , AgNO3并非抑制乙烯的合成 , 而是由
于 Ag+的存在 , 乙烯不能干扰多胺的合成 , 因此多胺合成酶的活性提高 , 促进多胺的合成 , 提高了离
体器官形成频率。
在余甘子再生不定芽诱导生根的预备试验中 , 发现 NAA处理的幼苗在基部只形成大量的愈伤组
织 , 无不定根的分化 , IBA处理的幼苗基部也形成大量的愈伤组织 , 在愈伤组织表面分化形成一些不
定根 , 生根率很低。从愈伤组织长出的根与组培苗的主茎维管束联系不紧密且易脱落。而 CSN 和
DA26两者对余甘子离体不定芽生根有很强的促进作用 , DA26 /CSN诱导形成的根是直接从嫩枝的基
部长出来的。CSN是一种新型植物生长调节物质 , 可以高度地赋予细胞活性 , 与植物接触后能迅速渗
透到植物体内 , 增强植株活力 , 加快植物生根速度 , 对植物营养生长和生殖生长有促进作用。DA26
也是一种新型的植物生长调节物质 , 它可以调节植物体内的生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯等的活性
和合理的配比平衡。两者都具有促使植物体生根作用。据我们了解 , 本试验是第一次把这两种植物生
长调节物质运用到组织培养领域 , 并取得了比较好的效果。
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朱丽华 , 张彩琴 , 盛小光 , 朱月林. 2005. 大白菜下胚轴离体不定芽高效再生体系的研究. 武汉植物学研究 , 23 (5) : 427 - 431.
图版说明 : A. 在附加 1 mg·L - 1 AgNO3和 40 g·L - 1蔗糖的 1 /2MS培养基上 , 培养 21 d后下胚轴外植体切口处形成大量的愈伤组织
和不定芽 (如箭头所示 ) ; B. 在附加 1 mg·L - 1 AgNO3和 40 g·L - 1蔗糖的 1 /2MS培养基上 , 培养 35 d后下胚轴外植体分化出大量
的不定芽 ; C. 分化的不定芽继代增殖培养 ; D. 在附加 3 mg·L - 1 DA26、3 mg·L - 1 CSN的 1 /2MS培养基上 , 培养 35 d后形成的根
(如箭头所示 )。
Explana tion of pla tes: A1Shoots and calli induced from hypocotyl exp lants after 21 days of culture on 1 /2MS medium with 1 mg·L - 1 AgNO3
and 40 g·L - 1 sucrose ( arrow) ; B1Multip le shoots formation from hypocotyl exp lants after 35 days of culture on 1 /2MS medium with 1 mg·L - 1
AgNO3 and 40 g·L - 1 sucrose; C1Elongated shoots in the elongation medium; D1Rooting of regenerated shoots on 1 /2MS medium with 3 mg·
L - 1 DA26, 3 mg·L - 1 CSN after 35 days of culture ( arrow).
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